PMCA პრიონების მაღალი გამტარუნარიანობის გამოვლენისთვის UIP400MTP სონიკატორის გამოყენებით

UIP400MTP მრავალფოსოიანი ფირფიტის სონიკატორი გთავაზობთ ძლიერ გადაწყვეტას მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მოსამზადებლად ცილის არასწორად დაკეცვის ციკლურ გაძლიერებაში (PMCA). ენერგიის ერთგვაროვანი განაწილებით მრავალ ფოსოში და ზუსტი სონიკაციის პარამეტრების შენარჩუნებით, ეს სისტემა იძლევა მრავალი ნიმუშის ერთდროულ დამუშავებას განსაკუთრებული გამეორებადობით. ეს შესაძლებლობები გადამწყვეტია PMCA-ს ოპტიმიზაციისთვის, რათა პრიონები აღმოჩენილ იქნას დაბალ კონცენტრაციებში რთულ ბიოლოგიურ ნიმუშებში, როგორიცაა ნერწყვი, სადაც ანალიზის ინჰიბიტორებს შეუძლიათ შედეგების დამალვა.

პრიონის დაავადებები, როგორიცაა ქრონიკული გამხდრობის დაავადება (CWD) ირმისებრებში და კრეიტცფელდ-იაკობის დაავადება (CJD) ადამიანებში, არის ნეიროდეგენერაციული დარღვევები, რომლებიც გამოწვეულია არასწორად დაკეცილი პრიონის პროტეინებით (PrP^სც). ეს დაავადებები ხშირად მოიცავს ინფექციური პრიონების დაბალ დონეს სხეულის სითხეებში, როგორიცაა ნერწყვი, სისხლი და შარდი, რაც ართულებს დიაგნოზსა და კვლევას. CWD-ის ჰორიზონტალურ გადაცემას გარემოს მატრიცებში დაყრილი პრიონებით განსაკუთრებით მნიშვნელოვანი გავლენა აქვს ველური ბუნების მართვასა და ეკოლოგიურ ჯანმრთელობაზე. ანალოგიურად, ისეთ დაავადებებში, როგორიცაა კრეიტცფელდტ-იაკობის დაავადება, ადამიანის ნიმუშებიდან არასწორად დაკეცილი პრიონის ცილების საიმედო გაძლიერება გადამწყვეტია დიაგნოსტიკის წინსვლისა და დაავადების პროგრესირების გასაგებად.

მოდიფიცირებული PMCA პროტოკოლის გამოყენება საშუალებას იძლევა თავიდან ავიცილოთ ანალიზის გავრცელებული ინჰიბიტორების მოქმედება (მაგ., ნერწყვში არსებული მუცინების) და მივაღწიოთ მაღალ მგრძნობელობას იმ პრიონების გამოვლენისას, რომლებიც სხვაგვარად ვერ გამოვლინდებოდა ან რომელთა გამოვლენის შედეგებიც არაერთმნიშვნელოვანი იქნებოდა ისეთი მეთოდების გამოყენებით, როგორიცაა რეალურ დროში რხევით გამოწვეული კონვერსია (RT-QuIC). ეს მიღწევები აუმჯობესებს პრიონების გამოვლენას სხვადასხვა დაავადების დროს, რაც PMCA-ს შეუცვლელ ინსტრუმენტად აქცევს პრიონების კვლევისა და დიაგნოსტიკისთვის. მრავალფოსოიანი ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP ხელს უწყობს მაღალი გამტარუნარიანობის PMCA-ს მრავალი ნიმუშის ულტრაბგერითი დამუშავებით მიკროფირფიტებში (მაგ., 6-, 24- ან 96-ფოსოიან ფირფიტებში) ან სინჯარების შტატივში მოთავსებულ ფლაკონებში.

პროტოკოლი ცილის არასწორად დაკეცვის მაღალი გამტარუნარიანობის ციკლური გაძლიერებისთვის (PMCA)

შემდეგი პროტოკოლი იძლევა დიდი რაოდენობის ნიმუშების ეფექტურად დამუშავების საშუალებას ზუსტად ერთნაირ პირობებში, კვლევის სანდო შედეგების მისაღებად.

ნიმუშის მომზადება

საწყისი მასალა:
ნიმუშების მომზადება შემდეგნაირად:

• სარკოსილით ექსტრაქციის შედეგად მიღებული ნალექის რესუსპენდირება PMCA სუბსტრატში.
• ტვინის ჰომოგენატების ან სისხლის ნიმუშების უშუალოდ დათესვა პრიონის თესლით.

სუბსტრატი:

• გამოიყენეთ 10% (wt/vol) ტვინის ჰომოგენატი, რომელიც მომზადებულია ტრანსგენური თაგვებისგან, რომლებშიც ჭარბად ექსპრესირდება PrP^C (მაგ., Tg თაგვები).
• ტვინის ქსოვილის ჰომოგენიზაცია:
  – 1× PBS.
  – 150 მმოლ NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• შეინახეთ სუბსტრატი გამოყენებამდე -80ºC ტემპერატურაზე.

ნიმუშების განთავსება მიკროფირფიტაში ან სინჯარებში:
სინჯარები:

• დაამატეთ 90 μL ტვინის ჰომოგენატის სუბსტრატი და შეურიეთ 10 μL ნიმუში პრიონული გარდაქმნის ინიცირებისთვის (მაგ., სისხლი, ტვინის ჰომოგენატი ან სარკოსილით ექსტრაქციის შედეგად მიღებული ნალექი).
• მოათავსეთ 3 ტეფლონის მძივი (1,59 მმ ან 2,38 მმ დიამეტრი) თითოეულ 0,2 მლ მილში.
• მოათავსეთ სინჯარები UIP400MTP სონიკატორთან თავსებად შტატივში.

6-ფოსოიანი მიკროფირფიტა:

• დაამატეთ 5 მლ ტვინის ჰომოგენატის სუბსტრატი და დათესეთ 500 μL ნიმუშით თითო ფოსოში.
• თითოეულ ფოსოში დაამატეთ 3 ტეფლონის მძივი.

PMCA პროცედურა

განთავსება:
მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით მოათავსეთ სინჯარების შტატივი ან 6-ფოსოიანი მიკროფირფიტა UIP400MTP სონიკატორში.

ციკლური პროგრამა:
შეასრულეთ PMCA 144 ციკლი შემდეგნაირად:

• ინკუბაცია: 29 წუთი და 30 წამი 37°C ტემპერატურაზე.
• სონიკაცია: 30 წამი 60% ამპლიტუდაზე.
• ტემპერატურის მონიტორინგი: გამოიყენეთ შეერთებადი ტემპერატურის სენსორი ნიმუშის ტემპერატურის მონიტორინგისთვის და დააპროგრამეთ UIP400MTP მაქსიმალურ ტემპერატურაზე 48–50°C.

შემდგომი რაუნდები:
144 ციკლის პირველი რაუნდის დასრულების შემდეგ, გადაიტანეთ გაძლიერებული მასალის ალიქვოტი:

• განაზავეთ 10-ჯერ ტრანსგენური თაგვის ტვინის ჰომოგენატის ახალ სუბსტრატში.
• შემდგომ რაუნდებში შეასრულეთ 96 PMCA ციკლი სონიკაციის იმავე პარამეტრების შენარჩუნებით.
• განაგრძეთ რაუნდების სასურველი რაოდენობა (ჩვეულებრივ 5-მდე).

PrP-ის გამოვლენა^სც

1. მონელება პროტეინაზა K-ით:
   – ნიმუშების დამუშავება პროტეინაზა K-ით (50 მკგ/მლ) 37°C-ზე 1 საათის განმავლობაში.
   – შეწყვიტეთ მონელება SDS-ნიმუშის ბუფერის დამატებით და ადუღეთ 10 წუთის განმავლობაში.
2. Western Blot ანალიზი:
   – მონელებული ნიმუშების ანალიზისთვის გამოიყენეთ:
   – 6H4 ან PRC1 ანტი-PrP ანტისხეულები.
   – შეასრულეთ SDS-PAGE და გადაიტანეთ PVDF მემბრანებზე გამოსავლენად.

 

Hielscher UIP400MTP ყველაზე მრავალმხრივი სონიკატორია თქვენი მრავალფოსოიანი პლანშეტებისთვის, PCR პლანშეტებისა თუ ნიმუშების სინჯარებისთვის. 400 ვატის უწყვეტი ულტრაბგერითი გამომავალი სიმძლავრით იგი განკუთვნილია ისეთი პროცესებისთვის, როგორიცაა უჯრედების ლიზისი, ემულგირება, ცილების ექსტრაქცია, დნმ-ისა და რნმ-ის ფრაგმენტაცია, დეაგლომერაცია, FFPE ნიმუშებიდან ექსტრაქცია, უჯრედებისა და ბიოფირის მოცილება ან ემულგირება. UIP400MTP ულტრაბგერითი აბაზანა არ არის. იგი მაღალი ინტენსივობის თასისებრი სონოტროდია ფოკუსირებული ულტრაბგერითი დამუშავებისთვის. ეს მძლავრი უკონტაქტო სონიკატორი თქვენი სტანდარტული პლანშეტის ყველა ფოსოში თანაბარ ულტრაბგერით დამუშავებას უზრუნველყოფს. შეგიძლიათ ზუსტად აკონტროლოთ ამპლიტუდა, სიმძლავრე და პულსირება. ჩაშენებული ტაიმერი და ტემპერატურის ზონდი სტაბილურ შედეგებს უზრუნველყოფს. UIP400MTP პლანშეტების სონიკატორი ნიმუშებს წყლის აბაზანით აგრილებს, ხოლო გარე ჩილერი დამატებითი არჩევანია.

 

მეტი ნიმუშის დამუშავება უფრო სანდო შედეგებისთვის

UIP400MTP მრავალფოსოიანი ფირფიტის სონიკატორი მნიშვნელოვნად აძლიერებს ცილის არასწორად დაკეცვის ციკლური გაძლიერების (PMCA) ეფექტურობასა და მასშტაბურობას და ეხმიანება პროცედურის ტრადიციულად შრომატევად ბუნებას. 96 ფოსოიან ფირფიტაში 96-მდე ნიმუშის ერთდროული დამუშავების საშუალებით სისტემა აუმჯობესებს PMCA-ს სამუშაო პროცესებს და ამავე დროს ინარჩუნებს ზუსტ და ერთგვაროვან სონიკაციის პირობებს ყველა ფოსოში. მაღალი გამტარუნარიანობის ეს შესაძლებლობა ამცირებს ხელით მუშაობას, ამცირებს შრომატევად ეტაპებს და უზრუნველყოფს გამეორებადობას, რაც მას შეუცვლელ ინსტრუმენტად აქცევს პრიონის კვლევისთვის. ქრონიკული გამხდრობის დაავადების თუ კრეიტცფელდ-იაკობის დაავადების გამოკვლევისას UIP400MTP ხელს უწყობს ფართომასშტაბიან კვლევებს უფრო დიდი ეფექტურობით, რაც მკვლევრებს საშუალებას აძლევს დააკმაყოფილონ თანამედროვე დიაგნოსტიკური და სამეცნიერო აპლიკაციების მოთხოვნები.

---

---

ლიტერატურა / წყაროები

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.