Ultrasonication ir ļoti efektīva metode, lai atbrīvotu hitīnu un hitozānu no sēnīšu avotiem, piemēram, sēnēm. Lai iegūtu augstas kvalitātes biopolimēru, chitīns un hitozāns ir deacetilējami lejupejot. Ultrasoniski atbalstīta deacetilācija ir ļoti efektīva, vienkārša un ātra tehnika, kas rada augstas kvalitātes hitozānus ar augstu molekulmasu un izcilu biopieejamību.

Hitīns un hitozāns no sēnēm

Ēdamas un ārstnieciskas sēnes, piemēram, Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi vai reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (pogu sēnes), Hericium erinaceus (lauvas krēpes), Cordyceps sinensis (kāpurķēžu sēne), Grifola frondosa (koka vista), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, turkeytail) un daudzas citas sēņu sugas tiek plaši izmantotas kā pārtika un bioaktīvu savienojumu ieguvei. Šīs sēnes, kā arī pārstrādes atlikumus (sēņu atkritumus) var izmantot hitozāna ražošanai. Ultrasonication ne tikai veicina hitīna izdalīšanos no sēnīšu šūnu sienas struktūras, bet arī veicina chition pārveidošanu par vērtīgu hitozānu, izmantojot ultraskaņas depolimerizāciju.

Hitīna deacetilēšanu uz hitozāns veicina ar ultraskaņu

Hitīns, kas ir N-acetilglukoamīna polimērs (poli-(β-(1–4)-N-acetil-D-glikozamīns), ir dabā sastopams polisaharīds, kas plaši sastopams bezmugurkaulnieku eksoskeletonā, piemēram, vēžveidīgajiem un kukaiņiem, kalmāru un sēpijas iekšējo skeletu, kā arī sēnīšu šūnu sienās. Chitin, kas iestrādāts sēņu šūnu sienu struktūrā, ir atbildīgs par sēnīšu šūnu sienas formu un stingrību. Daudziem lietojumiem hitīns tiek pārvērsts par deacetilētu atvasinājumu, kas pazīstams kā hitozāns, izmantojot depolimerizācijas procesu.
Chitosan ir visizplatītākais un vērtīgākais hitīna atvasinājums. Tas ir lielmolekulārs polisaharīds, kas saistīts ar b-1,4 glikozīdu un sastāv no N-acetilglikosamīna un glikozamīna.
Hitozānu var iegūt ar ķīmisku vai fermentatīvu N-deacetilācija. Ķīmiski virzītā deacetilācijas procesā acetilgrupa (R-NHCOCH)₃), augstā temperatūrā sašķeļ spēcīgs sārms. Alternatīvi hitozānu var sintezēt, izmantojot fermentatīvu deacetilāciju. Tomēr rūpnieciskās ražošanas mērogā ķīmiskā deacetilācija ir vēlamā metode, jo fermentatīvā deacetilācija ir ievērojami mazāk efektīva, pateicoties deacetilāzes fermentu augstajām izmaksām un iegūtajai zemajai hitozāna ražai. Ultrasonication tiek izmantota, lai pastiprinātu ķīmisko degradāciju (1→4)-/β-linkage (depolimerizācija) un ietekmētu hitīna deacetilāciju, lai iegūtu augstas kvalitātes hitozānu. Ja ultraskaņas apstrāde tiek izmantota kā fermentatīvās deacetilācijas pirmapstrāde, uzlabojas arī hitozāna raža un kvalitāte.

Rūpnieciskā hitozāna ražošana no sēnēm ar ultraskaņu

Komerciālā hitīna un hitozāna ražošana galvenokārt balstās uz jūras nozaru atkritumiem (t. i., zvejniecība, čaumalu zivju ieguve utt.). Dažādi izejvielu avoti rada atšķirīgas hitīna un hitozāna īpašības, ko rada ražošana un kvalitātes svārstības sezonas zvejas atšķirību dēļ. Turklāt hitozāns, kas iegūts no sēnīšu avotiem, piedāvā, kā ziņots, izcilas īpašības, piemēram, viendabīgu polimēra garumu un lielāku šķīdību, salīdzinot ar hitozānu no jūras avotiem. (sal. Ghormade et al., 2017) Lai piegādātu vienotu hitozānu, hitīna ieguve no sēnīšu sugām ir kļuvusi par stabilu alternatīvu ražošanu. Chitin un citiosan ražošanu no sēnēm var viegli un uzticami sasniegt, izmantojot ultraskaņas ekstrakcijas un deacetilācijas tehnoloģiju. Intensīva ultraskaņas apstrāde traucē šūnu struktūrām atbrīvot hitīnu un veicina masas pārnesi ūdens šķīdinātājos, lai iegūtu izcilu hitīna ražu un ekstrakcijas efektivitāti. Turpmākā ultraskaņas deacetilācija pārvērš hitīnu vērtīgajā hitozānā. Gan ultraskaņas hitīna ekstrakciju, gan deacetilāciju līdz hitozānam var lineāri mērogot līdz jebkuram komerciālam ražošanas līmenim.

Ultraskaņas apstrāde pastiprina sēnīšu hitozāna ražošanu un padara ražošanu efektīvāku un ekonomiskāku.
(attēls un pētījums: © Zhu et al., 2019)

Ļoti efektīva hitozāna sintēze, izmantojot ultraskaņu

Lai pārvarētu tradicionālās ķīmiskās un fermentatīvās hitīna deacetlytion trūkumus (t.i., zemu efektivitāti, augstas enerģijas izmaksas, ilgu apstrādes laiku, toksiskus šķīdinātājus), augstas intensitātes ultraskaņa ir integrēta hitīna un hitozāna apstrādē. Augstas intensitātes ultraskaņas apstrāde un no tās izrietošā akustiskās kavitācijas ietekme izraisa strauju polimēru ķēžu šķēlumu un samazina polidispersitāti, tādējādi veicinot hitozāna sintēzi. Turklāt ultraskaņas bīdes spēki pastiprina masas pārnesi šķīdumā tā, lai tiktu uzlabota ķīmiskā, hidrolītiskā vai fermentatīvā reakcija.

Ultrasoniski atbalstīta ķīmiskā deacetilācija un depolimerizācija

Tā kā hitīns ir nereaģējošs un nešķīstošs biopolimērs, tam jāveic demineralizācijas, deproteinizācijas un depolimerizācijas / deacetilācijas procesa posmi, lai iegūtu šķīstošu un bioacesublu hitozānu. Šie procesa posmi ietver ārstēšanu ar spēcīgām skābēm, piemēram, HCl un spēcīgām bāzēm, piemēram, NaOH un KOH. Tā kā šie tradicionālie procesa posmi ir neefektīvi, lēni un prasa augstas enerģijas, procesa intensifikācija ar ultraskaņu ievērojami uzlabo hitozāna ražošanu. Jaudas ultraskaņas izmantošana palielina hitozāna ražu un kvalitāti, samazina procesu no dienām līdz dažām stundām, ļauj vieglāk šķīdinātājiem un padara visu procesu energoefektīvāku.

Ultrasoniski uzlabota Chitin deproteinizācija

Vallejo-Dominguez et al. (2021) savā izmeklēšanā par hitīna deproteinizāciju konstatēja, ka "ultraskaņas piemērošana biopolimēru ražošanai samazināja olbaltumvielu saturu, kā arī hitīna daļiņu lielumu. Hitozāns ar augstu deacetilācijas pakāpi un vidēju molekulmasu tika ražots, izmantojot ultraskaņas palīdzību.

Ultraskaņas hidrolīze chitin depolimerizācijai

Ķīmiskai hidrolīzei hitīna deacetilācijai izmanto vai nu skābes, vai sārmus, tomēr plašāk izmanto sārmu deacetilāciju (piemēram, nātrija hidroksīdu NaOH). Skābes hidrolīze ir alternatīva metode tradicionālajai ķīmiskajai deacetilācijai, kur hitīna un hitozāna depolimerizēšanai izmanto organisko skābes šķīdumus. Skābes hidrolīzes metodi galvenokārt izmanto, ja hitīna un hitozāna molekulmasai jābūt viendabīgai. Šo parasto hidrolīzes procesu sauc par lēnu un energoefektīvu un rentablāku. Prasība pēc spēcīgām skābēm, augstām temperatūrām un spiediena ir faktori, kas hidrolītiskā hitozāna procesu pārvērš ļoti dārgā un laikietilpīgā procedūrā. Izmantotajām skābēm ir vajadzīgi pakārtoti procesi, piemēram, neitralizācija un atsāļošana.
Integrējoties lieljaudas ultraskaņas hidrolīzes procesā, temperatūras un spiediena prasības hitīna un hitozāna hidrolītiskai šķelšanai var ievērojami samazināt. Turklāt ultraskaņas apstrāde ļauj samazināt skābes koncentrāciju vai izmantot maigākas skābes. Tas padara procesu ilgtspējīgāku, efektīvāku, rentablāku un videi draudzīgāku.

Ultrasoniski atbalstīta ķīmiskā deacetilācija

Hitīna un hitozāna ķīmisko sairšanu un deakteilāciju galvenokārt panāk, ārstējot hitīnu vai hitozānu ar minerālskābēm (piemēram, sālsskābi HCl), nātrija nitrītu (NaNO₂) vai ūdeņraža peroksīdu (H₂O₂). Ultraskaņa uzlabo deacetilācijas ātrumu, tādējādi saīsinot reakcijas laiku, kas nepieciešams, lai iegūtu mērķtiecīgu deacetilācijas pakāpi. Tas nozīmē, ka ultraskaņas apstrāde samazina nepieciešamo apstrādes laiku 12-24 stundas līdz dažām stundām. Turklāt ultraskaņas apstrāde ļauj ievērojami samazināt ķīmisko koncentrāciju, piemēram, 40% (w/w) nātrija hidroksīdu, izmantojot ultraskaņu, bet 65% (w/ w) ir nepieciešami, neizmantojot ultraskaņu.

Ultraskaņas-fermentatīvā deacetilācija

Lai gan fermentatīvā deacetilācija ir viegla, videi labvēlīga apstrādes forma, tās efektivitāte un izmaksas ir neekonomiskas. Sakarā ar sarežģītu, darbietilpīgu un dārgu pakārtoto fermentu izolāciju un attīrīšanu no galaprodukta, fermentatīvā hitīna deacetilācija netiek īstenota komerciālā ražošanā, bet tiek izmantota tikai zinātniskās pētniecības laboratorijā.
Ultraskaņas pirmapstrāde pirms fermentatīvās deacetlytation fragmenti hitīna molekulas tādējādi paplašinot virsmas laukumu un padarot vairāk virsmas pieejamu fermentiem. Augstas veiktspējas ultraskaņas apstrāde palīdz uzlabot fermentatīvo deacetilāciju un padara procesu ekonomiskāku.

Pētījumu rezultāti ultraskaņas hitīnam un hitozāna deacetilācijai

Zhu et al. (2018) savā pētījumā secina, ka ultraskaņas deacetilācija ir izrādījusies izšķirošs sasniegums, pārveidojot β-hitīnu hitozānā ar 83–94% deacetilāciju pazeminātās reakcijas temperatūrās. Kreisajā attēlā redzams ultrasoniski deacetilēta hitozāna SEM attēls (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: ml) (attēls un pētījums: © Zhu et al., 2018)
NaOH šķīdums (20 w/v %) tika sagatavots, izšķīdinot NaOH pārslas DI ūdenī. Pēc tam sārmu šķīdumu centrifūgas mēģenē pievieno GLSP nogulsnēm (0,5 g) ar cietā šķidruma attiecību 1:20 (g: ml). Hitozāns tika pievienots NaCl (40 ml, 0,2 M) un etiķskābei (0,1 M) ar šķīduma tilpuma attiecību 1:1. Pēc tam suspensija tika pakļauta ultraskaņai vieglā temperatūrā 25 ° C 60 minūtes, izmantojot zondes tipa ultrasonikatoru (250W, 20kHz). (sal. ar Zhu et al., 2018)
Pandit et al. (2021) konstatēja, ka hitozāna šķīdumu noārdīšanās ātrumu reti ietekmē polimēra šķīdināšanas skābes koncentrācija, un lielā mērā tas ir atkarīgs no ultraskaņas viļņu temperatūras, intensitātes un polimēra izšķīdināšanas izmantotās vides jonu stipruma. (sal. ar Pandit et al., 2021)

Citā pētījumā Zhu et al. (2019) izmantoja Ganoderma lucidum sporu pulverus kā sēnīšu izejvielu un pētīja ultrasoniski atbalstītu deacetilāciju un apstrādes parametru, piemēram, ultraskaņas apstrādes laika, cietās un šķidrās attiecības, NaOH koncentrācijas un apstarošanas jaudas ietekmi uz hitozāna deacetilācijas (DD) pakāpi. Augstākā DD vērtība tika iegūta šādos ultraskaņas parametros: 20 min ultraskaņas apstrāde pie 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Ultrasoniski iegūtā hitozāna virsmas morfoloģija, ķīmiskās grupas, termiskā stabilitāte un kristalitāte tika pārbaudīta, izmantojot SEM, FTIR, TG un XRD. Pētnieku grupa ziņo par ultrasoniski ražotā hitozāna deacetilācijas (DD), dinamiskās viskozitātes ([η]) un molekulmasas (Mv ¹) būtisku pastiprināšanos. Rezultāti uzsvēra sēņu ultraskaņas deacetilācijas tehniku ļoti spēcīgu hitozāna ražošanas metodi, kas ir piemērota biomedicīnas lietojumiem. (sal. ar Zhu et al., 2019)

SEM attēli ar hitīniem un hitozāniem no divām sēņu sugām: a) Chitin no L. vellereus; b) Hitīns no P. ribis; c) hitozāns no L.vellereus; d) hitozāns no P. ribis.
attēls un pētījums: © Erdoğan et al., 2017

Izcila hitozāna kvalitāte ar ultraskaņas deacetilāciju

Ultrasoniski vadīti hitīna / hitozāna ekstrakcijas un depolimerizācijas procesi ir precīzi kontrolējami, un ultraskaņas procesa parametrus var pielāgot izejvielām un mērķa galaprodukta kvalitātei (piemēram, molekulmasa, deacetilācijas pakāpe). Tas ļauj pielāgot ultraskaņas procesu ārējiem faktoriem un noteikt optimālus parametrus izcilam rezultātam un efektivitātei.
Ultrasoniski deacetilēts hitozāns parāda lielisku biopieejamību un biosaderību. Kad ultrasoniski sagatavotus hitozāna biopolimērus salīdzina ar termiski iegūtu hitozānu attiecībā uz biomedicīnas īpašībām, ultrasoniski ražotajam hitozānam ir ievērojami uzlabota fibroblasta (L929 šūnu) dzīvotspēja un uzlabota antibakteriālā aktivitāte gan Escherichia coli (E. coli), gan Staphylococcus aureus (S. aureus).
(sal. ar Zhu et al., 2018)

Kā darbojas chitin ultraskaņas ekstrakcija un deacetilācija?

Kad jaudas ultraskaņas viļņi ir pāri šķidrumā vai vircā (piemēram, suspensija, kas sastāv no hitīna šķīdinātājā), ultraskaņas viļņi pārvietojas caur šķidrumu, izraisot mainīgus augstspiediena / zema spiediena ciklus. Zema spiediena ciklu laikā tiek radīti minūšu vakuuma burbuļi (tā sauktie KAVITĀCIJAS burbuļi), kas aug vairākos spiediena ciklos. Noteiktā izmērā, kad burbuļi nevar absorbēt vairāk enerģijas, augstspiediena cikla laikā tie vardarbīgi. Burbuļu sabrukumu raksturo intensīvi KAVITĀCIJAS (vai sonomehāniski) spēki. Šie sonomehāniskie apstākļi lokāli rodas KAVITĀCIJAS karstajā punktā, un tos raksturo ļoti augsta temperatūra un spiediens attiecīgi līdz 4000K un 1000atm; kā arī atbilstošas augstas temperatūras un spiediena starpības. Tiek ģenerētas furtehrmore, mikroturbulences un šķidruma plūsmas ar ātrumu līdz 100m/s. Chitīna un hitozāna ultraskaņas ekstrakciju no sēnēm un vēžveidīgajiem, kā arī hitīna depolimerizāciju un deacetilāciju galvenokārt izraisa sonomechanical iedarbība: uzbudinājums un turbulences traucē šūnas un veicina masas pārnesi, kā arī var sagriezt polimēru ķēdes kombinācijā ar skābiem vai sārmainiem šķīdinātājiem.
Hitīna ekstrakcijas darbības princips ar ultrasonication: Ultraskaņas ekstrakcija efektīvi salauž sēņu šūnu struktūru un atbrīvo intracelulāros savienojumus no šūnu sienas un šūnu interjera (t.i., polisaharīdus, piemēram, hitīnu un hitozānu un citas bioloģiski aktīvas fitoķīmiskās vielas) šķīdinātājā. Ultraskaņas ekstrakcija ir balstīta uz akustiskās kavitācijas darba principu. Ultraskaņas / akustiskās kavitācijas ietekme ir augstas bīdes spēki, turbulences un intensīvi spiediena diferenciāļi. Šie sonomehāniskie spēki salauž šūnu struktūras, piemēram, chitinous sēņu šūnu sienas, veicina masas pārnesi starp sēnīšu biomateriālu un šķīdinātāju un rada ļoti augstu ekstrakta ražu ātrā procesā. Turklāt ultraskaņas apstrāde veicina ekstraktu sterilizāciju, nogalinot baktērijas un mikrobus. Mikrobu inaktivācija ar ultraskaņu ir rezultāts destruktīvajiem kavitācijas spēkiem šūnu membrānā, brīvo radikāļu ražošanai un lokalizētai apkurei.
Depolimerizācijas un deacetilācijas darbības princips ar ultrasonication: Polimēru ķēdes tiek nozvejotas bīdes laukā ap burbuli, un polimēra spoles ķēdes segmenti pie sabrukšanas dobuma pārvietosies ar lielāku ātrumu nekā tie, kas atrodas tālāk. Pēc tam polimēru ķēdē rodas spriegumi polimēru segmentu un šķīdinātāju relatīvās kustības dēļ, un tie ir pietiekami, lai izraisītu šķelšanos. Tādējādi process ir līdzīgs citiem bīdes efektiem polimēru šķīdumos ~2° un dod ļoti līdzīgus rezultātus. (sal. ar Cenu un a., 1994. gadu)

Augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtas sēnīšu hitīna un hitozāna apstrādei

Skenējot elektronu mikroskopijas (SEM) attēlus 100 × a) gladius, b) ar ultraskaņu apstrādāts gladius, c) β-hitīna, d) ar ultraskaņu apstrādāta β-hitīna un e) hitozāns (avots: Preto et al. 2017)

Hitīna fragmentācija un hititīna deketilācija hitozānam prasa jaudīgu un uzticamu ultraskaņas aprīkojumu, kas var nodrošināt augstas amplitūdas, piedāvā precīzu procesa parametru vadāmību un var darboties 24/7 ar lielu slodzi un prasīgā vidē. Hielscher Ultrasonics produktu klāsts uzticami atbilst šīm prasībām. Papildus izcilai ultraskaņas veiktspējai Hielscher ultraskaņas aparāti lepojas ar augstu enerģijas efektivitāti, kas ir būtiska ekonomiska priekšrocība – jo īpaši, ja to izmanto komerciālā liela mēroga ražošanā.
Hielscher ultrasonicators ir augstas veiktspējas sistēmas, kuras var aprīkot ar piederumiem, piemēram, sonotrodes, pastiprinātāji, reaktori vai plūsmas šūnas, lai optimāli atbilstu jūsu procesa vajadzībām. Ar digitālo krāsu displeju tiek nodrošināta iespēja iepriekš iestatīt ultraskaņas skrējienus, automātisku datu ierakstīšanu integrētā SD kartē, tālvadības pārlūka vadību un daudzas citas funkcijas, augstāko procesa kontroli un lietotājdraudzīgumu. Pārī ar robustumu un lielu nestspēju, Hielscher ultraskaņas sistēmas ir jūsu uzticams darba zirgs ražošanā. 
Hitīna fragmentācija un deacetilācija prasa spēcīgu ultraskaņu, lai iegūtu mērķtiecīgu pārveidošanu un galīgo augstas kvalitātes hitozāna produktu. Īpaši hitīna pārslu fragmentācijai un depolimerizācijas / deacetilācijas soļiem, augstām amplitūdām un paaugstinātam spiedienam ir izšķiroša nozīme. Hielscher Ultrasonics rūpnieciskie ultraskaņas procesori viegli nodrošina ļoti augstas amplitūdas. Amplitūdas līdz 200 μm var nepārtraukti darbināt 24/7 darbībā. Vēl augstākām amplitūdām ir pieejami pielāgoti ultraskaņas sonotrodes. Hielscher ultraskaņas sistēmu jauda ļauj efektīvi un ātri deacetilēt drošā un lietotājam draudzīgā procesā.
Zemāk redzamā tabula sniedz norādes par mūsu ultraskaņas aparātu aptuveno apstrādes jaudu: