Augsti attīrītu šizofilāna beta-glikānu ultraskaņas ražošana

Schizophyallan ir sēnīšu β-glikāns ar imūnmodulējošām īpašībām. Ļoti aktīvai ārstnieciskai iedarbībai šizofilānam jābūt ar mazu molekulmasu, lai parādītu labāku biopieejamību. Ir pierādīts, ka ultrasonication samazina šizofilāna molekulmasu. Kā uzticamu un efektīvu metodi, ultraskaņas apstrādi var viegli izmantot zemas molekulmasas šizofilāna ražošanai.

Schizophyllum sēnes un ultraskaņas beta-glikāna ekstrakcija

Schizophyllum sēņu sugas dabā aug uz bojājošiem kokiem pēc lietus sezonām. Augļu ķermeņi tiek savākti nākamajā sausajā sezonā. Schizophyllum sugas ir bagātas ar bioķīmiskiem savienojumiem, piemēram, glikāniem, un tāpēc tās tiek patērētas īpaši tropu valstīs kā pārtika un zāles. Pateicoties imūnmodulējošajām, pretsēnīšu, pretaudzēju un pretvīrusu īpašībām, Schizophyllum komūna, kas pazīstama arī kā Splitgill sēne, ir piesaistījusi biotehnoloģiju un farmācijas uzņēmumus.
Polisaharīdu šizofilāns, kas pazīstams arī kā sizofiran, sonifilan vai sizofilan, ir galvenais β-glikāns, kas atrodams Schizophyllum sēnēs, kas piedāvā ļoti efektīvu bioaktīvo β-glikāna šizofilānu.
Schizophyllum komūnas sēnes dabā aug uz kokiem, micelliju var kultivēt arī fermentācijas buljonā. Farmaceitiskiem un kosmētiskiem lietojumiem zemas molekulmasas šizofilāns ir daudz efektīvāks nekā šizofilāns ar augstu molekulmasu. Tas ir saistīts ar to, ka zemas molekulmasas šizofilāns uzrāda ievērojami labākus biopieejamības un absorbcijas rādītājus. Turklāt šizofilāns ar lielu molekulmasu bieži ir problemātisks lietojumos, jo tas rada augstu ūdens šķīdumu viskozitāti.
Ultraskaņas izmēra samazināšana ir ļoti efektīva un uzticama metode, lai samazinātu šizofilāna molekulmasu, tādējādi palielinot β-glikāna molekulas kvalitāti.

Protokols šizofilāna ar mazu molekulmasu ražošanai

Tā kā molekulmasas šizofilāns demonstrē krasi labākas biopieejamības un pielietojuma īpašības, Smirnou pētnieku komanda pētīja ultrasonication β-glikāna molekulas šizofilāna šķelšanai un lieluma samazināšanai.

Šizofilāna ultrasonikācija

β-1.3(1.6)-Glikāna šizofilāns (SPG) tika iegūts, iegremdējot S. komūnas sēnīti bioreaktorā, izmantojot saharozi kā substrātu.
Pēc audzēšanas beigām kultūras buljonu atšķaidīja ar demineralizētu ūdeni līdz šizofilāna koncentrācijai 2 g / L un ultrasonicēja ar ultraskaņas procesors UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Vācija) pārstrādes režīmā ar šādiem parametriem un nosacījumiem: vidēja plūsma 50 ml / s, frekvence 20 kHz, izeja 2000 W, sonotrode tips BS2d22, pastiprinātāja tips B2-1.4 un amplitūda 100%. Kultūras buljona temperatūra ultraskaņas apstrādes sākumā bija 25 ° C. Ultraskaņas kultūras buljons (īpatnējā enerģijas ievade 100 Ws / ml) tika filtrēts caur Seitz HS800 dziļuma filtru zem 1.5 bar spiediena 40 ° C temperatūrā. Ultraskaņas šizofilāns (uSPG) ķīmiskam raksturojumam tika izgulsnēts no filtrāta ar trīskāršu izopropilspirta daudzumu laboratorijas temperatūrā un žāvēts 60 ° C temperatūrā 12h uSPG šķīdumi imunoloģiskiem pētījumiem tika sagatavoti šādi: (1) ultrasonicated kultūras buljona filtrāts tika diafiltrēts caur 0,1m2 Pall Centramate T-sērijas PES kaseti (100 kDa cut-off) pie 0,8 bar un diafiltrācija turpinājās, līdz retentāta vadītspēja bija 20 μS / cm; (2) šķīdumu koncentrēja, diafiltrējot līdz uSPG koncentrācijai 1 g/l, un sterilizēja autoklāvā 120°C/20 min temperatūrā. Denaturēts uSPG tika sagatavots līdzīgā veidā, izņemot to, ka NaOH tika pievienots kultūras buljona filtrātam 0,2 M koncentrācijā un sārmainais šķīdums tika inkubēts 30 minūtes laboratorijas temperatūrā pirms diafiltrācijas.

Analītiskās metodes

Mikēlija iznākums tika novērtēts gravimetriski: kultūras buljonu atšķaidīja ar ūdeni 1:4, centrifugēja 10000 × g 25 °C temperatūrā 20 minūtes, nogulsnes mazgāja ar trīskāršu ūdens daudzumu, žāvēja 60 °C temperatūrā un nosvēra. Šizofilāns tika izgulsnēts no centrifugāta ar trīskāršu izopropilspirta daudzumu, žāvēts 60 °C temperatūrā 24 stundas un tā iznākums tika noteikts gravimetriski. pO2 kultūras buljonā tika mērīts ar optisko zondi Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamiltona, Šveice).
Kultūras buljona dinamiskā viskozitāte tika mērīta ar HAAKE Visco Tester 6L ar vārpstām 1L un 2L pie 4 ° C un rotācijas ātrumu 30 apgr./min. Filtrēšanas ātrums tika aprēķināts no 500 ml kultūras buljona filtrēšanas laika līdz 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, ASV) dziļuma filtram pie 1,5 bar spiediena un 40°C.
uSPG molekulmasa tika mērīta ar SEC-MALLS uz HPLC sistēmas Alliance (Waters) ar sērijveidā savienotām PL aquagel OH60 un PL aquagel OH40 kolonnām, un detektors miniDAWN TREOS (Wyatt) tika koncentrēts diafiltrācijā līdz uSPG koncentrācijai 1 g/L un sterilizēts autoklāvā 120 °C/20 min temperatūrā. Denaturēts uSPG tika sagatavots līdzīgā veidā, izņemot to, ka NaOH tika pievienots kultūras buljona filtrātam 0,2 M koncentrācijā un sārmainais šķīdums tika inkubēts 30 minūtes laboratorijas temperatūrā pirms diafiltrācijas.

Rezultātus:
Ultrasonication apstrāde tika piemērota tieši S. komūnas 144-h kultūras buljonam ar micēliju, lai atvieglotu SPG pakārtoto apstrādi.
 
Ultraskaņas šizofilāna raksturojums: Ultrasonicated schizophyllan (uSPG) tika nogulsnēts no kultūras buljona filtrāta ar alkoholu un raksturots. SEC-MALLS lēsa, ka uSPG Mw ir aptuveni 1 MDa. Šizofilāna vidējā molekulmasa no šķidrās fermentācijas ir aptuveni 5 MDa, bet cietvielu audzēšanā tā var sasniegt pat 10 MDa. Salīdzinot ultraskaņas šizofilāna molekulmasu ar vietējā neapstrādātā šizofilāna molekulmasām, ultrasonikācijas dēļ var novērot 5 līdz 10 reizes samazinātu molekulmasu.
Ultraskaņas polisaharīds uSPG pēc aizdedzināšanas saturēja 0,7% w / w proteīna un 1,0% w / w atlikuma. uSPG hidrolizāts sastāvēja no glikozes ar vairāk nekā 99%. Analītiskie rezultāti liecina, ka ultraskaņas apstrāde nejauši sašķeļ β-glikāna mugurkaulu un sānu zari paliek neskarti, tādējādi samazinot šizofilāna izmēru un molekulmasu. Imunoloģiskie pētījumi par būtībā olbaltumvielu un endotoksīnu nesaturošu uSPG parādīja, ka ultrasonicated low-Mw šizofilānam ir izteikta imūnmodulējoša aktivitāte.

 
Samazināta viskozitāte: Ultrasonication izraisīja ievērojamu kultūras buljona viskozitātes samazināšanos. Ultrasonication laikā kultūras buljona viskozitāte mainījās nelineāri: viskozitātes samazināšanās bija strauja ultra-ultraskaņas sākumā, bet vēlāk tā palēninājās. Īpatnējā enerģijas ievade 100 Ws/ml bija pietiekama, lai samazinātu kultūras buljona viskozitāti gandrīz 7 reizes.

Uzlabota filtrēšana: Ultraskaņas apstrādātās kultūras buljons plūda caur filtru ātrāk nekā neapstrādāts kultūras buljons (īpatnējā enerģijas ievade 0 Ws / ml) ar augstas molekulārās SPG. Turklāt, ultrasonication ievērojami samazināja produkta zudumus filtrēšanas laikā. Neapstrādāta kultūras buljona filtrāts ar augstas molekulārās SPG (īpatnējā enerģijas pievade 0 Ws/ml) saturēja 0,3 ± 0,07 g/L SPG, bet SPG koncentrācija pirms dziļuma filtrēšanas bija 2 g/l. Turpretī 100 Ws / ml ultraskaņas kultūras filtrāts abi saturēja SPG koncentrācijā 2,2 ± 0,2 g / L, kas atbilst gandrīz nulles produkta zudumam.

Secinājums: Savā secinājumā pētnieku komanda atsāk, ka ultraskaņas apstrāde ir efektīva tehnoloģija zemas molekulmasas šizofilāna ražošanai, ko pēc tam var izmantot kosmētikā un medicīnā. Ultrasonication, ja to lieto pilnīgā kultūras buljonā ar micēliju, rada zināmas priekšrocības šizofilāna ražošanai. Tas samazina produktu zudumus pakārtotās apstrādes laikā un padara iespējamu augsti attīrītu polisaharīdu ražošanu, pateicoties efektīvai ultrafiltrācijas izmantošanai.
Turklāt pētnieki atklāja, ka šizofilāna ultraskaņas apstrāde ir viegli mērogojama. Viena izmēģinājuma iekārtas ultraskaņas dezintegratora UIP2000hdT vienība apstrādāja 1 litru kultūras buljona 110 s plūsmas režīmā. Sistēmas produktivitāti var viegli palielināt, secīgi pieslēdzot papildu ultraskaņas vienības.

 
Lasiet vairāk par vienkāršu sēņu ekstrakcijas mērogošanu!
 

Augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtas sēnīšu glikāna apstrādei

Polisaharīdu, piemēram, glikānu, kā arī citu bioaktīvo savienojumu, piemēram, hitīna un hitozāna, sadrumstalotība var būt droši procesi ar Hielscher augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtām. Mūsu ultrasonikatori var nodrošināt augstas amplitūdas, piedāvā precīzu vadāmību pār procesa parametriem, un tos var darbināt 24/7 ar lielu slodzi un prasīgā vidē. Hielscher Ultrasonics aprīkojuma klāsts droši atbilst šīm prasībām. Bez izcilas ultraskaņas veiktspējas, Hielscher ultrasonikatori lepojas ar augstu enerģijas efektivitāti, kas ir ievērojama ekonomiska priekšrocība – jo īpaši, ja to izmanto komerciālā liela mēroga ražošanā.
Hielscher ultrasonikatori ir augstas veiktspējas sistēmas, kuras var aprīkot ar piederumiem, piemēram, sonotrodes, pastiprinātājiem, reaktoriem vai plūsmas šūnām, lai optimāli atbilstu jūsu procesa vajadzībām. Izmantojot digitālo krāsu displeju, tiek nodrošināta iespēja iepriekš iestatīt ultraskaņas apstrādi, automātiska datu ierakstīšana integrētā SD kartē, attālā pārlūka vadība un daudzas citas funkcijas, visaugstākā procesa kontrole un lietotājdraudzīgums. Pārī ar izturību un smagu nestspēju, Hielscher ultraskaņas sistēmas ir jūsu uzticamais darba zirgs ražošanā. β-glikānu, piemēram, šizofilāna, molekulmasas samazināšanai nepieciešama spēcīga ultraskaņa, lai iegūtu mērķtiecīgu šķelšanos un augstas kvalitātes galīgo šizofilāna produktu, ko var izmantot farmaceitiskiem lietojumiem.
 
Uzziniet vairāk par ultraskaņas beta-glikāna ekstrakciju no sēnēm, ieskaitot soli pa solim instrukcijas šeit!
 
Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu ultrasonikatoru aptuveno apstrādes jaudu: