Augsti attīrītu šizofilāna beta-glikānu ražošana ar ultraskaņu

Šizofilāns ir sēņu β-glikāns ar imūnmodulējošām īpašībām. Lai nodrošinātu ļoti spēcīgu ārstniecisko iedarbību, šizofilānam jābūt ar zemu molekulmasu, kas uzlabo tā biopieejamību. Ir pierādīts, ka apstrāde ar ultraskaņu samazina šizofilāna molekulmasu. Kā uzticamu un iedarbīgu metodi apstrādi ar ultraskaņu var viegli izmantot zemas molekulmasas šizofilāna ražošanai.

Schizophyllum sēnes un beta-glikānu ekstrakcija ar ultraskaņu

Schizophyllum ģints sēņu sugas dabā aug uz trūdošiem kokiem pēc lietus sezonām. Augļķermeņus ievāc nākamajā sausajā sezonā. Schizophyllum sugas ir bagātas ar bioķīmiskiem savienojumiem, piemēram, glikāniem, tāpēc tās īpaši tropu valstīs izmanto pārtikā un ārstniecībā. Pateicoties imūnmodulējošajām, pretsēnīšu, pretaudzēju un pretvīrusu īpašībām, Schizophyllum commune, kas pazīstama arī kā parastā šķeltlape, ir piesaistījusi biotehnoloģiju un farmācijas uzņēmumu uzmanību.
Polisaharīds šizofilāns, kas pazīstams arī kā sizofirāns, sonifilāns vai sizofilāns, ir galvenais Schizophyllum sēnēs sastopamais β-glikāns; šīs sēnes nodrošina ļoti iedarbīgo bioaktīvo β-glikānu šizofilānu.
Schizophyllum commune sēnes dabā aug uz kokiem, bet micēliju var audzēt arī fermentācijas buljonā. Farmaceitiskos un kosmētiskos lietojumos zemas molekulmasas šizofilāns ir daudz iedarbīgāks nekā augstas molekulmasas šizofilāns. Tas ir tāpēc, ka zemas molekulmasas šizofilānam ir ievērojami labāka biopieejamība un uzsūkšanās ātrums. Turklāt augstas molekulmasas šizofilāna izmantošana bieži rada problēmas, jo tā ūdens šķīdumiem ir augsta viskozitāte.
Izmēra samazināšana ar ultraskaņu ir ļoti efektīva un uzticama metode šizofilāna molekulmasas samazināšanai, tādējādi uzlabojot β-glikāna molekulas kvalitāti.

Zemas molekulmasas šizofilāna ražošanas protokols

Tā kā zemas molekulmasas šizofilānam ir krasi labāka biopieejamība un lietojuma īpašības, Smirnou pētnieku grupa pētīja apstrādi ar ultraskaņu β-glikāna šizofilāna molekulas šķelšanai un izmēra samazināšanai.

Šizofilāna apstrāde ar ultraskaņu

β-1.3(1.6)-glikānu šizofilānu (SPG) ražoja, dziļumkultūrā bioreaktorā kultivējot S. commune sēni un kā substrātu izmantojot saharozi.
Pēc kultivēšanas beigām kultūras buljonu atšķaidīja ar demineralizētu ūdeni līdz šizofilāna koncentrācijai 2 g/L un apstrādāja ar ultraskaņu, izmantojot ultraskaņas procesoru UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Vācija) recirkulācijas režīmā ar šādiem parametriem un apstākļiem: vides plūsmas ātrums 50 mL/s, frekvence 20 kHz, izejas jauda 2000 W, sonotrodes tips BS2d22, pastiprinātāja tips B2-1.4 un amplitūda 100%. Kultūras buljona temperatūra apstrādes ar ultraskaņu sākumā bija 25°C. Ar ultraskaņu apstrādāto kultūras buljonu (īpatnējā enerģijas ievade 100 Ws/mL) filtrēja caur Seitz HS800 dziļumfiltru 1,5 bar spiedienā un 40°C temperatūrā. Ķīmiskajai raksturošanai paredzēto ar ultraskaņu apstrādāto šizofilānu (uSPG) izgulsnēja no filtrāta ar trīskāršu izopropilspirta daudzumu laboratorijas temperatūrā un žāvēja 60°C temperatūrā 12h. uSPG šķīdumus imunoloģiskajiem pētījumiem sagatavoja šādi: (1) ar ultraskaņu apstrādātā kultūras buljona filtrātu diafiltrēja caur 0,1m2 Pall Centramate T sērijas PES kaseti (molekulmasas atdalīšanas robeža 100 kDa) 0,8 bar spiedienā un turpināja diafiltrāciju, līdz retentāta elektrovadītspēja bija 20 μS/cm; (2) šķīdumu koncentrēja ar diafiltrāciju līdz uSPG koncentrācijai 1 g/L un sterilizēja autoklāvā 120°C/20 min. Denaturētu uSPG sagatavoja līdzīgā veidā, izņemot to, ka kultūras buljona filtrātam pievienoja NaOH līdz koncentrācijai 0,2 M un pirms diafiltrācijas sārmainoto šķīdumu inkubēja 30 min laboratorijas temperatūrā.

Analītiskās metodes

Micēlija iznākumu novērtēja gravimetriski: kultūras buljonu atšķaidīja ar ūdeni attiecībā 1:4, centrifugēja pie 10 000 × g 25°C temperatūrā 20 min, nogulsnes mazgāja ar trīskāršu ūdens daudzumu, žāvēja 60°C temperatūrā un nosvēra. Šizofilānu izgulsnēja no supernatanta ar trīskāršu izopropilspirta daudzumu, žāvēja 60°C temperatūrā 24h un tā iznākumu noteica gravimetriski. pO2 kultūras buljonā mērīja ar optisko zondi Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Šveice).
Kultūras buljona dinamisko viskozitāti mērīja ar HAAKE Visco Tester 6L, izmantojot vārpstas 1L un 2L, 4°C temperatūrā ar rotācijas ātrumu 30 rpm. Filtrēšanas ātrumu aprēķināja pēc laika, kas nepieciešams, lai 500 mL kultūras buljona izfiltrētu caur 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, ASV) dziļumfiltru pie 1,5 bar spiediena un 40°C temperatūras.
uSPG molekulmasu mērīja ar SEC-MALLS, izmantojot HPLC sistēmu Alliance (Waters) ar virknē savienotām PL aquagel OH60 un PL aquagel OH40 kolonnām, un detektoru miniDAWN TREOS (Wyatt) koncentrēja ar diafiltrāciju līdz uSPG koncentrācijai 1 g/L un sterilizēja autoklāvā pie 120°C/20 min. Denaturētu uSPG sagatavoja līdzīgi, izņemot to, ka kultūras buljona filtrātam pievienoja NaOH līdz koncentrācijai 0,2 M un pirms diafiltrācijas sārmainoto šķīdumu inkubēja 30 min laboratorijas temperatūrā.

Rezultāti:
Apstrādi ar ultraskaņu veica tieši S. commune kultūras buljonam ar micēliju pēc 144 h kultivēšanas, lai atvieglotu SPG turpmāko pārstrādi.
 
Ar ultraskaņu apstrādāta šizofilāna raksturojums: Ar ultraskaņu apstrādātu šizofilānu (uSPG) izgulsnēja no kultūras buljona filtrāta ar spirtu un raksturoja. Ar SEC-MALLS noteiktā uSPG Mw bija aptuveni 1 MDa. Šķidrās fermentācijas ceļā iegūta šizofilāna vidējā molekulmasa ir aptuveni 5 MDa, savukārt, kultivējot uz cietas barotnes, tā var sasniegt līdz 10 MDa. Salīdzinot ar ultraskaņu apstrādāta šizofilāna molekulmasu ar natīva, neapstrādāta šizofilāna molekulmasām, var novērot, ka apstrāde ar ultraskaņu samazina molekulmasu 5–10 reizes.
Ar ultraskaņu apstrādātais polisaharīds uSPG saturēja 0,7%w/w olbaltumvielu un 1,0%w/w atlikuma pēc izkarsēšanas. uSPG hidrolizāts sastāvēja no vairāk nekā 99% glikozes. Analīžu rezultāti liecina, ka apstrāde ar ultraskaņu nejaušās vietās sašķeļ β-glikāna pamatķēdi, bet sānu atzari paliek neskarti, tādējādi samazinot šizofilāna izmēru un molekulmasu. Imunoloģiskie pētījumi ar uSPG, kas būtībā nesaturēja olbaltumvielas un endotoksīnus, parādīja, ka ar ultraskaņu apstrādātam šizofilānam ar zemu Mw piemīt izteikta imūnmodulējoša aktivitāte.

 
Samazināta viskozitāte: Apstrāde ar ultraskaņu būtiski samazināja kultūras buljona viskozitāti. Apstrādes laikā kultūras buljona viskozitāte mainījās nelineāri: apstrādes sākumā viskozitāte samazinājās strauji, bet vēlāk tās samazināšanās palēninājās. Īpatnējais enerģijas pievades daudzums 100 Ws/mL bija pietiekams, lai samazinātu kultūras buljona viskozitāti gandrīz 7 reizes.

Uzlabota filtrēšana: Ar ultraskaņu apstrādātais kultivēšanas buljons plūda caur filtru ātrāk nekā neapstrādātais kultivēšanas buljons (īpatnējais enerģijas patēriņš 0 Ws/mL) ar lielmolekulāru SPG. Turklāt apstrāde ar ultraskaņu ievērojami samazināja produkta zudumus filtrēšanas laikā. Neapstrādātā kultivēšanas buljona ar lielmolekulāru SPG (īpatnējais enerģijas patēriņš 0 Ws/mL) filtrāts saturēja 0,3 ± 0,07 g/L SPG, savukārt SPG koncentrācija pirms dziļumfiltrēšanas bija 2 g/L. Turpretī ar ultraskaņu apstrādātā kultivēšanas buljona filtrāts pie īpatnējā enerģijas patēriņa 100 Ws/mL saturēja SPG koncentrācijā 2,2 ± 0,2 g/L, kas atbilst gandrīz nulles produkta zudumiem.

Secinājums: Savos secinājumos pētnieku komanda rezumē, ka apstrāde ar ultraskaņu ir efektīva tehnoloģija mazmolekulāra šizofilāna ražošanai, ko pēc tam var izmantot kosmētikā un medicīnā. Apstrāde ar ultraskaņu, ja to veic visam kultivēšanas buljonam kopā ar micēliju, sniedz zināmas priekšrocības šizofilāna ražošanā. Tā samazina produkta zudumus turpmākās apstrādes laikā un, pateicoties efektīvai ultrafiltrēšanas izmantošanai, ļauj ražot augsti attīrītu polisaharīdu.
Turklāt pētnieki konstatēja, ka šizofilāna apstrādi ar ultraskaņu ir viegli mērogot. Viena pilotiekārtas ultraskaņas dezintegratora UIP2000hdT vienība plūsmas režīmā apstrādāja 1 litru kultivēšanas buljona 110 s laikā. Sistēmas ražīgumu var viegli palielināt, virknē pieslēdzot papildu ultraskaņas iekārtas.

 
Lasiet vairāk par sēņu ekstrakcijas mēroga vienkāršu palielināšanu!
 

Augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtas sēņu glikānu apstrādei

Polisaharīdu, piemēram, glikānu, kā arī citu bioaktīvu savienojumu, piemēram, hitīna un hitozāna, fragmentēšanu var uzticami veikt ar Hielscher augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtām. Mūsu ultraskaņas aparāti spēj nodrošināt lielas amplitūdas, ļauj precīzi kontrolēt procesa parametrus un var darboties 24/7 ar lielu slodzi un sarežģītos apstākļos. Hielscher Ultrasonics iekārtu klāsts uzticami atbilst šīm prasībām. Papildus izcilai ultraskaņas veiktspējai Hielscher ultraskaņas aparāti izceļas ar augstu energoefektivitāti, kas ir būtiska ekonomiska priekšrocība – īpaši, ja tos izmanto komerciālā lielapjoma ražošanā.
Hielscher ultraskaņas aparāti ir augstas veiktspējas sistēmas, kuras var aprīkot ar tādiem piederumiem kā sonotrodes, amplitūdas pastiprinātāji, reaktori vai plūsmas šūnas, lai optimāli pielāgotos jūsu procesa vajadzībām.
Digitāls krāsu displejs, iespēja iepriekš iestatīt apstrādes ar ultraskaņu ciklus, automātiska datu ierakstīšana integrētā SD kartē, attālināta vadība pārlūkprogrammā un daudzas citas funkcijas nodrošina visaugstāko procesa kontroles un lietošanas ērtuma līmeni. Pateicoties izturībai un spējai darboties ar lielu slodzi, Hielscher ultraskaņas sistēmas ir jūsu uzticamais darba zirgs ražošanā.
Lai samazinātu tādu β-glikānu kā šizofilāna molekulmasu, nepieciešama jaudīga ultraskaņa, kas nodrošina paredzēto šķelšanu un augstas kvalitātes šizofilāna galaproduktu, kuru var izmantot farmaceitiskiem lietojumiem.
 
Šeit atradīsiet vairāk informācijas par beta-glikānu ekstrakciju no sēnēm ar ultraskaņu, tostarp soli pa solim sniegtus norādījumus!
 
Tālāk redzamā tabula sniedz priekšstatu par mūsu ultraskaņas iekārtu aptuveno apstrādes jaudu: