ამილოიდური ფიბრილის ფორმირება UIP400MTP მიკროპლატის სონიკატორის გამოყენებით

ამილოიდური ფიბრილები, ისევე როგორც კრისტალები, ნუკლეაციისა და შემდგომი ზრდის პროცესით წარმოიქმნება. თუმცა, ნუკლეაციის თავისუფალი ენერგიის მაღალი ბარიერის გამო, ამილოიდური ფიბრილების სპონტანური წარმოქმნა მხოლოდ ხანგრძლივი ლაგ-ფაზის შემდეგ ხდება. ულტრაბგერითი დამუშავება ამილოიდის ნუკლეაციის ინდუცირების მძლავრი საშუალებაა და ამით მნიშვნელოვნად აჩქარებს ფიბრილების წარმოქმნას. თიოფლავინ T-ის (ThT) ფლუორესცენციის გამოყენებით მიკროპლანშეტის წამკითხველთან კომბინაციაში, ულტრაბგერითი დამუშავება მრავალ ნიმუშში ამილოიდური ფიბრილების ერთდროული, მაღალი წარმადობით გამოვლენის საშუალებას იძლევა.

ულტრაბგერით ინდუცირებული ამილოიდური ფიბრილების წარმოქმნა UIP400MTP მიკროპლანშეტის სონიკატორით

UIP400MTP მრავალფოსოიანი პლანშეტის სონიკატორით კვლევითი მიზნებისთვის შესაძლებელია ერთნაირი ხარისხის ამილოიდური ფიბრილების დიდი რაოდენობით სწრაფად სინთეზირება. ეს ეფექტური მიდგომა ცილის ამილოიდოგენურობის შესწავლის საშუალებას იძლევა. ეს ტექნიკა ხელს უწყობს სწრაფ და განმეორებად ამილოიდურ ფიბრილაციას, როგორც ნაჩვენებია β2-მიკროგლობულინის (β2-m) მაგალითზე, რომელიც დიალიზთან დაკავშირებულ ამილოიდოზთან ასოცირებული ამილოიდოგენური ცილაა.

მარტივი ექსპერიმენტული მიდგომა: ულტრაბგერით გამოწვეული ამილოიდური ფიბრილაცია

ფიბრილების წარმოქმნის გამოსაწვევად 96-ფოსოიანი მიკროპლანშეტი მოათავსეს UIP400MTP მრავალფოსოიანი პლანშეტის სონიკატორის ცენტრში, რომელიც ყველა ფოსოში თანაბარ ულტრაბგერით ზემოქმედებას უზრუნველყოფს. ექსპერიმენტული პირობები იყო შემდეგი:

1. თითოეული ფოსო შეიცავდა 0,2 მლ β2-მიკროგლობულინის ხსნარს (0,3 მგ/მლ, pH 2,5), რომელსაც დამატებული ჰქონდა 5 μM ThT.
2. პლანშეტი ექვემდებარებოდა ულტრაბგერითი დამუშავების ციკლებს, მაგალითად, 1-წუთიან ულტრაბგერით დამუშავებას, რომელსაც მოჰყვებოდა 9-წუთიანი პაუზა.
3. სონიკაციის შემდეგ ThT ფლუორესცენცია გაზომილი იყო მიკროპლანშეტის წამკითხველის გამოყენებით.

(შდრ. So et al., 2011)

შედარება ჩვეულებრივ მექანიკურ შერევასთან

ტრადიციული მექანიკური შერევის მეთოდებთან შედარებით, ულტრაბგერითმა დამუშავებამ მკვეთრად შეამცირა ფიბრილების წარმოქმნის ლაგ-ფაზა. მიკროპლანშეტის ჩვეულებრივი შენჯღრევის პირობებში, 10 ფოსოდან მხოლოდ 1-ში აღინიშნა ThT-ის ფლუორესცენციის ზრდა 20 საათის შემდეგ. ამის საპირისპიროდ, ციკლური ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენებისას (15 წუთი ულტრაბგერითი დამუშავება, რასაც მოჰყვებოდა 5 წუთი მოსვენება), ThT-ის ფლუორესცენციის მნიშვნელოვანი მატება გამოვლინდა უშუალოდ პირველი ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ.

ფიბრილაციის კინეტიკის სწრაფი აჩქარება

So et al.-ის (2011) მიერ მიღებულმა შედეგებმა აჩვენა, რომ pH 2,5-ზე β2-მიკროგლობულინის სპონტანური ფიბრილების წარმოქმნისთვის საჭირო დრო ულტრაბგერითი დამუშავებით შეიძლება რამდენიმე საათიდან სულ რაღაც 10–15 წუთამდე შემცირდეს.
ატომურ-ძალური მიკროსკოპიის (AFM) გამოსახულებებმა დაადასტურა, რომ ყოველ 15 წუთში 10-წუთიანი ულტრაბგერითი დამუშავებით წარმოქმნილი ფიბრილები მორფოლოგიურად არ განსხვავდებოდა ყოველ 10 წუთში 1-წუთიანი ულტრაბგერითი დამუშავებით წარმოქმნილი ფიბრილებისგან. ეს ხაზს უსვამს ულტრაბგერით გამოწვეული ამილოიდური ფიბრილაციის განმეორებადობასა და საიმედოობას.

ამილოიდური ფიბრილების AFM გამოსახულებები, რომლებიც მიღებულია ყოველ 10 წუთში 1-წუთიანი ულტრაბგერითი დამუშავებით (i), ყოველ 15 წუთში 10-წუთიანი ულტრაბგერითი დამუშავებით (ii) და დათესვის რეაქციით ულტრაბგერითი დამუშავების გარეშე (iii). თეთრი მასშტაბის ზოლი შეესაბამება 1 მკმ-ს.
კვლევა და სურათები: ©So et al., 2011

ფიბრილაცია ნეიტრალურ pH პირობებში

ნეიტრალური pH-ის პირობებშიც კი ფიბრილების წარმოქმნა მიღწეული იყო 1,5-საათიანი ლაგ-ფაზის შემდეგ, რაც ადასტურებს, რომ ულტრაბგერითი დამუშავება მნიშვნელოვნად ამცირებს ნუკლეაციისა და ზრდის ენერგეტიკულ ბარიერს. ეს დამატებით ამყარებს ჰიპოთეზას, რომ ამილოიდური ფიბრილაცია ძირითადად ფიზიკური რეაქციაა, რომელსაც დიდწილად ნუკლეაციის ენერგეტიკული ბარიერი ზღუდავს, ხოლო ულტრაბგერითი დამუშავება ამ ბარიერს ეფექტურად ამცირებს.

გავლენა ამილოიდთან დაკავშირებულ დაავადებათა კვლევაზე

UIP400MTP მიკროპლანშეტის სონიკატორის გამოყენებით ამილოიდური ფიბრილების მარტივ და საიმედო წარმოქმნას მნიშვნელოვანი როლი აქვს ალცჰეიმერის დაავადების (AD) და ამილოიდთან დაკავშირებული სხვა დარღვევების, როგორიცაა პარკინსონის დაავადება, II ტიპის დიაბეტი და სისტემური ამილოიდოზები, კვლევაში. AD-ის დროს ამილოიდ-β-ის (Aβ) აგრეგაცია ძირითადი პათოლოგიური ნიშანია, თუმცა მისი ფიბრილაციის კინეტიკის შესწავლა კვლავ რთულია ხანგრძლივი ლაგ-ფაზებისა და ჩვეულებრივი მეთოდების შედეგების ცვალებადობის გამო. ულტრაბგერითი დამუშავებით გამოწვეული ფიბრილების წარმოქმნა აჩქარებს ნუკლეაციას, უზრუნველყოფს მაღალ განმეორებადობას და ამცირებს ცვალებადობას, რაც გადამწყვეტია პოტენციური ინჰიბიტორების სკრინინგისა და ამილოიდოგენური მექანიზმების გაგებისთვის. გარდა ამისა, UIP400MTP-ის მაღალი წარმადობა ცილების არასწორი დაკეცვისა და აგრეგაციის ფართომასშტაბიანი კვლევის საშუალებას იძლევა, რაც ხელს უწყობს ისეთი თერაპიული აგენტების აღმოჩენას, რომლებსაც შეუძლიათ ფიბრილების წარმოქმნის მოდულირება და პოტენციურად ნეიროდეგენერაციული პროცესის პროგრესირების შენელება.

ეს კვლევა ადასტურებს, რომ UIP400MTP მრავალფოსოიანი პლანშეტის სონიკატორით ულტრაბგერითი დამუშავება ამილოიდური ფიბრილების წარმოქმნის დასაჩქარებლად უაღრესად ეფექტური მეთოდია. ამ მიდგომის ძირითადი უპირატესობები მოიცავს:

• ფიბრილაციის შეფერხების დროის მკვეთრი შემცირება.
• თანაბარი ულტრაბგერითი ზემოქმედება ყველა ფოსოში, რაც ფიბრილების განმეორებად წარმოქმნას უზრუნველყოფს.
• მაღალი წარმადობის სკრინინგის შესაძლებლობა, რაც მას შესაფერისს ხდის ცილების ამილოიდოგენურობის ძიებისთვის მთელი გენომის მასშტაბით.

ულტრაბგერითი დამუშავების ThT-ის ფლუორესცენციის გამოვლენასთან ინტეგრაციით, ეს მეთოდი უზრუნველყოფს სწრაფ, მასშტაბირებად და საიმედო პლატფორმას ამილოიდური ფიბრილაციის შესასწავლად. მისი ეფექტურობისა და მაღალი წარმადობის პოტენციალის გათვალისწინებით, ამ მიდგომამ შეიძლება გააადვილოს ამილოიდური ფიბრილების სინთეზი ბიოფიზიკური და ფარმაცევტული კვლევისთვის და პერსპექტიული ინსტრუმენტი გახდეს ამილოიდთან დაკავშირებული კვლევებისა და წამლების სკრინინგისთვის.