PMCA პრიონების მაღალი გამტარუნარიანობის გამოვლენისთვის UIP400MTP Sonicator-ის გამოყენებით

UIP400MTP მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი გთავაზობთ ძლიერ გადაწყვეტას მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მოსამზადებლად ცილის არასწორად დაკეცვის ციკლურ გაძლიერებაში (PMCA). ენერგიის ერთგვაროვანი განაწილებით მრავალ ჭაბურღილზე და ზუსტი ხმოვანი პარამეტრების შენარჩუნებით, ეს სისტემა იძლევა მრავალი ნიმუშის ერთდროულ დამუშავებას განსაკუთრებული გამეორებით. ეს შესაძლებლობები გადამწყვეტია PMCA-ს ოპტიმიზაციისთვის, რათა აღმოაჩინოს პრიონები დაბალ კონცენტრაციებში რთულ ბიოლოგიურ ნიმუშებში, როგორიცაა ნერწყვი, სადაც ანალიზის ინჰიბიტორებს შეუძლიათ შედეგების დამალვა.

პრიონის დაავადებები, როგორიცაა ქრონიკული დაღლილობის დაავადება (CWD) საშვილოსნოს ყელში და კრეიტცფელდ-იაკობის დაავადება (CJD) ადამიანებში, არის ნეიროდეგენერაციული დარღვევები, რომლებიც გამოწვეულია არასწორად დაკეცილი პრიონის პროტეინებით (PrP).^სც). ეს დაავადებები ხშირად მოიცავს ინფექციური პრიონების დაბალ დონეს სხეულის სითხეებში, როგორიცაა ნერწყვი, სისხლი და შარდი, რაც ართულებს დიაგნოზსა და კვლევას. CWD-ის ჰორიზონტალურ გადაცემას გარემოს მატრიცებში დაყრილი პრიონებით განსაკუთრებით მნიშვნელოვანი გავლენა აქვს ველური ბუნების მართვასა და ეკოლოგიურ ჯანმრთელობაზე. ანალოგიურად, ისეთ დაავადებებში, როგორიცაა კრეიტცფელდტ-იაკობის დაავადება, ადამიანის ნიმუშებიდან არასწორად დაკეცილი პრიონის ცილების საიმედო გაძლიერება გადამწყვეტია დიაგნოსტიკის წინსვლისა და დაავადების პროგრესირების გასაგებად.

შეცვლილი PMCA პროტოკოლის გამოყენება საშუალებას იძლევა გვერდის ავლით მოხდეს საერთო ანალიზის ინჰიბიტორები (მაგ., ნერწყვში არსებული მუცინები) და მივაღწიოთ მაღალ მგრძნობელობას პრიონების გამოვლენისას, რომლებიც სხვაგვარად შეუმჩნეველი ან ორაზროვანი იქნებოდა ისეთი ტექნიკის გამოყენებით, როგორიცაა რეალურ დროში რხევით გამოწვეული კონვერტაცია (RT-QuIC). ეს მიღწევები აძლიერებს პრიონის გამოვლენას სხვადასხვა დაავადებისთვის, რაც PMCA-ს შეუცვლელ ინსტრუმენტად აქცევს პრიონის კვლევისა და დიაგნოსტიკისთვის. მრავალ ჭაბურღილის სონიკატორი UIP400MTP ხელს უწყობს მაღალი გამტარუნარიანობის PMCA-ს გაჟღერებას მრავალი ნიმუშის მიკროფირფიტებში (მაგ. 6-, 24-, ან 96 ჭაბურღილის ფირფიტებში) ან ფლაკონებში მილის თაროში.

პროტოკოლი მაღალი გამტარუნარიანობის პროტეინის არასწორი ციკლური გაძლიერებისთვის (PMCA)

შემდეგი პროტოკოლი იძლევა ნიმუშების მაღალი რაოდენობის ეფექტურ დამუშავებას ზუსტად იმავე პირობებში, მტკიცე კვლევის შედეგებისთვის.

ნიმუშის მომზადება

საწყისი მასალა:
ნიმუშების მომზადება შემდეგნაირად:

• სარკოსილის ექსტრაქციის მარცვლების ხელახალი შეჩერება PMCA სუბსტრატში.
• ტვინის ჰომოგენატების ან სისხლის ნიმუშების უშუალოდ გაჟონვა პრიონის თესლით.

სუბსტრატი:

• გამოიყენეთ 10% (wt/vol) ტვინის ჰომოგენატი, რომელიც მომზადებულია ტრანსგენური თაგვებისგან, რომლებიც ზედმეტად გამოხატავენ PrP-ს.^C (მაგ., Tg თაგვები).
• ტვინის ქსოვილის ჰომოგენიზაცია:
  – 1× PBS.
  – 150 მმ NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• შეინახეთ სუბსტრატი გამოყენებამდე -80ºC ტემპერატურაზე.

ნიმუშის დაყენება მიკროფირფიტში ან მილებში:
მილები:

• დაამატეთ 90 μL ტვინის ჰომოგენატის სუბსტრატი და დათესეთ 10 μL ნიმუშით (მაგ. სისხლი, ტვინის ჰომოგენატი ან სარკოსილის მარცვლები).
• მოათავსეთ 3 ტეფლონის მძივი (1,59 მმ ან 2,38 მმ დიამეტრი) თითოეულ 0,2 მლ მილში.
• დაამონტაჟეთ მილები თაროზე, რომელიც თავსებადია UIP400MTP sonicator-თან.

6 ჭაბურღილის მიკროფილა:

• დაამატეთ 5 მლ ტვინის ჰომოგენატის სუბსტრატი და თესლი 500 μL ნიმუშით თითო ჭაბურღილში.
• თითოეულ ჭას დაამატეთ 3 ტეფლონის მძივები.

PMCA პროცედურა

განთავსება:
მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით მოათავსეთ მილის თარო ან 6 ჭაბურღილის მიკროფილა UIP400MTP სონიკატორში.

ველოსიპედის პროგრამა:
შეასრულეთ PMCA 144 ციკლი შემდეგნაირად:

• ინკუბაცია: 29 წუთი და 30 წამი 37°C ტემპერატურაზე.
• Sonication: 30 წამი 60% ამპლიტუდაზე.
• ტემპერატურის მონიტორინგი: გამოიყენეთ ჩამრთველი ტემპერატურის სენსორი ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგისთვის და UIP400MTP მაქსიმუმზე დასაპროგრამებლად. ტემპერატურა 48-50°C.

შემდგომი რაუნდები:
144 ციკლის პირველი რაუნდის დასრულების შემდეგ, გადაიტანეთ გაძლიერებული მასალის ალიქვოტი:

• განზავდეს 10-ჯერ ახალ ტრანსგენურ თაგვის ტვინის ჰომოგენატულ სუბსტრატში.
• შეასრულეთ 96 PMCA ციკლი მომდევნო რაუნდებისთვის, იგივე ბგერითი პარამეტრების შენარჩუნებით.
• განაგრძეთ რაუნდების სასურველი რაოდენობა (ჩვეულებრივ 5-მდე).

PrP-ის გამოვლენა^სც

1. პროტეინაზა K მონელება:
   – ნიმუშების დამუშავება პროტეინაზა K-ით (50 მკგ/მლ) 37°C-ზე 1 საათის განმავლობაში.
   – შეწყვიტეთ მონელება SDS- ნიმუშის ბუფერის დამატებით და ადუღეთ 10 წუთის განმავლობაში.
2. Western Blot ანალიზი:
   – მონელებული ნიმუშების ანალიზი:
   – 6H4 ან PRC1 ანტი-PrP ანტისხეულები.
   – შეასრულეთ SDS-PAGE და გადაიტანეთ PVDF მემბრანებზე გამოსავლენად.

 

 

მეტი ნიმუშების დამუშავება უფრო ძლიერი შედეგებისთვის

UIP400MTP მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი მნიშვნელოვნად აძლიერებს პროტეინის არასწორად დაკეცვის ციკლური გაძლიერების (PMCA) ეფექტურობას და მასშტაბურობას, რაც ეხება პროცედურის ტრადიციულად შრომატევად ბუნებას. 96-მდე ნიმუშის ერთდროული დამუშავების 96 ჭაბურღილიან ფირფიტაში სისტემა აუმჯობესებს PMCA-ს სამუშაო ნაკადებს, ხოლო ყველა ჭაბურღილზე ზუსტი და ერთიანი ხმოვანი პირობების შენარჩუნებით. მაღალი გამტარუნარიანობის ეს შესაძლებლობა ამცირებს ხელით მართვას, ამცირებს შრომის ინტენსიურ ნაბიჯებს და უზრუნველყოფს გამეორებადობას, რაც მას შეუცვლელ ინსტრუმენტად აქცევს პრიონის კვლევისთვის. ქრონიკული გაფუჭების დაავადებისა თუ კრეუტცფელდ-იაკობის დაავადების გამოკვლევისას, UIP400MTP ხელს უწყობს ფართომასშტაბიან კვლევებს უფრო დიდი ეფექტურობით, რაც მკვლევარებს საშუალებას აძლევს დააკმაყოფილონ თანამედროვე დიაგნოსტიკური და სამეცნიერო აპლიკაციების მოთხოვნები.

---

---

ლიტერატურა / ლიტერატურა

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.