PMCA untuk Deteksi Prion Throughput Tinggi menggunakan Sonicator UIP400MTP

Sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP menawarkan solusi yang kuat untuk preparasi sampel throughput tinggi dalam amplifikasi siklik misfolding protein (PMCA). Dengan memberikan distribusi energi yang seragam di beberapa sumur dan mempertahankan parameter sonikasi yang tepat, sistem ini memungkinkan pemrosesan simultan dari banyak sampel dengan reproduktifitas yang luar biasa. Kemampuan ini sangat penting untuk mengoptimalkan PMCA untuk mendeteksi prion pada konsentrasi rendah dalam sampel biologis yang menantang, seperti air liur, di mana penghambat pengujian dapat mengaburkan hasil.

Penyakit prion, seperti penyakit wasting kronis (CWD) pada cervids dan penyakit Creutzfeldt-Jakob (CJD) pada manusia, adalah gangguan neurodegeneratif yang disebabkan oleh protein prion yang salah lipat (PrP^Sc). Penyakit ini sering melibatkan tingkat prion menular yang rendah dalam cairan tubuh, seperti air liur, darah, dan urin, yang mempersulit diagnosis dan penelitian. Penularan horizontal CWD melalui prion yang ditumpahkan dalam matriks lingkungan memiliki implikasi yang sangat signifikan bagi pengelolaan satwa liar dan kesehatan ekologis. Demikian pula, pada penyakit seperti penyakit Creutzfeldt-Jakob, amplifikasi protein prion yang salah lipat dari sampel manusia sangat penting untuk memajukan diagnostik dan memahami perkembangan penyakit.

Menerapkan protokol PMCA yang dimodifikasi memungkinkan untuk melewati penghambat pengujian umum (misalnya, mucin dalam air liur) dan mencapai sensitivitas tinggi dalam mendeteksi prion yang tidak terdeteksi atau ambigu menggunakan teknik seperti konversi yang diinduksi gempa waktu nyata (RT-QuIC). Kemajuan ini meningkatkan deteksi prion untuk berbagai penyakit, menjadikan PMCA alat yang sangat diperlukan untuk penelitian dan diagnostik prion. Sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP memfasilitasi PMCA throughput tinggi sonikasi banyak sampel dalam pelat mikro (misalnya pelat 6, 24, atau 96 sumur) atau botol di rak tabung.

Protokol untuk High-Throughput Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA)

Protokol berikut memungkinkan pemrosesan yang efisien dari jumlah sampel tinggi dalam kondisi yang persis sama untuk hasil penelitian yang kuat.

Persiapan sampel

Bahan awal:
Siapkan sampel dengan:

• Menangguhkan kembali pelet ekstraksi sarkosil dalam substrat PMCA.
• Secara langsung melonjakkan homogenat otak atau sampel darah dengan biji prion.

Substrat:

• Gunakan homogenat otak 10% (wt/vol) yang disiapkan dari tikus transgenik yang mengekspresikan PrP secara berlebihan^C (misalnya, tikus Tg).
• Homogenkan jaringan otak dalam:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Simpan substrat pada suhu -80ºC sampai digunakan.

Pengaturan sampel dalam pelat mikro atau tabung:
Tabung:

• Tambahkan 90 μL substrat homogenasi otak dan biji dengan 10 μL sampel (misalnya, darah, homogenat otak, atau pelet sarkosyl).
• Tempatkan 3 manik-manik Teflon (diameter 1.59 mm atau 2.38 mm) di setiap tabung 0.2 mL.
• Pasang tabung di rak yang kompatibel dengan sonicator UIP400MTP.

Pelat mikro 6-Sumur:

• Tambahkan 5 mL substrat homogenasi otak dan biji dengan 500 μL sampel per sumur.
• Tambahkan 3 manik-manik Teflon ke setiap sumur.

Prosedur PMCA

Penempatan:
Tempatkan rak tabung atau pelat mikro 6-sumur ke dalam sonicator UIP400MTP sesuai dengan instruksi pabrik.

Program Bersepeda:
Lakukan 144 siklus PMCA sebagai berikut:

• Inkubasi: 29 menit dan 30 detik pada suhu 37°C.
• Sonikasi: 30 detik pada amplitudo 60%.
• Pantau suhu: Gunakan sensor suhu yang dapat dicolokkan untuk memantau sample suhu dan program UIP400MTP hingga maks. suhu 48–50°C.

Putaran berikutnya:
Setelah menyelesaikan putaran pertama dari 144 siklus, transfer aliquot dari bahan yang diperkuat:

• Encerkan 10 kali lipat ke dalam substrat homogenasi otak tikus transgenik segar.
• Lakukan 96 siklus PMCA untuk putaran berikutnya, mempertahankan parameter sonikasi yang sama.
• Lanjutkan untuk jumlah putaran yang diinginkan (biasanya hingga 5).

Deteksi PrP^Sc

1. Pencernaan Proteinase K:
   – Rawat sampel dengan Proteinase K (50 μg/mL) pada suhu 37°C selama 1 jam.
   – Hentikan pencernaan dengan menambahkan buffer sampel SDS dan didihkan selama 10 menit.
2. Analisis Western Blot:
   – Analisis sampel yang dicerna menggunakan:
   – Antibodi anti-PrP 6H4 atau PRC1.
   – Lakukan SDS-PAGE dan transfer ke membran PVDF untuk deteksi.

 

 

Proses Lebih Banyak Sampel untuk Hasil yang Lebih Kuat

Sonikator pelat multi-sumur UIP400MTP secara signifikan meningkatkan efisiensi dan skalabilitas amplifikasi siklik pelipat protein (PMCA), mengatasi sifat prosedur yang secara tradisional memakan waktu. Dengan memungkinkan pemrosesan simultan hingga 96 sampel dalam pelat 96 sumur, sistem merampingkan alur kerja PMCA sambil mempertahankan kondisi sonikasi yang tepat dan seragam di semua sumur. Kemampuan throughput tinggi ini meminimalkan penanganan manual, mengurangi langkah-langkah padat karya, dan memastikan reproduktifitas, menjadikannya alat yang sangat diperlukan untuk penelitian prion. Baik menyelidiki penyakit wasting kronis atau penyakit Creutzfeldt-Jakob, UIP400MTP memfasilitasi studi skala besar dengan efisiensi yang lebih besar, memungkinkan para peneliti untuk memenuhi tuntutan aplikasi diagnostik dan ilmiah modern.

---

---

Literatur / Referensi

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.