Hitīna un hitozāna ražošana no sēnēm

Apstrāde ar ultraskaņu ir ļoti efektīva metode hitīna un hitozāna atbrīvošanai no sēņu izcelsmes avotiem, piemēram, cepurīšu sēnēm. Lai iegūtu augstas kvalitātes biopolimēru, turpmākajos apstrādes posmos hitīns un hitozāns ir jādepolimerizē un jādeacetilē. Ar ultraskaņu veicināta depolimerizācija un deacetilēšana ir ļoti iedarbīga, vienkārša un ātra metode, kas ļauj iegūt augstas kvalitātes hitozānus ar lielu molekulmasu un izcilu biopieejamību.

Hitīna un hitozāna iegūšana no sēnēm ar ultraskaņu

Ēdamās un ārstnieciskās sēnes, piemēram, Lentinus edodes (šitake), Ganoderma lucidum (lingži jeb reiši), Inonotus obliquus (čaga), Agaricus bisporus (šampinjoni), Hericium erinaceus (lauvas krēpes), Cordyceps sinensis (kāpurķēne), Grifola frondosa (daivainā čemurene), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, daudzkrāsu tauriņpiepe) un daudzas citas sēņu sugas plaši izmanto pārtikā un bioaktīvo savienojumu ekstrakcijai. Šīs sēnes, kā arī to pārstrādes atlikumus (sēņu atkritumus) var izmantot hitozāna ražošanai. Apstrāde ar ultraskaņu ne tikai veicina hitīna atbrīvošanos no sēņu šūnu sieniņu struktūras, bet arī sekmē hitīna pārvēršanu vērtīgajā hitozānā, izmantojot ar ultraskaņu veicinātu depolimerizāciju un deacetilēšanu.

Apstrāde ar ultraskaņu veicina hitīna depolimerizāciju un deacetilēšanu, pārvēršot to hitozānā

Intensīva apstrāde ar ultraskaņu, izmantojot zondes tipa ultraskaņas sistēmu, ir metode, ko izmanto hitīna depolimerizācijas un deacetilēšanas veicināšanai, kā rezultātā veidojas hitozāns. Hitīns ir dabā sastopams polisaharīds, kas atrodams vēžveidīgo un kukaiņu ārējā skeletā, kā arī noteiktu sēņu šūnu sieniņās. Hitozānu iegūst no hitīna, atšķeļot acetilgrupas no hitīna molekulas.

Ultraskaņas metode sēņu hitīna pārvēršanai hitozānā

Ja hitozāna ražošanai no hitīna izmanto intensīvu apstrādi ar ultraskaņu, hitīna suspensiju apstrādā ar augstas intensitātes zemfrekvences ultraskaņas viļņiem, parasti diapazonā no 20 kHz līdz 30 kHz. Process rada intensīvu akustisko kavitāciju, kas ir mikroskopisku vakuuma burbulīšu veidošanās, augšana un sabrukšana šķidrumā. Kavitācija šķidrumā ap kavitācijas burbulīšiem lokāli rada ārkārtīgi lielus bīdes spēkus, augstu temperatūru (līdz pat vairākiem tūkstošiem Celsija grādu) un spiedienu (līdz pat vairākiem simtiem atmosfēru). Šie ekstremālie apstākļi veicina hitīna polimēra sašķelšanu un turpmāko deacetilēšanu.
 

Divu sēņu sugu hitīnu un hitozānu SEM attēli: a) hitīns no L. vellereus; b) hitīns no P. ribis; c) hitozāns no L.vellereus; d) hitozāns no P. ribis.
attēls un pētījums: © Erdoğan et al., 2017

Hitīna depolimerizācija ar ultraskaņu

Hitīna depolimerizācija notiek mehānisko spēku, piemēram, mikroplūsmu un šķidruma strūklu, kopīgas iedarbības rezultātā, kā arī ultraskaņas ierosinātu ķīmisko reakciju rezultātā, ko izraisa kavitācijas laikā radušies brīvie radikāļi un citas reaģētspējīgas daļiņas. Kavitācijas laikā radītie augstspiediena viļņi pakļauj hitīna ķēdes bīdes spriegumam, kā rezultātā polimērs sašķeļas mazākos fragmentos.

Hitīna deacetilēšana ar ultraskaņu

Papildus depolimerizācijai intensīva apstrāde ar ultraskaņu veicina arī hitīna deacetilēšanu. Deacetilēšana ietver acetilgrupu atšķelšanu no hitīna molekulas, kā rezultātā veidojas hitozāns. Intensīva ultraskaņas enerģija, jo īpaši kavitācijas laikā radītā augstā temperatūra un spiediens, paātrina deacetilēšanas reakciju. Kavitācijas radītie reaģētspējīgie apstākļi palīdz sašķelt acetilgrupu saites hitīnā, izraisot etiķskābes izdalīšanos un hitīna pārvēršanos hitozānā.
Kopumā intensīva apstrāde ar ultraskaņu uzlabo gan depolimerizācijas, gan deacetilēšanas procesus, nodrošinot nepieciešamo mehānisko un ķīmisko enerģiju hitīna polimēra sašķelšanai un atvieglojot tā pārvēršanu hitozānā. Šī tehnoloģija piedāvā ātru un efektīvu metodi hitozāna ražošanai no hitīna ar daudziem pielietojumiem dažādās nozarēs, tostarp farmācijā, lauksaimniecībā un biomedicīnas inženierijā.

Hitozāna rūpnieciskā ražošana no sēnēm ar lieljaudas ultraskaņu

Hitīna un hitozāna komerciālās ražošanas pamatā galvenokārt ir jūras resursu ieguves un pārstrādes nozaru atkritumi (t. i., zvejniecības, gliemju un vēžveidīgo ieguves u. c.). Dažādi izejvielu avoti nodrošina atšķirīgu hitīna un hitozāna kvalitāti, un sezonālās zvejas apjomu izmaiņas izraisa ražošanas un kvalitātes svārstības. Turklāt tiek ziņots, ka no sēnēm iegūtam hitozānam piemīt labākas īpašības, piemēram, vienmērīgs polimēru ķēžu garums un lielāka šķīdība, salīdzinot ar hitozānu no jūras izcelsmes avotiem. (Sk. Ghormade et al., 2017) Lai nodrošinātu vienmērīgas kvalitātes hitozāna piegādi, hitīna ekstrakcija no sēņu sugām ir kļuvusi par stabilu alternatīvu ražošanas veidu. Hitīnu un hitozānu no sēnēm var viegli un droši ražot, izmantojot ultraskaņas ekstrakcijas un deacetilēšanas tehnoloģiju. Intensīva apstrāde ar ultraskaņu sagrauj šūnu struktūras, lai atbrīvotu hitīnu, un veicina masas pārnesi ūdens šķīdinātājos, nodrošinot lielāku hitīna iznākumu un labāku ekstrakcijas efektivitāti. Turpmākā deacetilēšana ar ultraskaņu pārvērš hitīnu vērtīgajā hitozānā. Gan hitīna ekstrakciju ar ultraskaņu, gan tā deacetilēšanu līdz hitozānam var lineāri mērogot līdz jebkuram komerciālās ražošanas apjomam.

Apstrāde ar ultraskaņu intensificē hitozāna ražošanu no sēnēm un padara ražošanu efektīvāku un ekonomiskāku.
(attēls un pētījums: © Zhu et al., 2019)

Pētījumu rezultāti par hitīna un hitozāna deacetilēšanu ar ultraskaņu

Zhu et al. (2018) savā pētījumā secina, ka deacetilēšana ar ultraskaņu ir izrādījusies būtisks izrāviens, pārvēršot β-hitīnu hitozānā ar 83–94% deacetilēšanas pakāpi pazeminātā reakcijas temperatūrā. Attēlā pa kreisi redzams ar ultraskaņu deacetilēta hitozāna SEM attēls (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (attēls un pētījums: © Zhu et al., 2018)
Savā protokolā viņi pagatavoja NaOH šķīdumu (20 w/v %), izšķīdinot NaOH pārslas dejonizētā ūdenī. Pēc tam sārma šķīdumu centrifūgas mēģenē pievienoja GLSP nogulsnēm (0,5 g), ievērojot cietās un šķidrās fāzes attiecību 1:20 (g: mL). Hitozānu pievienoja NaCl (40 mL, 0,2 M) un etiķskābei (0,1 M), ievērojot šķīdumu tilpumu attiecību 1:1. Pēc tam suspensiju 60 min apstrādāja ar ultraskaņu mērenā 25°C temperatūrā, izmantojot zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīci (250W, 20kHz). (sk. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) konstatēja, ka hitozāna šķīdumu degradācijas ātrumu reti ietekmē polimēra šķīdināšanai izmantotās skābes koncentrācija un ka tas lielā mērā ir atkarīgs no temperatūras, ultraskaņas viļņu intensitātes un polimēra šķīdināšanai izmantotās vides jonu spēka. (sk. Pandit et al., 2021)
 
Citā pētījumā Zhu et al. (2019) izmantoja Ganoderma lucidum sporu pulverus kā sēņu izcelsmes izejvielu un pētīja ar ultraskaņu veicinātu deacetilēšanu un tādu apstrādes parametru kā apstrādes ar ultraskaņu ilgums, cietās un šķidrās fāzes attiecība, NaOH koncentrācija un apstarošanas jauda ietekmi uz hitozāna deacetilēšanas pakāpi (DD). Augstākā DD vērtība tika iegūta ar šādiem ultraskaņas apstrādes parametriem: 20 min apstrāde ar ultraskaņu pie 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Ar ultraskaņu iegūtā hitozāna virsmas morfoloģija, ķīmiskās grupas, termiskā stabilitāte un kristāliskums tika pētīti, izmantojot SEM, FTIR, TG un XRD. Pētnieku grupa ziņo par būtisku ar ultraskaņu iegūtā hitozāna deacetilēšanas pakāpes (DD), dinamiskās viskozitātes ([η]) un molekulmasas (Mv¯) palielināšanos. Rezultāti apliecināja, ka sēņu materiāla deacetilēšana ar ultraskaņu ir ļoti iedarbīga biomedicīniskiem lietojumiem piemērota hitozāna ražošanas metode. (sk. Zhu et al., 2019)

Izcila hitozāna kvalitāte ar ultraskaņas depolimerizāciju un deacetilēšanu

Ar ultraskaņu īstenotos hitīna / hitozāna ekstrakcijas un depolimerizācijas procesus var precīzi kontrolēt, un ultraskaņas procesa parametrus var pielāgot izejvielām un vēlamajai galaprodukta kvalitātei (piemēram, molekulmasai, deacetilēšanas pakāpei). Tas ļauj pielāgot ultraskaņas procesu ārējiem faktoriem un iestatīt optimālus parametrus izcilam rezultātam un efektivitātei.
Ar ultraskaņu deacetilētam hitozānam piemīt lieliska biopieejamība un biosaderība. Salīdzinot ar ultraskaņu iegūtu hitozāna biopolimēru biomedicīniskās īpašības ar termiski iegūta hitozāna īpašībām, ar ultraskaņu iegūtais hitozāns uzrāda ievērojami uzlabotu fibroblastu (L929 šūnu) dzīvotspēju un pastiprinātu antibakteriālo aktivitāti gan pret Escherichia coli (E. coli), gan pret Staphylococcus aureus (S. aureus).
(sk. Zhu et al., 2018)
 

Skenējošās elektronu mikroskopijas (SEM) attēli 100× palielinājumā: a) gladiuss, b) ar ultraskaņu apstrādāts gladiuss, c) β-hitīns, d) ar ultraskaņu apstrādāts β-hitīns un e) hitozāns (avots: Preto et al. 2017)

Augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtas hitīna un hitozāna apstrādei

Hitīna fragmentēšanai un hitīna deacetilēšanai par hitozānu ir nepieciešamas jaudīgas un uzticamas ultraskaņas iekārtas, kas spēj nodrošināt lielas amplitūdas, ļauj precīzi kontrolēt procesa parametrus un var darboties 24/7 lielas slodzes apstākļos un prasīgā vidē. Hielscher Ultrasonics produktu klāsts uzticami atbilst šīm prasībām. Papildus izcilai ultraskaņas veiktspējai Hielscher ultraskaņas aparāti izceļas ar augstu energoefektivitāti, kas ir būtiska ekonomiska priekšrocība – īpaši, ja tos izmanto komerciālā lielapjoma ražošanā.
Hielscher ultraskaņas aparāti ir augstas veiktspējas sistēmas, kuras var aprīkot ar tādiem piederumiem kā sonotrodes, amplitūdas pastiprinātāji, reaktori vai plūsmas šūnas, lai optimāli pielāgotos jūsu procesa vajadzībām.
 Digitālais krāsu displejs, iespēja iepriekš iestatīt apstrādes ar ultraskaņu ciklus, automātiska datu ierakstīšana integrētā SD kartē, attālināta vadība pārlūkprogrammā un daudzas citas funkcijas ļauj Hielscher ultraskaņas aparātiem nodrošināt visaugstāko procesa kontroles līmeni un lietošanas ērtumu. Apvienojumā ar izturību un spēju izturēt lielu slodzi Hielscher ultraskaņas sistēmas ir jūsu uzticamais darba zirgs ražošanā. 
Hitīna fragmentēšanai un deacetilēšanai ir nepieciešama jaudīga ultraskaņa, lai panāktu paredzēto pārveidi un iegūtu augstas kvalitātes hitozāna galaproduktu. Lielām amplitūdām un paaugstinātam spiedienam ir izšķiroša nozīme, īpaši hitīna pārslu fragmentēšanā un depolimerizācijas / deacetilēšanas posmos. Hielscher Ultrasonics rūpnieciskie ultraskaņas procesori viegli nodrošina ļoti lielas amplitūdas. Ar amplitūdām līdz 200µm var nepārtraukti strādāt 24/7 režīmā. Vēl lielākām amplitūdām ir pieejamas individuāli pielāgotas ultraskaņas sonotrodes. Hielscher ultraskaņas sistēmu jauda ļauj veikt efektīvu un ātru depolimerizāciju un deacetilēšanu drošā un lietotājam ērtā procesā.
 

Sinerģiska hitīna apstrāde, ko uzlabo apstrāde ar ultraskaņu

Lai pārvarētu tradicionālās ķīmiskās un fermentatīvās hitīna deacetilēšanas trūkumus (proti, zemu efektivitāti, augstas enerģijas izmaksas, ilgu apstrādes laiku un toksiskus šķīdinātājus), hitīna un hitozāna apstrādē ir integrēta augstas intensitātes ultraskaņa. Augstas intensitātes apstrāde ar ultraskaņu un tās izraisītās akustiskās kavitācijas iedarbība nodrošina ātru polimēru ķēžu šķelšanu un samazina polidispersitāti, tādējādi veicinot hitozāna sintēzi. Turklāt ultraskaņas radītie bīdes spēki pastiprina masas pārnesi šķīdumā, tādējādi veicinot ķīmiskās, hidrolītiskās vai fermentatīvās reakcijas. Hitīna apstrādi ar ultraskaņu var kombinēt ar jau pastāvošām hitīna apstrādes metodēm, piemēram, ķīmiskajām metodēm, hidrolīzi vai fermentatīvām procedūrām.

Ultraskaņas veicināta ķīmiskā deacetilēšana un depolimerizācija

Tā kā hitīns ir ķīmiski nereaģētspējīgs un nešķīstošs biopolimērs, lai iegūtu šķīstošu un biopiekļūstamu hitozānu, tas jāpakļauj demineralizācijas, deproteinizācijas un depolimerizācijas / deacetilēšanas procesa posmiem. Šajos procesa posmos veic apstrādi ar stiprām skābēm, piemēram, HCl, un stiprām bāzēm, piemēram, NaOH un KOH. Tā kā šie tradicionālie procesa posmi ir neefektīvi, lēni un prasa lielu enerģijas patēriņu, procesa intensificēšana ar ultraskaņu būtiski uzlabo hitozāna ražošanu. Jaudīgas ultraskaņas izmantošana palielina hitozāna iznākumu un uzlabo tā kvalitāti, saīsina procesu no dienām līdz dažām stundām, ļauj izmantot saudzīgākus šķīdinātājus un padara visu procesu energoefektīvāku.

Ar ultraskaņu uzlabota hitīna deproteinizācija

Vallejo-Dominguez et al. (2021), pētot hitīna deproteinizāciju, konstatēja, ka “ultraskaņas izmantošana biopolimēru ražošanā samazināja gan olbaltumvielu saturu, gan hitīna daļiņu izmēru. Ar ultraskaņas palīdzību tika iegūts hitozāns ar augstu deacetilēšanas pakāpi un vidēju molekulmasu.”

Ultraskaņas hidrolīze hitīna depolimerizācijai

Ķīmiskajā hidrolīzē hitīna deacetilēšanai izmanto skābes vai sārmus, tomēr deacetilēšanu ar sārmiem (piemēram, nātrija hidroksīdu NaOH) izmanto plašāk. Skābes hidrolīze ir alternatīva tradicionālajai ķīmiskajai deacetilēšanai; tajā hitīna un hitozāna depolimerizācijai izmanto organisko skābju šķīdumus. Skābes hidrolīzes metodi galvenokārt izmanto, ja hitīna un hitozāna molekulmasai jābūt viendabīgai. Šis tradicionālais hidrolīzes process ir pazīstams kā lēns process ar lielu enerģijas patēriņu un augstām izmaksām. Nepieciešamība pēc stiprām skābēm, augstas temperatūras un spiediena ir faktori, kas hitozāna hidrolīzes procesu padara par ļoti dārgu un laikietilpīgu procedūru. Izmantoto skābju dēļ nepieciešami turpmākas apstrādes procesi, piemēram, neitralizācija un atsāļošana.
Integrējot hidrolīzes procesā lieljaudas ultraskaņu, var ievērojami pazemināt hitīna un hitozāna hidrolītiskajai šķelšanai nepieciešamo temperatūru un spiedienu. Turklāt apstrāde ar ultraskaņu ļauj izmantot zemāku skābju koncentrāciju vai maigākas skābes. Tas padara procesu ilgtspējīgāku, efektīvāku, ekonomiski izdevīgāku un videi draudzīgāku.

Ķīmiskā deacetilēšana ar ultraskaņas palīdzību

Hitīna un hitozāna ķīmisko sašķelšanu un deacetilēšanu galvenokārt panāk, apstrādājot hitīnu vai hitozānu ar minerālskābēm (piemēram, sālsskābi HCl), nātrija nitrītu (NaNO₂) vai ūdeņraža peroksīdu (H₂O₂). Ultraskaņa palielina deacetilēšanas ātrumu, tādējādi saīsinot reakcijas laiku, kas nepieciešams mērķa deacetilēšanas pakāpes sasniegšanai. Tas nozīmē, ka apstrāde ar ultraskaņu samazina nepieciešamo apstrādes laiku no 12–24 stundām līdz dažām stundām. Turklāt apstrāde ar ultraskaņu ļauj izmantot ievērojami zemāku ķīmisko vielu koncentrāciju, piemēram, 40% (w/w) nātrija hidroksīda, savukārt bez ultraskaņas nepieciešami 65% (w/w).

Ultraskaņas un fermentatīvā deacetilēšana

Lai gan fermentatīvā deacetilēšana ir maigs, videi nekaitīgs apstrādes veids, efektivitātes un izmaksu ziņā tā nav ekonomiski izdevīga. Tā kā turpmākā fermentu izdalīšana no galaprodukta un attīrīšana ir sarežģīta, darbietilpīga un dārga, hitīna fermentatīvo deacetilēšanu neizmanto komerciālā ražošanā, bet tikai zinātniskās pētniecības laboratorijās.
Priekšapstrāde ar ultraskaņu pirms fermentatīvās deacetilēšanas sašķeļ hitīna molekulas fragmentos, tādējādi palielinot virsmas laukumu un padarot fermentiem pieejamu lielāku virsmu. Augstas veiktspējas apstrāde ar ultraskaņu palīdz uzlabot fermentatīvo deacetilēšanu un padara procesu ekonomiski izdevīgāku.