PMCA untuk Deteksi Prion dengan Kapasitas Pemrosesan Sampel yang Tinggi Menggunakan Sonikator UIP400MTP

Sonikator pelat multisumur UIP400MTP menawarkan solusi andal untuk preparasi sampel dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi dalam amplifikasi siklik salah lipat protein (PMCA). Dengan mendistribusikan energi secara merata ke berbagai sumur dan mempertahankan parameter sonikasi yang presisi, sistem ini memungkinkan pemrosesan banyak sampel secara bersamaan dengan reproduksibilitas yang luar biasa. Kemampuan ini sangat penting untuk mengoptimalkan PMCA guna mendeteksi prion pada konsentrasi rendah dalam sampel biologis yang sulit dianalisis, seperti saliva, yang mengandung inhibitor uji yang dapat mengaburkan hasil.

Penyakit prion, seperti penyakit wasting kronis (CWD) pada anggota famili Cervidae dan penyakit Creutzfeldt-Jakob (CJD) pada manusia, merupakan gangguan neurodegeneratif yang disebabkan oleh protein prion yang salah lipat (PrP^Sc). Penyakit ini sering melibatkan kadar prion infeksius yang rendah dalam cairan tubuh, seperti saliva, darah, dan urine, sehingga menyulitkan diagnosis dan penelitian. Penularan horizontal CWD melalui prion yang dilepaskan ke dalam matriks lingkungan memiliki implikasi yang sangat signifikan bagi pengelolaan satwa liar dan kesehatan ekologi. Demikian pula, pada penyakit seperti penyakit Creutzfeldt-Jakob, amplifikasi protein prion yang salah lipat dari sampel manusia secara andal sangat penting untuk memajukan diagnostik dan memahami perkembangan penyakit.

Permudah uji MBEC dengan pelepasan biofilm yang andal dan cepat menggunakan sonikator pelat mikro UIP400MTP. UIP400MTP dapat menangani pelat uji standar apa pun dan melepaskan sel serta biofilm secara efisien.

Penerapan protokol PMCA yang dimodifikasi memungkinkan penghindaran hambatan dari inhibitor uji yang umum ditemukan (misalnya, musin dalam saliva) dan pencapaian sensitivitas tinggi dalam mendeteksi prion yang, tanpa modifikasi tersebut, tidak dapat dideteksi atau memberikan hasil deteksi yang ambigu menggunakan teknik seperti konversi yang diinduksi oleh pengguncangan secara waktu nyata (RT-QuIC). Kemajuan ini meningkatkan deteksi prion untuk berbagai penyakit, menjadikan PMCA alat yang sangat diperlukan untuk penelitian dan diagnostik prion. Sonikator pelat multisumur UIP400MTP memfasilitasi PMCA dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi melalui sonikasi banyak sampel dalam pelat mikro (misalnya, pelat dengan 6, 24, atau 96 sumur) atau vial dalam rak tabung.

Protokol Amplifikasi Siklik Salah Lipat Protein (PMCA) dengan Kapasitas Pemrosesan Sampel yang Tinggi

Protokol berikut memungkinkan pemrosesan sejumlah besar sampel secara efisien dalam kondisi yang persis sama untuk menghasilkan hasil penelitian yang andal.

Preparasi Sampel

Bahan Awal:
Siapkan sampel dengan:

Meresuspensikan pelet hasil ekstraksi sarkosil dalam substrat PMCA.
Menambahkan benih prion secara langsung ke homogenat otak atau sampel darah.

Substrat:

Gunakan homogenat otak 10% (wt/vol) yang disiapkan dari mencit transgenik yang mengekspresikan PrP secara berlebihan dalam bentuk ^C (misalnya, mencit Tg).
Homogenisasikan jaringan otak dalam:
– 1× PBS.
– 150 mM NaCl.
– 1% Triton X-100.
Simpan substrat pada -80ºC hingga digunakan.

Penyiapan Sampel dalam Pelat Mikro atau Tabung:
Tabung:

Tambahkan 90 μL substrat homogenat otak dan tambahkan 10 μL sampel sebagai benih (misalnya, darah, homogenat otak, atau pelet sarkosil).
Masukkan 3 manik Teflon (berdiameter 1,59-mm atau 2,38-mm) ke dalam setiap tabung 0,2 mL.
Pasang tabung pada rak yang kompatibel dengan sonikator UIP400MTP.

Pelat Mikro 6 Sumur:

Tambahkan 5 mL substrat homogenat otak dan tambahkan 500 μL sampel sebagai benih ke setiap sumur.
Tambahkan 3 manik Teflon ke setiap sumur.

Prosedur PMCA

Penempatan:
Tempatkan rak tabung atau pelat mikro 6 sumur ke dalam sonikator UIP400MTP sesuai petunjuk produsen.

Program Siklus:
Lakukan 144 siklus PMCA sebagai berikut:

Inkubasi: 29 menit dan 30 detik pada 37°C.
Sonikasi: 30 detik pada amplitudo 60%.
Pantau suhu: Gunakan sensor suhu yang dapat dicolokkan untuk memantau suhu sampel dan programkan UIP400MTP pada suhu maksimum 48–50°C.

Putaran Berikutnya:
Setelah menyelesaikan putaran pertama yang terdiri dari 144 siklus, pindahkan satu alikuot bahan yang telah diamplifikasi:

Encerkan 10 kali lipat dalam substrat homogenat otak mencit transgenik yang baru disiapkan.
Lakukan 96 siklus PMCA untuk putaran berikutnya, dengan mempertahankan parameter sonikasi yang sama.
Lanjutkan hingga jumlah putaran yang diinginkan (biasanya hingga 5).

Deteksi PrP^Sc

Digesti dengan Proteinase K:
– Perlakukan sampel dengan Proteinase K (50 μg/mL) pada 37°C selama 1 jam.
– Hentikan digesti dengan menambahkan buffer sampel SDS dan mendidihkan selama 10 menit.
Analisis Western Blot:
– Analisis sampel yang telah didigesti menggunakan:
– Antibodi anti-PrP 6H4 atau PRC1.
– Lakukan SDS-PAGE dan transfer ke membran PVDF untuk deteksi.

Hielscher UIP400MTP merupakan sonikator paling fleksibel untuk pelat multi-sumur, pelat PCR, atau tabung sampel Anda. Dengan daya keluaran sonikasi kontinu sebesar 400 watt, alat ini dirancang untuk aplikasi seperti lisis sel, emulsifikasi, ekstraksi protein, fragmentasi DNA / RNA, deaglomerasi, ekstraksi FFPE, pelepasan sel dan biofilm, atau emulsifikasi. UIP400MTP bukan bak ultrasonik. Alat ini merupakan cup horn berintensitas tinggi untuk sonikasi terfokus. Sonikator nonkontak berdaya tinggi ini memberikan sonikasi yang seragam pada semua sumur pelat standar Anda. Anda dapat mengontrol amplitudo, daya, dan pengoperasian berpulsa secara presisi. Pengatur waktu dan probe suhu terintegrasi memastikan hasil yang konsisten. Sonikator pelat UIP400MTP mendinginkan sampel menggunakan bak air (pendingin eksternal opsional).

Proses Lebih Banyak Sampel untuk Hasil yang Lebih Andal

Sonikator pelat multisumur UIP400MTP secara signifikan meningkatkan efisiensi dan skalabilitas amplifikasi siklik salah lipat protein (PMCA), mengatasi sifat prosedur yang secara tradisional memakan waktu. Dengan memungkinkan pemrosesan hingga 96 sampel secara bersamaan dalam pelat 96 sumur, sistem ini menyederhanakan alur kerja PMCA sambil mempertahankan kondisi sonikasi yang presisi dan seragam di seluruh sumur. Kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi ini meminimalkan penanganan manual, mengurangi langkah-langkah yang membutuhkan banyak tenaga kerja, dan memastikan reproduksibilitas, menjadikannya alat yang sangat diperlukan untuk penelitian prion. Baik untuk meneliti penyakit wasting kronis maupun penyakit Creutzfeldt-Jakob, UIP400MTP memfasilitasi studi berskala besar dengan efisiensi yang lebih tinggi, sehingga para peneliti dapat memenuhi tuntutan aplikasi diagnostik dan ilmiah modern.

Topik Terkait

Literatur / Referensi

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Pertanyaan yang Sering Diajukan

Apa Itu Prion?

Prion adalah protein yang salah lipat yang mampu memicu pelipatan abnormal pada protein seluler normal, terutama di otak. Berbeda dengan bakteri atau virus, prion tidak memiliki asam nukleat dan memperbanyak diri melalui mekanisme yang menggunakan dirinya sendiri sebagai cetakan, sehingga menyebabkan penyakit neurodegeneratif progresif seperti penyakit Creutzfeldt-Jakob, ensefalopati spongiform sapi (penyakit sapi gila), dan scrapie pada domba. Ketahanannya terhadap proses sterilisasi standar menegaskan patogenisitasnya yang unik dan menimbulkan tantangan besar dalam lingkungan medis dan penelitian.

Apa Itu Teknik PMCA?

Amplifikasi Siklik Salah Lipat Protein (PMCA) adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk mengamplifikasi protein prion yang salah lipat (PrP^Sc) secara in vitro. Teknik ini meniru konversi protein prion seluler normal (PrP^C) menjadi bentuk infeksiusnya yang salah lipat (PrP^Sc), yang merupakan ciri khas penyakit prion. Proses ini melibatkan siklus inkubasi dan sonikasi untuk mempercepat agregasi PrP^Sc, menjadikannya alat yang efektif untuk mendeteksi kadar prion yang rendah.

Salah Lipat Protein Apa yang Menyebabkan Penyakit Creutzfeldt Jakob?

Penyakit Creutzfeldt-Jakob (CJD) disebabkan oleh salah lipat protein prion (PrP). Isoform normal (PrP^C) mengadopsi konformasi abnormal yang kaya akan lembaran β (PrP^Sc) yang menjadi infeksius, membentuk agregat amiloid di otak, sehingga menyebabkan neurodegenerasi.

Apa Itu Amplifikasi Siklik Salah Lipat Protein pada Prion Infeksius?

Amplifikasi Siklik Salah Lipat Protein (PMCA) adalah metode untuk mengamplifikasi bentuk infeksius prion (PrP^Sc) dengan menginkubasi PrP normal dalam bentuk ^C berulang kali bersama sejumlah kecil PrP^Sc. Selama setiap siklus, PrP^Sc mengatalisis salah lipat PrP^C, dan sonikasi memecah agregat menjadi fragmen, sehingga menciptakan lebih banyak lokasi pembentukan benih. Proses ini meniru replikasi prion secara in vivo dan memungkinkan deteksi prion yang sensitif dalam sampel biologis.

Apa yang Menyebabkan PrP Mengalami Salah Lipat?

Salah lipat PrP menjadi bentuk patogen PrP^Sc dapat dipicu oleh:

Salah lipat spontan pada penyakit prion sporadis.
Mutasi genetik pada gen PRNP (misalnya, penyakit prion familial).
Paparan PrP infeksius dalam bentuk ^Sc melalui makanan yang terkontaminasi, prosedur medis, atau cara lainnya.
Faktor lingkungan atau struktural seperti pH, ion logam, atau kofaktor yang mengganggu kestabilan PrP^C.

Apa Itu Uji RT-QuIC?

Konversi yang Diinduksi oleh Pengguncangan secara Waktu Nyata (RT-QuIC) adalah uji diagnostik yang sangat sensitif untuk penyakit prion. Uji ini mendeteksi PrP^Sc dengan mengamplifikasi kemampuannya untuk mengubah PrP rekombinan dalam bentuk ^C menjadi agregat yang salah lipat. Uji ini menggunakan deteksi pembentukan fibril amiloid berbasis fluoresensi, sehingga berguna untuk mendiagnosis penyakit seperti CJD melalui cairan serebrospinal (CSF) atau jaringan lainnya.