Ultrasoon gestuurde hydratatie van dunne film voor de bereiding van liposomen

Liposomen zijn bolvormige blaasjes die bestaan uit een of meer fosfolipidenbilagen die een waterige kern omsluiten. Vanwege hun vermogen om hydrofiele, lipofiele en amfifiele verbindingen in te kapselen, worden liposomen veel gebruikt in farmaceutische, nutraceutische, cosmetische en voedingstoepassingen. Door hun biologische afbreekbaarheid, biocompatibiliteit en niet-immunogene aard zijn ze bijzonder aantrekkelijke afgiftesystemen.
Van de verschillende liposoomfabricagemethoden blijft dunne film hydratatie (TFH) een van de meest gevestigde en veelzijdige technieken. In combinatie met gecontroleerde sonicatie maakt deze methode de productie mogelijk van liposomen van nanogrootte met verbeterde homogeniteit, inkapselingsefficiëntie en stabiliteit.

Rol van ultrageluid in hydratatie van dunne film

Hydratatie met dunne film levert in eerste instantie voornamelijk multilamellaire vesikels (MLVs) op met relatief grote diameters en brede grootteverdelingen. Door hun grootte vertonen deze blaasjes een beperkte cellulaire opname en verminderde biologische beschikbaarheid, vooral in toepassingen die een efficiënte membraaninteractie of weefselpenetratie vereisen. Daarom wordt sonicatie toegepast als een gecontroleerde reductiestap om MLV's om te zetten in kleine unilamellaire of nanoliposomen met een smallere polydispersiteitsindex. Ultrasoon verkleinde nanoliposomen hebben een aanzienlijk hogere oppervlakte-volumeverhouding, een verbeterde colloïdale stabiliteit en een verbeterde cellulaire internalisatie, wat resulteert in een superieure biologische beschikbaarheid en toedieningsprestatie.

1. Werkingsmechanisme
   Ultrasoon geluid met hoge intensiteit genereert akoestische cavitatie – microscopische vorming en instorting van bellen – waarbij plaatselijke schuifkrachten, microstroming en voorbijgaande hoge drukgradiënten ontstaan.

   Deze effecten resulteren in:

   • Verstoring van grote multilamellaire blaasjes
   • Versnippering en reorganisatie van de bilagen
   • Vorming van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's)
   • Kleinere deeltjesgrootteverdeling

   In nano-liposomale systemen bereid via dunne film + ultrasone dispersie worden op betrouwbare wijze gemiddelde deeltjesdiameters in het bereik van ~80 nm met een lage polydispersiteit bereikt.

2. Procesvoordelen
   Ultrasoon ondersteunde TFH biedt:
   • Kleinere deeltjesgrootte (nanometerbereik)
   • Lagere polydispersiteitsindex (PDI)
   • Verhoogde inkapselingsefficiëntie
   • Verbeterde colloïdale stabiliteit
   • Verbeterde thermische en oxidatieve stabiliteit van ingekapselde verbindingen

   Deze verbeteringen zijn cruciaal voor het stabiliseren van oxidatiegevoelige bioactieve stoffen zoals meervoudig onverzadigde vetzuren.

Na de vorming van een lipidelaag en daaropvolgende rehydratie wordt sonicatie gebruikt om de insluiting van actieve ingrediënten in de liposomen te bevorderen. Bovendien wordt door middel van sonicatie de gewenste liposoomgrootte bereikt.

Algemene Instructie: Ultrasonisch-ondersteunde dunne film hydratatie liposoom voorbereiding

1. Materialen en formulering
   1. Selecteer fosfolipide (bv. lecithine/fosfatidylcholine) en optioneel cholesterol.
   2. Kies de lipideverhouding op basis van stabiliteitsbehoeften.

   Een lecithine/cholesterolverhouding van ongeveer 40:20 produceerde stabiele nanoliposomen met een hoog zetapotentiaal en een lage PDI in een voedingsgerelateerd systeem.

2. Oplossen van lipiden (organische fase)
   1. Los fosfolipide + cholesterol op in een vluchtig organisch oplosmiddel (bijv. chloroform).
   2. Als voor functionele additieven een co-solvent nodig is, los ze dan apart op (bijvoorbeeld methanol) en combineer ze.

   Deze aanpak wordt expliciet beschreven voor hydratatieliposomen met dunne film, waarbij chloroform (lipiden) en methanol (additief) worden gebruikt.

3. Dunne filmvorming
   1. Breng de lipidenoplossing over in een rondbodemkolf.
   2. Verwijder oplosmiddelen door roterende verdamping bij gematigde temperatuur (bijv. 40 °C) onder verminderde druk totdat een droge homogene film ontstaat.
4. Hydratatie van lipidefilm
   1. Hydrateer de lipidefilm met een waterige fase die de actieve stof bevat (of buffer als je lege liposomen produceert).
   2. Hydrateer onder roeren en verhoogde temperatuur (zo nodig boven de lipidefaseovergang).

   Voorbeeld van een biomedische formulering: hydratatie met HEPES-buffer (pH 7,4) en roeren bij 60°C gedurende 6 uur.

5. Ultrasone verkleining
   Na hydratatie bevat de dispersie meestal multilamellaire blaasjes en moet deze worden verkleind.

   Algemene aanbevelingen voor de sonicatiestap:

   • Gebruik ultrasone trillingen met een sonde.
   • Pas gepulseerde sonicatie toe om de temperatuur te regelen.
   • Bewaar het monster in een ijsbad of gebruik externe koeling.

   Voorbeeld van een sonicatieprotocol met de Hielscher UP200Ht sonicator:
   15 min totaal, 10 s AAN / 5 s UIT, 100 W, 100% amplitude. (vgl. Truszkowska et al., 2025 en Ahmadi et al., 2021)

6. Optionele nabewerking
   Afhankelijk van de toepassing:
   • Verwijder de niet-ingekapselde verbinding door centrifugeren/filtreren.
   • Wassen en resuspenderen in verse buffer.

   Voorbeeld: voor liposoomzuivering wordt verwijdering van ongebonden materiaal door centrifugeren en resuspensie beschreven.

7. Karakterisering
   De bijgevoegde studies behandelen consequent de volgende als essentiële kwaliteitsmaatstaven:
   • Deeltjesgrootte (nm)
   • Poly-dispersiteitsindex (PDI)
   • Zetapotentiaal
   • inkapselingsefficiëntie
   • Morfologie (TEM/SEM)
   • Stabiliteit tijdens opslag

   Voorbeeldresultaten die een goede kwaliteit van nano-liposomen aantonen zijn onder andere:
   Grootte ≈82 nm, PDI ≈0,06, zetapotentiaal ≈-56 mV, inkapselingsefficiëntie ≈76,5%.

   Praktische opmerkingen
   Cholesterol verbetert de stabiliteit. De studies geven expliciet aan dat het toevoegen van cholesterol de stabiliteit van liposomen kan verbeteren door de fasenovergang van fosfolipiden te remmen.

Voordelen van Hielscher ultrasone systemen voor liposoomproductie

Hielscher Ultrasonics biedt geavanceerde ultrasone processors die speciaal zijn ontworpen voor laboratorium-, pilot- en grootschalige industriële liposoomproductie. Deze systemen zijn met name geschikt voor ultrasoon ondersteunde hydratatie van dunne filmen, waarbij nauwkeurige controle van de akoestische energie essentieel is voor het bereiken van een gedefinieerde deeltjesgrootte, smalle grootteverdeling en reproduceerbare productkwaliteit.
Op laboratoriumschaal bieden Hielscher sonicators nauwkeurige amplituderegeling, reproduceerbare energie-input, programmeerbare pulswerking en geïntegreerde temperatuurbewaking. Dit niveau van controle zorgt voor een consistente cavitatie-intensiteit en zeer reproduceerbare nano-liposoomgrootte met een uitstekende uniformiteit tussen batches. Een dergelijke processtabiliteit is essentieel tijdens de ontwikkeling van formules, vooral bij het optimaliseren van belangrijke parameters zoals sonificatietijd, akoestisch vermogen, lipidensamenstelling en inkapselingsefficiëntie.

Industriële liposoomproductie

Voor industriële productie zijn de systemen van Hielscher ontworpen met het oog op lineaire schaalbaarheid, zodat procesparameters die zijn vastgesteld op laboratoriumschaal kunnen worden overgezet naar pilot- en productie-eenheden met behoud van gelijkwaardige energiedichtheid en procesomstandigheden. Ultrasone reactoren met continue stroming maken een hoge doorvoer van liposomen mogelijk met een uniforme energiedistributie en kortere verwerkingstijden. De systemen zijn gebouwd voor een robuuste 24/7 werking met een hoge energie-efficiëntie en lage onderhoudsvereisten. Bovendien kunnen ze worden geïntegreerd in GMP-conforme productieomgevingen, waaronder gesloten-lussystemen, geautomatiseerde proceslijnen en cleanroominstallaties. Deze eigenschappen maken de ultrasoontechnologie van Hielscher geschikt voor de farmaceutische, nutraceutische en food-grade productie van liposomen op industriële schaal.

Ultrasoon gestuurde hydratatie met dunne film is een zeer efficiënte, controleerbare en schaalbare methode voor de productie van nanoliposomen. Wetenschappelijk bewijs toont aan dat het combineren van TFH met ultrageluid de deeltjesgrootteverdeling, inkapselingsefficiëntie en stabiliteit van gevoelige bioactieve verbindingen aanzienlijk verbetert.
Hielscher sonicators bieden:

• Nauwkeurige energieregeling
• Reproduceerbare resultaten op nanoschaal
• Naadloze opschaling van laboratorium naar industriële productie
• Continue verwerking mogelijk
• Robuuste en GMP-compatibele werking

Voor onderzoekslaboratoria die geavanceerde liposoomformuleringen ontwikkelen en voor industriële fabrikanten die hoogwaardige farmaceutische of nutraceutische producten produceren, bieden de ultrasone systemen van Hielscher een technisch superieure en economisch schaalbare oplossing voor ultrasonisch ondersteunde bereiding van liposomen met dunne hydratatiefilm.

De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone machines:

Vergelijking met andere ultrasoon gestuurde liposoommethoden

Hoewel hydratatie met dunne film veel gebruikt wordt – vooral in lab en R&D-, ultrageluid verbetert ook verschillende andere prepareermethoden voor liposomen:

• omgekeerde fase verdamping – Ultrasoon geluid verbetert de emulsificatie en de vorming van blaasjes.
• Ethanol injectie methoden – Sonificatie verfijnt de deeltjesgrootte en vermindert aggregatie.
• Directe lecithinedispersie – Ultrasoon geluid maakt snelle liposoomvorming uit fosfolipidensuspensies mogelijk.
• Sonoporatie van voorgevormde liposomen – Akoestische energie verhoogt tijdelijk de doorlaatbaarheid van het membraan voor actieve belasting.
• Post-vorm verkleining - Sonificatie wordt routinematig toegepast om multilamellaire blaasjes te reduceren tot systemen op nanoschaal.

Ultrasoon geluid is dus niet slechts een hulpstap, maar een centrale faciliterende technologie voor alle liposomale productiestrategieën.

Ontwerp, productie en advies – Sonicators Made in Germany

Hielscher ultrasone machines worden algemeen erkend om hun hoge kwaliteit, robuuste techniek en geavanceerde ontwerpnormen. Hun duurzaamheid en gebruiksvriendelijke bediening maken een soepele integratie in industriële productiefaciliteiten mogelijk. Zelfs onder zware bedrijfsomstandigheden en in veeleisende omgevingen leveren Hielscher ultrasoontoestellen betrouwbare prestaties en consistente resultaten.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt sterk de nadruk op de productie van hoogwaardige ultrasone systemen die state-of-the-art technologie combineren met praktische bruikbaarheid. Alle Hielscher ultrasoonapparaten voldoen aan de CE-normen en aan de eisen van UL, CSA en RoHS.