Pembentukan Fibril Amiloid menggunakan Sonicator Mikroplat UIP400MTP

Fibril amiloid, seperti kristal, terbentuk melalui proses nukleasi dan pertumbuhan selanjutnya. Namun, karena penghalang nukleasi energi bebas yang tinggi, pembentukan fibril amiloid spontan hanya terjadi setelah fase lag yang berkepanjangan. Ultrasonikasi telah muncul sebagai alat yang ampuh untuk menginduksi nukleasi amiloid, sehingga secara signifikan mempercepat pembentukan fibril. Ketika dikombinasikan dengan pembaca pelat mikro menggunakan fluoresensi thioflavin T (ThT), ultrasonikasi memungkinkan deteksi throughput tinggi dari fibril amiloid dalam beberapa sampel secara bersamaan.

Pembentukan Fibril Amiloid yang Diinduksi Ultrasonik dengan Sonicator Pelat Mikro UIP400MTP

Dengan sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP, fibril amiloid dengan kualitas yang sama dalam jumlah besar dapat dengan cepat disintesis untuk tujuan penelitian. Pendekatan yang efisien ini memungkinkan mempelajari amiloidogenisitas protein. Teknik ini memfasilitasi fibrilasi amiloid yang cepat dan dapat direproduksi, seperti yang ditunjukkan dengan β2-mikroglobulin (β2-m), protein amiloidogenik yang terkait dengan amiloidosis terkait dialisis.

Pendekatan Eksperimental Sederhana: Fibrilasi Amiloid yang Diinduksi Ultrasonik

Untuk menginduksi pembentukan fibril, pelat mikro 96 sumur ditempatkan di tengah sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP, yang memastikan paparan ultrasonik yang seragam di semua sumur. Kondisi percobaan adalah sebagai berikut:

1. Setiap sumur mengandung 0,2 ml larutan β2-microglobulin (0,3 mg/ml, pH 2,5) yang dilengkapi dengan 5 μM ThT.
2. Pelat mengalami siklus ultrasonikasi, seperti ultrasonikasi 1 menit diikuti dengan jeda 9 menit.
3. Pasca-sonikasi, fluoresensi ThT diukur menggunakan pembaca pelat mikro.

(lih. So et al., 2011)

Perbandingan dengan Agitasi Konvensional

Dibandingkan dengan metode agitasi tradisional, ultrasonikasi secara drastis mengurangi fase lag pembentukan fibril. Dalam kondisi pengguncangan pelat mikro konvensional, hanya 1 dari 10 sumur yang menunjukkan peningkatan fluoresensi ThT setelah 20 jam. Sebaliknya, menggunakan ultrasonikasi bersiklus (sonikasi 15 menit diikuti dengan diam 5 menit), peningkatan fluoresensi ThT yang signifikan terdeteksi segera setelah perawatan sonikasi pertama.

Akselerasi Cepat Kinetika Fibrilasi

Hasil yang diperoleh dari So et al. (2011) menunjukkan bahwa pembentukan fibril spontan β2-mikroglobulin pada pH 2,5 dapat dipercepat dari beberapa jam menjadi hanya 10-15 menit dengan ultrasonikasi.
Gambar mikroskop gaya atom (AFM) mengkonfirmasi bahwa fibril yang dihasilkan melalui ultrasonikasi 10 menit setiap 15 menit secara morfologis tidak dapat dibedakan dari yang terbentuk menggunakan ultrasonikasi 1 menit setiap 10 menit. Ini menyoroti reproduktifitas dan kekokohan fibrilasi amiloid yang diinduksi secara ultrasonik.

Gambar AFM dari fibril amiloid yang dihasilkan oleh ultrasonikasi 1 menit setiap 10 menit (i), dengan sonikasi 10 menit setiap 15 menit (ii), dan dengan reaksi penyemaian tanpa ultrasonikasi (iii). Bilah skala putih mewakili 1 μm.
Studi dan gambar: ©So et al., 2011

Fibrilasi pada Kondisi pH Netral

Bahkan dalam kondisi pH netral, pembentukan fibril dicapai setelah jeda waktu 1,5 jam, menunjukkan bahwa ultrasonikasi secara signifikan menurunkan penghalang energik terhadap nukleasi dan pertumbuhan. Ini selanjutnya mendukung hipotesis bahwa fibrilasi amiloid terutama merupakan reaksi fisik, sebagian besar dibatasi oleh penghalang energi nukleasi, yang secara efektif dikurangi oleh ultrasonikasi.

Dampak pada Penelitian Penyakit Terkait Amiloid

Pembentukan fibril amiloid yang mudah dan andal menggunakan sonicator microplate UIP400MTP memiliki implikasi yang signifikan untuk penelitian penyakit Alzheimer (AD) dan gangguan terkait amiloid lainnya, seperti penyakit Parkinson, diabetes tipe II, dan amiloidosis sistemik. Dalam AD, agregasi amiloid-β (Aβ) adalah ciri khas patologis utama, namun mempelajari kinetika fibrilasinya tetap menantang karena fase jeda yang panjang dan variabilitas dalam metode konvensional. Pembentukan fibril yang digerakkan oleh ultrasonikasi mempercepat nukleasi, memastikan reproduktifitas tinggi dan mengurangi variabilitas, yang sangat penting untuk menyaring penghambat potensial dan memahami mekanisme amiloidogenik. Selain itu, kemampuan throughput tinggi dari UIP400MTP memungkinkan penyelidikan skala besar terhadap kesalahan pelipatan dan agregasi protein, memfasilitasi penemuan agen terapeutik yang dapat memodulasi pembentukan fibril dan berpotensi mengurangi perkembangan neurodegeneratif.

Studi ini menetapkan ultrasonikasi menggunakan sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP sebagai metode yang sangat efisien untuk mempercepat pembentukan fibril amiloid. Keuntungan utama dari pendekatan ini meliputi:

• Pengurangan dramatis dalam waktu jeda untuk fibrilasi.
• Paparan ultrasound yang seragam di semua sumur, memungkinkan pembentukan fibril yang dapat direproduksi.
• Kemampuan penyaringan throughput tinggi, sehingga cocok untuk pencarian amiloidogenisitas protein di seluruh genom.

Dengan mengintegrasikan ultrasonikasi dengan deteksi fluoresensi ThT, metode ini menyediakan platform yang cepat, terukur, dan andal untuk mempelajari fibrilasi amiloid. Mengingat efisiensi dan potensi throughput tinggi, pendekatan ini dapat memfasilitasi sintesis fibril amiloid yang mudah untuk penelitian biofisik dan farmasi, menawarkan alat yang menjanjikan untuk studi terkait amiloid dan skrining obat.