ამილოიდური ფიბრილის ფორმირება UIP400MTP მიკროპლატის სონიკატორის გამოყენებით

ამილოიდური ფიბრილები, ისევე როგორც კრისტალები, წარმოიქმნება ბირთვების და შემდგომი ზრდის პროცესში. თუმცა, ბირთვების მაღალი თავისუფალი ენერგიის ბარიერის გამო, ამილოიდური ფიბრილის სპონტანური ფორმირება ხდება მხოლოდ ხანგრძლივი ჩამორჩენის ფაზის შემდეგ. ულტრაბგერითი გამოვლინდა, როგორც ძლიერი ინსტრუმენტი ამილოიდის ნუკლეაციის ინდუქციისთვის, რითაც მნიშვნელოვნად აჩქარებს ფიბრილების წარმოქმნას. თიოფლავინის T (ThT) ფლუორესცენციის გამოყენებით მიკროპლატის მკითხველთან შერწყმისას, ულტრაბგერითი გამოვლენის საშუალებას იძლევა ამილოიდური ფიბრილების მაღალი გამტარუნარიანობის გამოვლენა მრავალ ნიმუშში ერთდროულად.

ულტრაბგერითი ინდუცირებული ამილოიდური ფიბრილის ფორმირება UIP400MTP მიკროპლეტის სონიკატორით

UIP400MTP მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორით, ამილოიდური ფიბრილების იგივე ხარისხის დიდი რაოდენობით შეიძლება სწრაფად სინთეზირებული იყოს კვლევის მიზნებისთვის. ეს ეფექტური მიდგომა იძლევა ცილის ამილოიდოგენურობის შესწავლის საშუალებას. ეს ტექნიკა ხელს უწყობს ამილოიდის სწრაფ და რეპროდუცირებად ფიბრილაციას, როგორც ეს ნაჩვენებია β2-მიკროგლობულინით (β2-m), ამილოიდოგენური ცილა, რომელიც ასოცირდება დიალიზთან დაკავშირებულ ამილოიდოზთან.

მარტივი ექსპერიმენტული მიდგომა: ულტრაბგერითი გამოწვეული ამილოიდური ფიბრილაცია

ფიბრილების წარმოქმნის გამოწვევის მიზნით, 96 ჭაბურღილი მოთავსდა UIP400MTP მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორის ცენტრში, რომელიც უზრუნველყოფს ულტრაბგერითი ზემოქმედების ერთგვაროვან ზემოქმედებას ყველა ჭაში. ექსპერიმენტული პირობები იყო შემდეგი:

1. თითოეული ჭაბურღილი შეიცავდა 0,2 მლ β2-მიკროგლობულინის ხსნარს (0,3 მგ/მლ, pH 2,5) დამატებული 5 μM ThT-ით.
2. ფირფიტას დაექვემდებარა ულტრაბგერითი ციკლები, როგორიცაა 1 წუთიანი ულტრაბგერითი გამოკვლევის შემდეგ 9 წუთიანი პაუზა.
3. სონიკაციის შემდგომ, ThT ფლუორესცენცია გაზომილი იყო მიკროპლატის წამკითხველის გამოყენებით.

(შდრ. So et al., 2011)

შედარება ჩვეულებრივ აგიტაციასთან

ტრადიციულ აგიტაციის მეთოდებთან შედარებით, ულტრაბგერითი გამოკვლევით მკვეთრად ამცირებს ფიბრილების წარმოქმნის ჩამორჩენის ფაზას. ჩვეულებრივი მიკროფირფიტის შერყევის პირობებში, 10 ჭაბურღილიდან მხოლოდ 1-მა აჩვენა გაზრდილი ThT ფლუორესცენცია 20 საათის შემდეგ. ამის საპირისპიროდ, ციკლური ულტრაბგერითი გამოკვლევის გამოყენებით (15 წუთიანი ხმოვანი გამოსხივება, რასაც მოჰყვება 5 წუთიანი სიმშვიდე), ThT ფლუორესცენციის მნიშვნელოვანი მატება გამოვლინდა პირველი გაჟღერებით მკურნალობის შემდეგ.

ფიბრილაციის კინეტიკის სწრაფი აჩქარება

მიღებული შედეგები So et al. (2011) აჩვენა, რომ β2-მიკროგლობულინის სპონტანური ფიბრილის წარმოქმნა pH 2,5-ზე შეიძლება დაჩქარდეს რამდენიმე საათიდან სულ რაღაც 10-15 წუთამდე ულტრაბგერითი გამოკვლევით.
ატომური ძალის მიკროსკოპის (AFM) სურათებმა დაადასტურა, რომ ყოველ 15 წუთში 10-წუთიანი ულტრაბგერითი გამომუშავების შედეგად წარმოქმნილი ფიბრილები მორფოლოგიურად არ განსხვავდებოდა მათგან, რომლებიც წარმოიქმნებოდა 1 წუთიანი ულტრაბგერითი ყოველ 10 წუთში. ეს ხაზს უსვამს ულტრაბგერითი გამოწვეულ ამილოიდური ფიბრილაციის განმეორებადობას და გამძლეობას.

ამილოიდური ფიბრილების AFM გამოსახულებები, რომლებიც წარმოიქმნება 1-წუთიანი ულტრაბგერითი გამოკვლევით ყოველ 10 წუთში (i), 10-წთ-სონიკიციით ყოველ 15 წუთში (ii) და დათესვის რეაქციით ულტრაბგერითი გამოკვლევის გარეშე (iii). თეთრი მასშტაბის ზოლი წარმოადგენს 1 მკმ-ს.
კვლევა და სურათები: ©So et al., 2011

ფიბრილაცია ნეიტრალურ pH პირობებში

ნეიტრალურ pH პირობებშიც კი, ფიბრილების ფორმირება მიიღწევა 1,5 საათის შეფერხების შემდეგ, რაც ადასტურებს, რომ ულტრაბგერითი მოქმედება მნიშვნელოვნად აქვეითებს ენერგეტიკულ ბარიერს ნუკლეაციისა და ზრდისთვის. ეს შემდგომში მხარს უჭერს ჰიპოთეზას, რომ ამილოიდური ფიბრილაცია, ძირითადად, ფიზიკური რეაქციაა, დიდწილად შეზღუდული ბირთვული ენერგიის ბარიერით, რომელსაც ულტრაბგერითი ეფექტი ეფექტურად ამცირებს.

გავლენა ამილოიდთან დაკავშირებულ დაავადებათა კვლევაზე

ამილოიდური ფიბრილების მარტივი და საიმედო ფორმირება UIP400MTP მიკროპლატის სონიკატორის გამოყენებით მნიშვნელოვან გავლენას ახდენს ალცჰეიმერის დაავადების (AD) კვლევაზე და ამილოიდთან დაკავშირებულ სხვა დარღვევებზე, როგორიცაა პარკინსონის დაავადება, II ტიპის დიაბეტი და სისტემური ამილოიდოზი. AD-ში, ამილოიდი-β (Aβ) აგრეგაცია არის ძირითადი პათოლოგიური მახასიათებელი, მაგრამ მისი ფიბრილაციის კინეტიკის შესწავლა კვლავ რთულია ხანგრძლივი ჩამორჩენის ფაზებისა და ჩვეულებრივი მეთოდების ცვალებადობის გამო. ულტრაბგერითი ფიბრილის ფორმირება აჩქარებს ნუკლეაციას, უზრუნველყოფს მაღალ რეპროდუქციულობას და შემცირებულ ცვალებადობას, რაც გადამწყვეტია პოტენციური ინჰიბიტორების სკრინინგისთვის და ამილოიდოგენური მექანიზმების გასაგებად. გარდა ამისა, UIP400MTP-ის მაღალი გამტარუნარიანობის შესაძლებლობას იძლევა ფართომასშტაბიანი გამოკვლევები ცილების არასწორი დაკეცვისა და აგრეგაციის შესახებ, რაც ხელს უწყობს თერაპიული აგენტების აღმოჩენას, რომლებსაც შეუძლიათ ფიბრილების ფორმირების მოდულირება და პოტენციურად შეამსუბუქონ ნეიროდეგენერაციული პროგრესირება.

ეს კვლევა ადგენს ულტრაბგერითი გამომუშავებას UIP400MTP მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორის გამოყენებით, როგორც უაღრესად ეფექტური მეთოდი ამილოიდური ფიბრილის წარმოქმნის დასაჩქარებლად. ამ მიდგომის ძირითადი უპირატესობები მოიცავს:

• ფიბრილაციის შეფერხების დროის მკვეთრი შემცირება.
• ერთიანი ულტრაბგერითი ზემოქმედება ყველა ჭაბურღილზე, რაც საშუალებას იძლევა რეპროდუცირებადი ფიბრილის ფორმირება.
• მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგის შესაძლებლობა, რაც მას შესაფერისს ხდის პროტეინის ამილოიდოგენურობის გენომის ფართო ძიებისთვის.

ულტრაბგერითი ThT ფლუორესცენციის გამოვლენასთან ინტეგრაციით, ეს მეთოდი უზრუნველყოფს სწრაფ, მასშტაბურ და საიმედო პლატფორმას ამილოიდური ფიბრილაციის შესასწავლად. მისი ეფექტურობისა და მაღალი წარმადობის პოტენციალის გათვალისწინებით, ამ მიდგომამ შეიძლება ხელი შეუწყოს ამილოიდური ფიბრილების ადვილად სინთეზს ბიოფიზიკური და ფარმაცევტული კვლევისთვის, რაც პერსპექტიულ ინსტრუმენტს გვთავაზობს ამილოიდთან დაკავშირებული კვლევებისა და წამლების სკრინინგისთვის.