Ultrazvučna priprema liposoma

Ultrazvučno proizvedeni liposomi pokazuju vrlo visoku učinkovitost uklapanja, visok kapacitet punjenja te su jednoliko mali i kuglasti. Stoga ultrazvučno proizvedeni liposomi nude izvrsnu bioraspoloživost. Hielscher Ultrasonics nudi ultrazvučne uređaje za pouzdanu proizvodnju liposoma farmaceutske kvalitete u šaržnom i kontinuiranom načinu rada.

Prednosti ultrazvučne proizvodnje liposoma

Ultrazvučna inkapsulacija u liposome tehnika je kojom se lijekovi ili druga terapijska sredstva inkapsuliraju unutar liposoma primjenom ultrazvučne energije. U usporedbi s drugim metodama inkapsulacije u liposome, ultrazvučna inkapsulacija ima nekoliko prednosti koje je čine nadmoćnom proizvodnom tehnikom.

• Visok sadržaj djelatnih tvari, visoka učinkovitost uklapanja: Ultrazvučna proizvodnja liposoma dobro je poznata po dobivanju liposoma s visokim sadržajem djelatnih tvari, npr. vitamina C, molekula lijekova itd. Istodobno metoda sonikacije pokazuje visoku učinkovitost uklapanja. To znači da se ultrazvučnom obradom inkapsulira visok postotak djelatne tvari. Time ultrazvučna obrada postaje vrlo učinkovita metoda proizvodnje liposoma.
• Jednoliko mali liposomi: Jedna od prednosti ultrazvučne inkapsulacije u liposome jest mogućnost proizvodnje izrazito ujednačenih liposoma s uskom raspodjelom veličine. Ultrazvučna energija može se upotrijebiti za razbijanje većih liposoma ili lipidnih agregata u manje, ujednačenije liposome. To dovodi do veće ujednačenosti veličine i oblika liposoma, što može biti važno za primjene u isporuci lijekova u kojima veličina čestica može utjecati na njihovu farmakokinetiku i učinkovitost.
• Primjenjivo na sve molekule: Još jedna prednost ultrazvučne inkapsulacije u liposome jest mogućnost inkapsuliranja širokog raspona lijekova i drugih terapijskih sredstava. Tehnika se može primijeniti za inkapsuliranje i hidrofilnih i hidrofobnih lijekova, što može biti teško postići drugim metodama. Osim toga, ultrazvučna energija može se upotrijebiti za inkapsuliranje makromolekula i nanočestica, koje mogu biti prevelike za inkapsuliranje drugim metodama.
• Brzo i pouzdano: Ultrazvučna inkapsulacija u liposome također je relativno jednostavan i brz postupak. Ne zahtijeva upotrebu agresivnih kemikalija ni visokih temperatura, koje mogu štetiti terapijskim sredstvima koja se inkapsuliraju.
• Povećanje proizvodnog mjerila: Osim toga, tehnika se lako može prilagoditi proizvodnji velikih razmjera, što je čini troškovno učinkovitom opcijom za primjene u isporuci lijekova.

Ukratko, ultrazvučna inkapsulacija u liposome nadmoćna je tehnika inkapsulacije u liposome zbog mogućnosti proizvodnje ujednačenih liposoma s uskom raspodjelom veličine, inkapsuliranja širokog raspona terapijskih sredstava te svoje jednostavnosti i mogućnosti povećanja proizvodnog mjerila.

Nakon stvaranja lipidnog filma i njegove naknadne rehidracije, sonikacija se primjenjuje za poticanje uklapanja djelatnih tvari u liposom. Osim toga, sonikacijom se postiže željena veličina liposoma.

Ultrazvučna priprema liposoma za farmaceutske i kozmetičke proizvode

Liposomi (vezikule na bazi lipida), transferosomi (ultradeformabilni liposomi), etosomi (ultradeformabilne vezikule s visokim udjelom alkohola) i niosomi (sintetske vezikule) mikroskopske su vezikule koje se mogu umjetno pripremiti kao kuglasti nosači u koje se mogu inkapsulirati djelatne molekule. Te vezikule promjera između 25 i 5000 nm često se upotrebljavaju kao nosači lijekova u farmaceutskoj i kozmetičkoj industriji, primjerice za oralnu ili topikalnu isporuku lijekova, gensku terapiju i imunizaciju. Ultrazvučna obrada znanstveno je dokazana metoda za vrlo učinkovitu proizvodnju liposoma. Ultrazvučni uređaji Hielscher proizvode liposome s visokim sadržajem djelatnih tvari i nadmoćnom bioraspoloživošću.

Liposomi i liposomalna formulacija

Liposomi su unilamelarni, oligolamelarni ili multilamelarni vezikularni sustavi i sastoje se od istog materijala kao i stanična membrana (lipidni dvosloj). Prema sastavu i veličini liposomi se razlikuju na sljedeći način:

• multilamelarne vezikule (MLV, 0,1–10μm)
• male unilamelarne vezikule (SUV, <100 nm)
• velike unilamelarne vezikule (LUV, 100–500 nm)
• divovske unilamelarne vezikule (GUV, ≥1 μm)

Osnovnu strukturu liposoma čine fosfolipidi. Fosfolipidi imaju hidrofilnu skupinu glave i hidrofobnu skupinu repa, koja se sastoji od dugog ugljikovodičnog lanca.
Membrana liposoma ima sastav vrlo sličan sastavu kožne barijere, pa se liposomi mogu lako integrirati u ljudsku kožu. Kada se liposomi stapaju s kožom, mogu otpustiti uklopljene tvari izravno na odredištu, gdje djelatne tvari mogu obavljati svoje funkcije. Tako liposomi povećavaju sposobnost prodiranja uklopljenih farmaceutskih i kozmetičkih tvari u kožu odnosno propusnost kože za te tvari. I liposomi bez inkapsuliranih tvari, prazne vezikule, snažne su djelatne tvari za kožu jer „phosphatidylcholin” sadržava dvije esencijalne tvari koje ljudski organizam ne može sam proizvesti: linolnu kiselinu i kolin.
Liposomi se upotrebljavaju kao biokompatibilni nosači lijekova, peptida, proteina, „plasmic DNA”, antisensnih oligonukleotida ili ribozima u farmaceutske, kozmetičke i biokemijske svrhe. Iznimna raznolikost veličina čestica i fizikalnih parametara lipida pruža privlačan potencijal za izradu prilagođenih nosača za širok raspon primjena. (Ulrich 2002)

Ultrazvučno stvaranje liposoma

Liposomi se mogu stvarati primjenom ultrazvuka. Osnovni materijal za pripremu liposoma čine molekule označene kao „amphilic”, izvedene iz lipida bioloških membrana ili temeljene na njima. Za stvaranje malih unilamelarnih vezikula (SUV) lipidna disperzija podvrgava se blagoj sonikaciji – primjerice ručnim ultrazvučnim uređajem UP50H (50W, 30kHz), uređajem VialTweeter ili ultrazvučnim reaktorom CupHorn – u ledenoj kupelji. Takva ultrazvučna obrada traje približno 5 – 15 minuta. Druga metoda proizvodnje malih unilamelarnih vezikula jest sonikacija multilamelarnih liposomskih vezikula.
Dinu-Pirvu i sur. (2010) izvještavaju o dobivanju transferosoma sonikacijom MLV-a na sobnoj temperaturi.
Hielscher Ultrasonics nudi razne ultrazvučne uređaje, sonotrode i dodatnu opremu te tako može osigurati najprikladniji ultrazvučni sustav za visokoučinkovitu inkapsulaciju u liposome u bilo kojem mjerilu.

Ultrazvučna inkapsulacija djelatnih tvari u liposome

Liposomi služe kao nosači djelatnih sastojaka kao što su vitamini, terapijske molekule, peptidi itd. Ultrazvuk je učinkovit alat za pripremu i stvaranje liposoma za uklapanje djelatnih tvari. Istodobno sonikacija potpomaže proces inkapsulacije i uklapanja, čime se proizvode liposomi s visokim sadržajem djelatnih sastojaka. Prije inkapsulacije liposomi su skloni stvaranju nakupina zbog površinskih interakcija između naboja polarnih glava fosfolipida (usp. Míckova i sur. 2008), a osim toga potrebno ih je otvoriti. Primjerice, Zhu i sur. (2003) opisuju inkapsulaciju biotina u prahu u liposome primjenom ultrazvuka. Nakon dodavanja biotina u prahu u otopinu s vezikularnom suspenzijom, otopina je podvrgnuta sonikaciji. Nakon te obrade biotin je bio uklopljen u liposome.
Pročitajte više o ultrazvučnoj inkapsulaciji tvari označenih kao GLP-1 „peptrides” (npr. semaglutida) u liposome!

Liposomske emulzije primjenom ultrazvuka

Kako bi se pojačao njegujući učinak hidratantnih krema ili krema protiv starenja, losiona, gelova i drugih kozmeceutskih formulacija, liposomalnim disperzijama dodaju se emulgatori radi stabilizacije većih količina lipida. Međutim, istraživanja su pokazala da je kapacitet liposoma općenito ograničen. Dodavanjem emulgatora taj će se učinak pojaviti ranije, a dodatni emulgatori uzrokuju slabljenje afiniteta fosfatidilkolina prema barijeri. Nanočestice – sastavljene od fosfatidilkolina i lipida – rješenje su tog problema. Te nanočestice čini kapljica ulja prekrivena monoslojem fosfatidilkolina. Upotreba nanočestica omogućuje formulacije koje mogu apsorbirati više lipida i ostati stabilne, tako da dodatni emulgatori nisu potrebni.
Obrada ultrazvukom dokazana je metoda za proizvodnju nanoemulzija i nanodisperzija. Ultrazvuk visokog intenziteta osigurava snagu potrebnu za dispergiranje tekuće faze (dispergirane faze) u obliku malih kapljica u drugoj fazi (kontinuiranoj fazi). U zoni dispergiranja implozija kavitacijskih mjehurića uzrokuje snažne udarne valove u okolnoj tekućini i dovodi do stvaranja mlazova tekućine velike brzine. Kako bi se novonastale kapljice dispergirane faze stabilizirale protiv koalescencije, emulziji se dodaju emulgatori (površinski aktivne tvari, surfaktanti) i stabilizatori. Budući da koalescencija kapljica nakon njihova razbijanja utječe na konačnu raspodjelu veličine kapljica, upotrebljavaju se emulgatori s učinkovitim stabilizacijskim djelovanjem kako bi se konačna raspodjela veličine kapljica održala na razini jednakoj raspodjeli neposredno nakon razbijanja kapljica u ultrazvučnoj zoni dispergiranja.

Liposomalne disperzije primjenom ultrazvuka

Liposomalne disperzije koje se temelje na nezasićenom spoju „phosphatidylchlorine” nedovoljno su stabilne prema oksidaciji. Stabilizacija disperzije može se postići antioksidansima, primjerice kompleksom vitamina C i E.
 

Stvaranje liposoma metodom isparavanja obrnute faze uz primjenu sonikacije

 
Ortan et al. (2002) postigli su dobre rezultate u svojem istraživanju ultrazvučne pripreme eteričnog ulja vrste Anethum graveolens u liposomima. Nakon sonikacije veličina liposoma bila je između 70–150 nm, a za MLV između 230–475 nm; te su vrijednosti ostale približno nepromijenjene i nakon 2 mjeseca, ali su se povećale nakon 12 mjeseci, osobito u disperziji SUV (vidjeti histograme u nastavku). Mjerenje stabilnosti, koje se odnosilo na gubitak eteričnog ulja i raspodjelu veličine, također je pokazalo da su liposomalne disperzije zadržale sadržaj hlapljivog ulja. To upućuje na to da je uklapanje eteričnog ulja u liposome povećalo stabilnost ulja.

Ortan et al. (2009): Stabilnost disperzija MLV i SUV nakon 1 godine. Liposomalne formulacije čuvane su na 4±1 ºC.

Hielscher ultrazvučni procesori idealni su uređaji za primjene u kozmetičkoj i farmaceutskoj industriji. Sustavi koji se sastoje od nekoliko ultrazvučnih procesora, svaki snage do 16.000 vata, osiguravaju kapacitet potreban za pretvaranje ove laboratorijske primjene u učinkovitu proizvodnu metodu za dobivanje fino dispergiranih emulzija u kontinuiranom protoku ili šaržno – uz postizanje rezultata usporedivih s rezultatima danas dostupnih najboljih visokotlačnih homogenizatora, poput ventila s otvorom. Uz tu visoku učinkovitost pri kontinuiranom emulgiranju, Hielscher ultrazvučni uređaji zahtijevaju vrlo malo održavanja te su vrlo jednostavni za rukovanje i čišćenje. Ultrazvuk ujedno potpomaže čišćenje i ispiranje. Ultrazvučna snaga može se podešavati i prilagoditi pojedinim proizvodima i zahtjevima emulgiranja. Dostupni su i posebni reaktori s protočnim ćelijama koji zadovoljavaju napredne zahtjeve CIP-a (čišćenje na mjestu) i SIP-a (sterilizacija na mjestu).

Često postavljana pitanja o liposomima

Koje se vrste liposoma razlikuju?

Liposomi se razvrstavaju u različite vrste prema veličini i broju dvoslojeva koje sadrže. Te kategorije uključuju:

• Male unilamelarne vezikule (SUV): To su najmanji liposomi s jednim lipidnim dvoslojem.
• Velike unilamelarne vezikule (LUV): Veće su od SUV-a i također imaju jedan dvosloj.
• Multilamelarne vezikule (MLV): Sadrže više koncentričnih dvoslojeva.
• Multivezikularne vezikule (MVV): Sastoje se od više manjih vezikula unutar veće vezikule.

 
Ostale specijalizirane vrste uključuju:

• PEGilirani liposomi: Liposomi modificirani polietilen-glikolom (PEG) radi poboljšanja stabilnosti i produljenja vremena cirkulacije.
• Nanoliposomi: Vrlo mali liposomi, koji se obično upotrebljavaju za ciljanu dostavu lijekova.

Kakve vezikularne strukture mogu imati liposomi?

Liposomi se prema svojoj vezikularnoj strukturi dodatno razvrstavaju u sedam glavnih vrsta:

• Velike multilamelarne vezikule (MLV): Sadrže više dvoslojeva.
• Oligolamelarne vezikule (OLV): Imaju nekoliko dvoslojeva.
• Male unilamelarne vezikule (SUV): Najmanje su i imaju jedan dvosloj.
• Unilamelarne vezikule srednje veličine (MUV): Srednje su veličine i imaju jedan dvosloj.
• Velike unilamelarne vezikule (LUV): Veće su i imaju jedan dvosloj.
• Divovske unilamelarne vezikule (GUV): Vrlo su velike i imaju jedan dvosloj.
• Multivezikularne vezikule (MVV): Više vezikula unutar jedne velike vezikule.

Koje su razlike između liposoma i niosoma?

Liposomi i niosomi razlikuju se uglavnom po sastavu:
Liposomi: Izrađeni su od dvolančanih fosfolipida, koji mogu biti neutralni ili nabijeni.
Niosomi: Izrađeni su od nenabijenih jednolančanih površinski aktivnih tvari i kolesterola.
Obje strukture nastaju sonikacijom, koja potiče sastavljanje vezikula s dvoslojnom membranom.

Koja je idealna veličina liposoma?

Za dostavu terapijskih sredstava idealna veličina liposoma teoretski je između 50 i 200 nanometara u promjeru. Taj raspon veličine optimizira stabilnost i bioraspoloživost. Sonikacija se često upotrebljava za smanjenje vezikule na željenu veličinu.

Mogu li liposomi prenositi hidrofilne lijekove?

Da, liposomi mogu prenositi hidrofilne lijekove. Cijenjeni su u biomedicinskim primjenama zbog svoje sposobnosti enkapsulacije i hidrofobnih i hidrofilnih sredstava. Osim toga, odlikuju se visokom biokompatibilnošću i biorazgradivošću, što ih čini učinkovitim sustavima za dostavu.

Kako pripremiti liposome?

Najčešće tehnike pripreme liposoma jesu metoda tankog filma i metoda isparavanja u obrnutoj fazi.
Metoda hidratacije tankog filma:

1. Otopite lipide u organskom otapalu.
2. Isparite otapalo kako bi nastao tanki lipidni film.
3. Hidratizirajte film vodenom otopinom uz primjenu sonikacije kako bi nastale multilamelarne vezikule.

Metoda isparavanja u obrnutoj fazi:

1. Otopite lipide u vodi i etanolu.
2. Sonicirajte otopinu na 60°C približno 10 minuta kako bi nastala lipidna pasta.
3. Ohladite gustu lipidnu suspenziju i uz miješanje dodajte vodu ili pufer kap po kap.
4. Hidratizirajte suspenziju 1 sat kako bi nastale multilamelarne vezikule.
5. Smanjite veličinu liposoma daljnjom sonikacijom.

Što su arheosomi?

Arheosomi su liposomi izrađeni od lipida arheja, koji su poznati po svojoj stabilnosti i otpornosti na ekstremne uvjete. Ta svojstva čine arheosome osobito korisnima za dostavu lijekova i razvoj cjepiva u zahtjevnim okruženjima.

Kako se pripremaju arheosomi?

Postupak sonikacije prema Pise (2022): Arheosomi se mogu izraditi od polarne lipidne frakcije “PLF” organizma Sulfolobussolfataricus sonikacijom pri 60°C bez potrebe za vanjskim nadopunjavanjem lipida. Pri 0°C polarni lipidi organizma Sulfolobusacidocaldarius učinkovito su sonicirani radi stvaranja arheosoma. Arheosomi s ugrađenim BMD-om i konvencionalni liposomi, kao i lipidi arheja izolirani iz Archaea H. salinarum i obogaćeni fosfatidilkolinom, izrađeni su tehnikama sonikacije. Sonicirane vezikule za topikalnu primjenu izrađene su sonikacijom disperzija MLV pri amplitudi od 80 posto tijekom 4 minute s pomoću sonikatora sa sondom Hielscher UP50H (vidjeti sliku lijevo).

Literatura/Reference

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.