Ultrasoon ondersteunde dunnefilmhydratatie voor de bereiding van liposomen

Liposomen zijn bolvormige vesikels die bestaan uit een of meer fosfolipidendubbellagen die een waterige kern omsluiten. Dankzij hun vermogen om hydrofiele, lipofiele en amfifiele verbindingen in te kapselen, worden liposomen veel gebruikt in farmaceutische, nutraceutische, cosmetische en voedingsmiddelentoepassingen. Hun biologische afbreekbaarheid, biocompatibiliteit en niet-immunogene karakter maken ze tot bijzonder aantrekkelijke afgiftesystemen.
Van de verschillende methoden voor de productie van liposomen blijft dunnefilmhydratatie (TFH) een van de meest gevestigde en veelzijdige technieken. In combinatie met gecontroleerde sonicatie maakt deze methode de productie mogelijk van liposomen op nanoschaal met verbeterde homogeniteit, inkapselingsefficiëntie en stabiliteit.

De rol van ultrageluid bij dunnefilmhydratatie

Dunnefilmhydratatie levert aanvankelijk voornamelijk multilamellaire vesikels (MLV’s) op met relatief grote diameters en brede grootteverdelingen. Door hun grootte vertonen deze vesikels een beperkte cellulaire opname en een verminderde biologische beschikbaarheid, vooral bij toepassingen die efficiënte membraaninteractie of weefselpenetratie vereisen. Daarom wordt sonicatie met een sonde toegepast als een gecontroleerde stap voor grootteverkleining om MLV’s om te zetten in kleine unilamellaire liposomen of liposomen op nanoschaal met een smallere polydispersiteitsindex. Ultrasoon verkleinde nanoliposomen bieden een aanzienlijk hogere verhouding tussen oppervlakte en volume, verbeterde colloïdale stabiliteit en verhoogde cellulaire internalisatie, wat resulteert in superieure biologische beschikbaarheid en afgifteprestaties.

1. Werkingsmechanisme
   Ultrageluid met hoge intensiteit genereert akoestische cavitatie – de vorming en implosie van microscopische bellen – waardoor lokale afschuifkrachten, microstromingen en kortstondige hoge drukgradiënten ontstaan.

   Deze effecten leiden tot:

   • Het uiteenvallen van grote multilamellaire vesikels
   • Fragmentatie en reorganisatie van de dubbellaag
   • Vorming van kleine unilamellaire vesikels (SUV’s)
   • Smallere deeltjesgrootteverdeling

   In nanoliposomale systemen die worden bereid via dunnefilmvorming + ultrasone dispersie worden betrouwbaar gemiddelde deeltjesdiameters rond ~80 nm met een lage polydispersiteit bereikt.

2. Procesvoordelen
   Ultrasoon ondersteunde TFH biedt:
   • Kleinere deeltjesgrootte (nanometerbereik)
   • Lagere polydispersiteitsindex (PDI)
   • Verhoogde inkapselingsefficiëntie
   • Verbeterde colloïdale stabiliteit
   • Verbeterde thermische en oxidatieve stabiliteit van ingekapselde verbindingen

   Deze verbeteringen zijn cruciaal voor de stabilisatie van oxidatiegevoelige bioactieve stoffen, zoals meervoudig onverzadigde vetzuren.

Na de vorming van een lipidenfilm en de daaropvolgende rehydratatie wordt sonicatie gebruikt om de insluiting van werkzame stoffen in de liposomen te bevorderen. Daarnaast wordt met sonicatie de gewenste liposoomgrootte bereikt.

Algemene instructie: bereiding van liposomen via ultrasoon ondersteunde dunnefilmhydratatie

1. Materialen en formulering
   1. Selecteer een fosfolipide (bijv. lecithine / fosfatidylcholine) en eventueel cholesterol.
   2. Kies de lipidenverhouding op basis van de vereiste stabiliteit.

   Een lecithine/cholesterolverhouding van ongeveer 40:20 leverde in een voedingsmiddelengerelateerd systeem stabiele nanoliposomen op met een hoge zetapotentiaal en een lage PDI.

2. Oplossen van lipiden (organische fase)
   1. Los fosfolipide + cholesterol op in een vluchtig organisch oplosmiddel (bijv. chloroform).
   2. Als functionele additieven een co-oplosmiddel vereisen, los ze dan afzonderlijk op (bijv. in methanol) en voeg de oplossingen samen.

   Deze aanpak wordt expliciet beschreven voor liposomen die via dunnefilmhydratatie worden bereid met chloroform (lipiden) en methanol (additief).

3. Vorming van een dunne film
   1. Breng de lipidenoplossing over in een rondbodemkolf.
   2. Verwijder de oplosmiddelen met een rotatieverdamper bij een matige temperatuur (bijv. 40 °C) onder verlaagde druk totdat een droge, homogene film ontstaat.
4. Hydratatie van de lipidenfilm
   1. Hydrateer de lipidenfilm met een waterige fase die de werkzame stof bevat (of met buffer bij de productie van lege liposomen).
   2. Hydrateer onder roeren en bij verhoogde temperatuur (indien nodig boven de faseovergangstemperatuur van de lipiden).

   Voorbeeld uit een biomedische formulering: hydratatie met HEPES-buffer (pH 7,4) en roeren bij 60°C gedurende 6 h.

5. Ultrasone grootteverkleining
   Na hydratatie bevat de dispersie doorgaans multilamellaire vesikels en moet de grootte daarvan worden verkleind.

   Algemene aanbevelingen voor de sonicatiestap:

   • Gebruik ultrasone behandeling met een sonde.
   • Pas gepulseerde sonicatie toe om de temperatuur te regelen.
   • Houd het monster in een ijsbad of gebruik externe koeling.

   Voorbeeld van een sonicatieprotocol met de Hielscher sonicator UP200Ht:
   15 min in totaal, 10 s AAN / 5 s UIT, 100 W, 100% amplitude. (vgl. Truszkowska et al., 2025 en Ahmadi et al, 2021)

6. Optionele nabewerking
   Afhankelijk van de toepassing:
   • Verwijder de niet-ingekapselde verbinding door centrifugatie/filtratie.
   • Was en resuspendeer in verse buffer.

   Voorbeeld: voor de zuivering van liposomen wordt de verwijdering van ongebonden materiaal door centrifugatie en resuspensie beschreven.

7. Karakterisering
   De bijgevoegde studies beschouwen de volgende parameters consequent als essentiële kwaliteitsmaatstaven:
   • Deeltjesgrootte (nm)
   • Polydispersiteitsindex (PDI)
   • Zetapotentiaal
   • Inkapselingsefficiëntie
   • Morfologie (TEM/SEM)
   • Stabiliteit tijdens opslag

   Voorbeeldresultaten die een goede kwaliteit van nanoliposomen aantonen, zijn:
   Grootte ≈82 nm, PDI ≈0,06, zetapotentiaal ≈−56 mV, inkapselingsefficiëntie ≈76,5%.

   Praktische opmerkingen
   Cholesterol verbetert de stabiliteit. De studies geven expliciet aan dat de toevoeging van cholesterol de stabiliteit van liposomen kan verbeteren door de faseovergang van fosfolipiden te remmen.

Voordelen van Hielscher ultrasone systemen voor de productie van liposomen

Hielscher Ultrasonics biedt geavanceerde ultrasone processoren die specifiek zijn ontworpen voor de productie van liposomen op laboratoriumschaal, pilotschaal en volledige industriële schaal. Deze systemen zijn bijzonder geschikt voor ultrasoon ondersteunde dunnefilmhydratatie, waarbij nauwkeurige regeling van de akoestische energie cruciaal is om een gedefinieerde deeltjesgrootte, een smalle grootteverdeling en een reproduceerbare productkwaliteit te bereiken.
Op laboratoriumschaal bieden Hielscher sonicators nauwkeurige amplituderegeling, reproduceerbare energietoevoer, programmeerbare pulswerking en geïntegreerde temperatuurbewaking. Dit niveau van controle zorgt voor een consistente cavitatie-intensiteit en een zeer reproduceerbare grootte van nanoliposomen, met een uitstekende uniformiteit tussen batches. Een dergelijke processtabiliteit is essentieel tijdens de ontwikkeling van formuleringen, vooral bij het optimaliseren van belangrijke parameters zoals sonicatietijd, akoestisch vermogen, lipidensamenstelling en inkapselingsefficiëntie.

Industriële productie van liposomen

Voor industriële productie zijn Hielscher systemen ontworpen voor lineaire schaalbaarheid, waardoor procesparameters die op laboratoriumschaal zijn vastgesteld, kunnen worden overgedragen naar pilot- en productie-eenheden met behoud van een gelijkwaardige energiedichtheid en procesomstandigheden. Ultrasone reactoren met continue doorstroming maken de productie van liposomen met een hoge verwerkingscapaciteit mogelijk, met een uniforme energieverdeling en kortere verwerkingstijden. De systemen zijn gebouwd voor robuust bedrijf, 24/7, met een hoge energie-efficiëntie en weinig onderhoud. Bovendien kunnen ze worden geïntegreerd in GMP-conforme productieomgevingen, waaronder systemen met een gesloten kringloop, geautomatiseerde proceslijnen en cleanroominstallaties. Deze kenmerken maken Hielscher ultrasone technologie geschikt voor de productie van farmaceutische en nutraceutische liposomen en liposomen van voedingsmiddelenkwaliteit op industriële schaal.

Ultrasoon ondersteunde dunnefilmhydratatie is een zeer efficiënte, controleerbare en schaalbare methode voor de productie van nanoliposomen. Wetenschappelijk bewijs toont aan dat de combinatie van TFH met ultrageluid de deeltjesgrootteverdeling, inkapselingsefficiëntie en stabiliteit van gevoelige bioactieve verbindingen aanzienlijk verbetert.
Hielscher sonicators bieden:

• Nauwkeurige energieregeling
• Reproduceerbare resultaten op nanoschaal
• Naadloze opschaling van laboratorium naar industriële productie
• Mogelijkheid tot continue verwerking
• Robuuste en GMP-compatibele werking

Voor onderzoekslaboratoria die geavanceerde liposomale formuleringen ontwikkelen en voor industriële fabrikanten die hoogwaardige farmaceutische of nutraceutische producten produceren, bieden Hielscher ultrasone systemen een technisch superieure en economisch schaalbare oplossing voor de bereiding van liposomen via ultrasoon ondersteunde dunnefilmhydratatie.

De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasone apparaten:

Vergelijking met andere ultrasoon ondersteunde methoden voor liposomen

Hoewel dunnefilmhydratatie veel wordt gebruikt – vooral in laboratoria en bij R&D – verbetert ultrageluid ook verschillende andere methoden voor de bereiding van liposomen:

• Omgekeerde-faseverdamping – Ultrageluid verbetert de emulgering en vesikelvorming.
• Ethanolinjectiemethoden – Sonicatie verfijnt de deeltjesgrootte en vermindert aggregatie.
• Directe dispersie van lecithine – Ultrageluid maakt snelle vorming van liposomen uit fosfolipidensuspensies mogelijk.
• Sonoporatie van vooraf gevormde liposomen – Akoestische energie verhoogt tijdelijk de membraanpermeabiliteit voor actieve belading.
• Grootteverkleining na vorming – Sonicatie wordt routinematig toegepast om multilamellaire vesikels te verkleinen tot systemen op nanoschaal.

Ultrageluid is dus niet slechts een ondersteunende stap, maar een centrale technologie die verschillende strategieën voor de productie van liposomen mogelijk maakt.

Ontwerp, productie en advies – sonicators gemaakt in Duitsland

Hielscher ultrasone apparaten worden algemeen erkend om hun hoge kwaliteit, robuuste constructie en geavanceerde ontwerpnormen. Hun duurzaamheid en gebruiksvriendelijke bediening maken een soepele integratie in industriële productiefaciliteiten mogelijk. Zelfs onder zware bedrijfsomstandigheden en in veeleisende omgevingen leveren Hielscher ultrasone apparaten betrouwbare prestaties en consistente resultaten.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt sterk de nadruk op de productie van ultrasone systemen met hoge prestaties die de nieuwste technologie combineren met praktische bruikbaarheid. Alle Hielscher ultrasone apparaten zijn CE-conform en voldoen bovendien aan de eisen van UL, CSA en RoHS.