Ultrazvučna deacetilacija hitina u hitozan
Ultrazvučna proizvodnja hitozana
Hitozan se dobiva N-deacetilacijom hitina. Pri konvencionalnoj deacetilaciji hitin se namače u vodenim lužnatim otapalima (obično 40 do 50% (w/w) NaOH). Postupak namakanja zahtijeva visoke temperature od 100 do 120ºC i vrlo je dugotrajan, dok je prinos hitozana dobiven po koraku namakanja nizak. Primjena ultrazvuka velike snage znatno intenzivira proces deacetilacije hitina te omogućuje visok prinos hitozana niske molekulske mase brzom obradom pri nižoj temperaturi. Ultrazvučnom deacetilacijom dobiva se hitozan vrhunske kvalitete koji se upotrebljava kao sastojak prehrambenih i farmaceutskih proizvoda, kao gnojivo te u brojnim drugim industrijskim primjenama.
Ultrazvučna obrada dovodi do iznimnog stupnja acetilacije (DA) hitina, smanjujući stupanj acetilacije s DA≥90 u hitinu na DA≤10 u hitozanu.
Brojna istraživanja potvrđuju učinkovitost ultrazvučne deacetilacije hitina u hitozan. Weiss J. i sur. (2008) utvrdili su da sonikacija drastično poboljšava pretvorbu hitina u hitozan. Ultrazvučna obrada hitina donosi znatne uštede vremena, skraćujući potrebno vrijeme procesa s 12–24 sata na nekoliko sati. Nadalje, za potpunu pretvorbu potrebno je manje otapala, čime se smanjuje utjecaj na okoliš povezan s potrebom odbacivanja i zbrinjavanja istrošenog ili neizreagiranog otapala, tj. koncentriranog NaOH.
Sonikacija pospješuje deacetilaciju hitina u hitozan
UIP4000hdT – ultrazvučni sustav snage 4kW
Načelo rada ultrazvučne obrade hitozana
Ultrazvučna obrada velike snage i niske frekvencije (∼20–26kHz) stvara akustičnu kavitaciju u tekućinama i suspenzijama. Ultrazvuk velike snage pospješuje pretvorbu hitina u hitozan jer otapalo (npr. NaOH) usitnjava čvrste čestice hitina i prodire u njih, čime se povećava površina i poboljšava prijenos tvari između čvrste i tekuće faze. Nadalje, velike smične sile ultrazvučne kavitacije stvaraju slobodne radikale koji povećavaju reaktivnost reagensa (tj. NaOH) tijekom hidrolize. Kao netoplinska tehnika obrade, sonikacija sprječava toplinsku razgradnju te omogućuje proizvodnju visokokvalitetnog hitozana. Ultrazvuk skraćuje vrijeme obrade potrebno za izdvajanje hitina iz rakova te omogućuje dobivanje hitina (a time naknadno i hitozana) veće čistoće u usporedbi s tradicionalnim uvjetima obrade. Stoga ultrazvuk pri proizvodnji hitina i hitozana ima potencijal smanjiti troškove proizvodnje, skratiti vrijeme obrade, omogućiti bolju kontrolu proizvodnog procesa i smanjiti utjecaj procesnog otpada na okoliš.
- Veći prinos hitozana
- Vrhunska kvaliteta
- Kraće vrijeme
- Niža temperatura procesa
- Povećana učinkovitost
- Jednostavno i sigurno rukovanje
- Ekološki prihvatljivo
Ultrazvučna deacetilacija hitina u hitozan – protokol
1) Pripremite hitin:
Ako se kao polazni materijal upotrebljavaju oklopi rakova, potrebno ih je temeljito oprati kako bi se uklonile sve topljive organske tvari i prianjajuće nečistoće, uključujući zemlju i bjelančevine. Zatim se materijal oklopa mora potpuno osušiti (npr. pri 60ºC tijekom 24h u sušioniku). Osušeni oklopi zatim se melju (npr. čekićnim mlinom), deproteiniziraju u lužnatom mediju (npr. NaOH pri koncentraciji od 0,125 do 5,0 M) i demineraliziraju u kiselini (npr. razrijeđenoj klorovodičnoj kiselini).
2) Ultrazvučna deacetilacija
Za provođenje tipične reakcije ultrazvučne deacetilacije čestice beta-hitina (0,125 mm < d < 0,250 mm) suspendiraju se u 40% (w/w) vodenoj otopini NaOH pri omjeru beta-hitina i vodene otopine NaOH od 1/10(g mL-1), suspenzija se prenosi u staklenu čašu s dvostrukom stijenkom i sonificira s pomoću uređaja Hielscher UP400St , ultrazvučnog homogenizatora. Sljedeći parametri (usp. Fiamingo et al. 2016) održavaju se konstantnima tijekom provođenja reakcije ultrazvučne deacetilacije hitina: (i) ultrazvučna sonda (sonotroda Hielscher S24d22D, promjer vrha = 22 mm); (ii) pulsni način sonikacije (IP = 0,5sec); (iii) površinski intenzitet ultrazvuka
(I = 52,6 W cm-2), (iv) temperatura reakcije (60ºC ±1ºC), (v) vrijeme reakcije (50 min), (vi) omjer mase beta-hitina i volumena 40% (w/w) vodene otopine natrijeva hidroksida (BCHt/NaOH = 1/10 g mL-1); (vii) volumen suspenzije beta-hitina (50mL).
Prva reakcija odvija se 50min uz stalno magnetsko miješanje, a zatim se prekida brzim hlađenjem suspenzije na 0ºC. Potom se dodaje razrijeđena klorovodična kiselina kako bi se postigao pH 8,5, a uzorak CHs1 izdvaja se filtracijom, temeljito ispire deioniziranom vodom i suši u ambijentalnim uvjetima. Kada se ista ultrazvučna deacetilacija ponovi na uzorku CHs1 kao drugi korak, dobiva se uzorak CHs2.
Snimke dobivene pretražnom elektronskom mikroskopijom (SEM) pri povećanju od 100×: a) gladij, b) gladij obrađen ultrazvukom, c) β-hitin, d) β-hitin obrađen ultrazvukom i e) hitozan (izvor: Preto et al. 2017)
Fiamingo et al. utvrdili su da se ultrazvučnom deacetilacijom beta-hitina učinkovito proizvodi hitozan visoke molekulske mase s niskim stupnjem acetilacije, bez uporabe aditiva, inertne atmosfere ili dugog vremena reakcije. Iako se reakcija ultrazvučne deacetilacije provodi u blažim uvjetima – tj. pri niskoj temperaturi reakcije u usporedbi s većinom termokemijskih deacetilacija. Ultrazvučna deacetilacija beta-hitina omogućuje pripravu nasumično deacetiliranog hitozana s promjenjivim stupnjem acetilacije (4% ≤ DA ≤ 37%), visokim masenim prosjekom molekulske mase (900.000 g mol-1 ≤ Mw ≤ 1.200.000 g mol-1 ) i niskom disperznošću (1,3 ≤ Ð ≤ 1,4) provođenjem triju uzastopnih reakcija (50 min/korak) pri 60ºC.
Ultrazvučni procesori velike snage za laboratorijsko, pilotno i industrijsko mjerilo.
Ultrazvučni sustavi visokih performansi za proizvodnju hitozana
Fragmentacija hitina i deacetilacija hitina u hitozan zahtijevaju snažnu i pouzdanu ultrazvučnu opremu koja može postići visoke amplitude, omogućuje preciznu kontrolu parametara procesa i može raditi 24/7 pod velikim opterećenjem i u zahtjevnim okruženjima. Asortiman proizvoda Hielscher Ultrasonics zadovoljava vaše potrebe i zahtjeve vašeg procesa. Ultrazvučni uređaji Hielscher sustavi su visokih performansi koji se mogu opremiti dodatnom opremom poput sonotroda, pojačivača amplitude, reaktora ili protočnih ćelija kako bi se optimalno prilagodili potrebama vašeg procesa.
Digitalni zaslon u boji, mogućnost unaprijed zadanih ciklusa sonikacije, automatsko bilježenje podataka na ugrađenu SD karticu, daljinsko upravljanje putem preglednika i brojne druge značajke osiguravaju najvišu razinu kontrole procesa i jednostavnosti uporabe. Zahvaljujući robusnosti i sposobnosti podnošenja velikih opterećenja, ultrazvučni sustavi Hielscher vaš su pouzdan oslonac u proizvodnji.
Fragmentacija i deacetilacija hitina zahtijevaju snažan ultrazvuk kako bi se postigla ciljana pretvorba i dobio visokokvalitetan konačni proizvod hitozana. Visoke amplitude i povišeni tlakovi ključni su osobito za fragmentaciju ljuskica hitina. Industrijski ultrazvučni procesori tvrtke Hielscher Ultrasonics lako postižu vrlo visoke amplitude. Amplitude do 200µm mogu se kontinuirano održavati pri radu 24/7. Za još više amplitude dostupne su prilagođene ultrazvučne sonotrode. Raspoloživa snaga ultrazvučnih sustava Hielscher omogućuje učinkovitu i brzu deacetilaciju u sigurnom procesu jednostavnom za uporabu.
Tablica u nastavku daje okvirni prikaz približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja:
| Volumen šarže | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| 1 do 500mL | 10 do 200mL/min | UP100H |
| 10 do 2000mL | 20 do 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 do 20L | 0,2 do 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 do 100L | 2 do 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 do 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | veći | skupina uređaja UIP16000 |
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Literatura i reference
- Butnaru E., Stoleru E., Brebu M.A., Darie-Nita R.N., Bargan A., Vasile C. (2019): Bionanokompozitni filmovi na bazi hitozana pripremljeni emulzijskom tehnikom za konzerviranje hrane. Materials 2019, 12(3), 373.
- Fiamingo A., de Moura Delezuk J.A., Trombotto St. David L., Campana-Filho S.P. (2016): Visokomolekularni hitozan visokog stupnja deacetilacije dobiven višestupanjskom ultrazvučno potpomognutom deacetilacijom beta-hitina. Ultrasonics Sonochemistry 32, 2016. 79–85.
- Kjartansson, G., Wu, T., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Sonokemijski potpomognuta pretvorba hitina u hitozan, sastanak glavnih istraživača Nacionalne istraživačke inicijative USDA-a, New Orleans, LA, June 28th.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K. Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Utjecaj temperature tijekom deacetilacije hitina u hitozan uz ultrazvuk visokog intenziteta kao predobradu, godišnji skup Instituta prehrambenih tehnologa, New Orleans, LA, June 30th, 95-18.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Utjecaj ultrazvuka visokog intenziteta na ubrzavanje pretvorbe hitina u hitozan, godišnji skup Instituta prehrambenih tehnologa, New Orleans, LA, June 30th, 95-17.
- Preto M.F., Campana-Filho S.P., Fiamingo A., Cosentino I.C., Tessari-Zampieri M.C., Abessa D.M.S., Romero A.F., Bordon I.C. (2017): Gladij i njegovi derivati kao potencijalni biosorbensi za brodsko dizelsko gorivo. Environmental Science and Pollution Research (2017) 24:22.932–22.939.
- Wijesena R.N., Tissera N., Kannangara Y.Y., Lin Y., Amaratunga G.A.J., de Silva K.M.N. (2015): Metoda pripreme nanočestica i nanovlakana hitozana pristupom odozgo prema dolje. Carbohydrate Polymers 117, 2015. 731–738.
- Wu, T., Zivanovic, S., Hayes, D.G., Weiss, J. (2008). Učinkovito smanjenje molekulske mase hitozana ultrazvukom visokog intenziteta: temeljni mehanizam i učinak procesnih parametara. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(13):5112-5119.
- Yadav M.; Goswami P.; Paritosh K.; Kumar M.; Pareek N.; Vivekanand V. (2019): Otpad od morskih plodova: izvor za pripremu komercijalno primjenjivih materijala od hitina/hitozana. Bioresources and Bioprocessing 6/8, 2019.
Korisne činjenice
Kako djeluje ultrazvučna deacetilacija hitina?
Kada se ultrazvuk velike snage i niske frekvencije (npr. 20–26kHz) uvodi u tekućinu ili suspenziju, tekućina se izlaže izmjeničnim ciklusima visokog i niskog tlaka, što uzrokuje kompresiju i razrjeđivanje. Tijekom tih izmjeničnih ciklusa visokog i niskog tlaka nastaju mali vakuumski mjehurići koji rastu tijekom nekoliko ciklusa tlaka. U trenutku kada vakuumski mjehurići više ne mogu apsorbirati energiju, naglo kolabiraju. Tijekom te implozije mjehurića lokalno nastaju vrlo intenzivni uvjeti: visoke temperature do 5000K, tlakovi do 2000atm, vrlo velike brzine zagrijavanja/hlađenja i razlike u tlaku. Budući da je dinamika kolapsa mjehurića brža od prijenosa mase i topline, energija u šupljini koja kolabira ograničena je na vrlo malo područje, koje se naziva i „vruća točka”. Implozija kavitacijskog mjehurića također uzrokuje mikroturbulencije, mlazove tekućine brzine do 280m/s i posljedične smične sile. Ta je pojava poznata kao ultrazvučna ili akustična kavitacija.
Te kavitacijske sile djeluju na kapljice i čestice u soniciranoj tekućini, a kada se ubrzane čestice međusobno sudare, usitnjavaju se uslijed međučestičnih sudara. Akustična kavitacija načelo je rada ultrazvučnog mljevenja, dispergiranja, emulgiranja i sonokemije.
Pri deacetilaciji hitina ultrazvuk visokog intenziteta povećava površinu aktiviranjem površine i poticanjem prijenosa mase između čestica i reagensa.
Hitozan
Kitozan je modificirani, kationski, netoksični ugljikohidratni polimer složene kemijske strukture koju čine jedinice β-(1,4) glukozamina kao glavna komponenta (>80%) i jedinice N-acetilglukozamina (<20%), nasumično raspoređene duž lanca. Kitozan se dobiva iz hitina kemijskom ili enzimskom deacetilacijom. Stupanj deacetilacije (DA) određuje udio slobodnih amino skupina u strukturi i upotrebljava se za razlikovanje hitina i kitozana. Kitozan pokazuje dobru topljivost u blagim otapalima poput razrijeđene octene kiseline te ima nekoliko slobodnih amino skupina koje služe kao aktivna mjesta. Zbog toga kitozan ima prednost pred hitinom u mnogim kemijskim reakcijama.
Kitozan je cijenjen zbog izvrsne biokompatibilnosti i biorazgradivosti, netoksičnosti, dobrog antimikrobnog djelovanja (protiv bakterija i gljivica), nepropusnosti za kisik i svojstava stvaranja filmova. U usporedbi s hitinom, prednost kitozana jest topljivost u vodi, što olakšava rukovanje njime i njegovu primjenu u formulacijama.
Hitin je drugi najzastupljeniji polisaharid nakon celuloze, a njegova velika zastupljenost čini ga jeftinom i održivom sirovinom.
Proizvodnja kitozana
Kitozan se proizvodi postupkom u dva koraka. U prvom se koraku sirovina, poput oklopa rakova (tj. kozica, rakovica, hlapova), deproteinizira, demineralizira i pročišćava kako bi se dobio hitin. U drugom se koraku hitin obrađuje jakom bazom (npr. NaOH) kako bi se uklonili acetilni bočni lanci i dobio kitozan. Poznato je da je konvencionalni postupak proizvodnje kitozana vrlo dugotrajan i skup.
Hitin
Hitin (C8H13O5N)n je polimer β-1,4-N-acetilglukozamina ravnog lanca i razvrstava se na α-, β- i γ-hitin. Kao derivat glukoze, hitin je glavna komponenta egzoskeleta člankonožaca, poput rakova i kukaca, radula mekušaca, kljunova glavonožaca te ljusaka riba i lizamfibija, a nalazi se i u staničnim stijenkama gljiva. Struktura hitina usporediva je sa strukturom celuloze te tvori kristalne nanofibrile ili viskere. Celuloza je najzastupljeniji polisaharid na svijetu, a hitin je drugi po zastupljenosti.
Glukozamin
Glukozamin (C6H13NO5) je aminošećer i važan prekursor u biokemijskoj sintezi glikoziliranih proteina i lipida. Glukozamin je prirodno rasprostranjen spoj koji je dio strukture obaju polisaharida, kitozana i hitina, što ga čini jednim od najzastupljenijih monosaharida. Većina komercijalno dostupnog glukozamina proizvodi se hidrolizom egzoskeleta rakova, tj. oklopa rakovica i hlapova.
Glukozamin se uglavnom upotrebljava kao dodatak prehrani, i to u obliku glukozamin sulfata, glukozamin hidroklorida ili N-acetilglukozamina. Dodaci prehrani s glukozamin sulfatom primjenjuju se oralno za liječenje bolnog stanja uzrokovanog upalom, razgradnjom i konačnim gubitkom hrskavice (osteoartritis).