הגדלת קנה המידה של סינתזת פפטידים: אסטרטגיות אולטרסוניות לעיבוד באצווה + בזרימה רציפה
סינתזת פפטידים בסיוע סוניקציה משלבת כימיית פפטידים מבוססת עם אנרגיה מכנית בתדר גבוה כדי להאיץ תהליכי תגובה והעברה. קוויטציה אקוסטית – היווצרות וקריסה של בועות מיקרוסקופיות – יוצרת ערבוב מקומי עז, מיקרו־סילונים וכוחות גזירה. בסינתזת פפטידים, השפעות אלה משפרות את העברת הריאגנטים, הרטבת השרף, ההמסה ופירוק האגרגטים. לכן, אולטרסאונד בתדר נמוך משמש בעיקר ככלי להעצמת תהליכים: הוא אינו מחליף את כימיית הצימוד, אך יכול להפוך את שלבי הצימוד, הסרת קבוצות ההגנה, השטיפה, הביקוע ועיבוד תערובת התגובה למהירים ויעילים יותר במידה ניכרת.
האתגר שבהגדלת קנה המידה של ייצור פפטידים
הגדלת קנה המידה של ייצור פפטידים מהמעבדה לייצור תעשייתי היא מאתגרת, משום שחוסר יעילות קטן מצטבר לאורך מחזורים רבים של צימוד והסרת קבוצות הגנה, מפחית את הניצולת ומגדיל את כמות הזיהומים שקשה להסירם. ריאקטורים גדולים יותר יוצרים גם מגבלות בערבוב, בהעברת חום, בתפיחת השרף ובהעברת ריאגנטים, בעוד שצריכת הממסים, דרישות הטיהור ועלויות הייצור עולות בחדות. לפיכך, הגדלה מוצלחת של קנה המידה חייבת לשמר את אחידות התגובה ואת איכות התוצר, ובה בעת לספק תפוקה הדירה, שימוש יעיל במשאבים ובקרה מדויקת על כל פרמטרי התהליך הקריטיים.
ריאקטור אצווה פרמצבטי עם מכשיר סוניקציה UIP2000hdT לשיפור סינתזת פפטידים
אסטרטגיות לסינתזת פפטידים בסיוע סוניקציה
סינתזת פפטידים אולטרסונית בפאזה מוצקה
סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה (SPPS) בשיטת Fmoc היא האסטרטגיה האולטרסונית שנחקרה בהיקף הנרחב ביותר. סוניקציה משפרת את חדירת הריאגנטים להסרת קבוצות הגנה ולצימוד אל תוך חרוזי פולימר תפוחים, ובמקביל מצמצמת שכבות גבול עומדות סביב השרף. היא יכולה גם לפרק אגרגטים על גבי השרף, שהיווצרותם היא גורם חשוב להמרה בלתי מלאה ברצפים הידרופוביים וברצפים "קשים" אחרים.
מחקרים ניסויים הדגימו סינתזה בסיוע אולטרסאונד של פפטידים בעלי פעילות ביולוגית המכילים עד 44 שיירים, תוך צריכת חומרים נמוכה יותר וזמני תגובה קצרים יותר, ללא עלייה שנצפתה בתגובות הלוואי העיקריות בתנאים שדווחו. (ראו Merlino et al., 2019)
מחקר אחר דיווח על קיצור זמן ההרכבה פי ארבעה עד פי ארבעה עשר עבור פפטידים נבחרים; פפטיד בן 25 שיירים, העשיר בשיירים הידרופוביים, הורכב בתוך 347 דקות. (ראו Silva et al., 2021)
ניתן לשלב אולטרסאונד במהלך:
- תפיחת השרף והחלפת ריאגנטים
- הסרת קבוצות ההגנה Fmoc או Boc
- אקטיבציה וצימוד של חומצות אמינו
- שטיפות ביניים
- ציקליזציה על גבי השרף
- ביקוע הפפטיד המושלם מהנשא
סינתזה בפאזה נוזלית ובסיוע תג
אולטרסאונד יכול גם להעצים סינתזת פפטידים קונבנציונלית בפאזה נוזלית באמצעות האצת ההמסה, פיזור הריאגנטים והעברת המסה בתערובות הטרוגניות או צמיגות. התועלת שלו בדרך כלל הגדולה ביותר כאשר התהליך מוגבל על ידי ערבוב או העברה; תגובה הומוגנית לחלוטין, שקצבה נקבע רק על ידי הקינטיקה הכימית הפנימית, עשויה להראות שיפור קטן יותר.
בסינתזת פפטידים בסיוע תג, הפפטיד המתארך מחובר לעוגן אורגני מסיס או ניתן לשיקוע. התגובות מתרחשות בתמיסה, ולאחר מכן תוצר הביניים הנושא את התג מופרד באמצעות שיקוע או סינון. סוניקציה יכולה להאיץ צימוד, הסרת קבוצות הגנה, ציקליזציה וביקוע של התג, תוך שמירה על תוצרי ביניים בעלי מסיסות נמוכה במצב מפוזר.
| טכניקה | כיצד סוניקציה מקדמת אותה | חשיבות ומגבלות |
|---|---|---|
| סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה בשיטת Fmoc | סוניקציה מאיצה את חדירת הפיפרידין ואת סילוק תוצרי Fmoc; משפרת את העברת חומצות האמינו המשופעלות אל תוך השרף התפוח; מפרקת אגרגטים על גבי השרף | הראיות החזקות ביותר ובדרך כלל התועלת הגדולה ביותר |
| סינתזה בפאזה מוצקה בשיטת Boc | סוניקציה משפרת את חדירת החומצה, החלפת הריאגנטים, הצימוד והשטיפה, בדומה לכימיית Fmoc | הכלת החומצה והחימום מחייבים זהירות |
| סינתזה בתמיסה/בפאזה נוזלית | סוניקציה משפרת את המסתן של חומצות אמינו מוגנות, מפזרת משקעים ומגבירה את המגע בתגובות דו־פאזיות או בתגובות בתרחיף | התועלת קטנה יותר כאשר התגובה כבר הומוגנית וקצבה מוגבל על ידי הקינטיקה הכימית |
| סינתזה באמצעות תג מסיס או על בסיס שיקוע | סוניקציה שומרת על פיזור תוצרי הביניים המתויגים במהלך הצימוד ויכולה לשפר את ההמסה לפני סינון או שיקוע | שימושית להכנות של חומרים בעלי מסיסות נמוכה או להכנות בכמויות גדולות; האולטרסאונד מסייע בעיקר בטיפול בחומרים ובמעבר מסה |
| סינתזה בזרימה או סינתזה רציפה | סוניקציה מסייעת לשמור על המגע בין השרף לנוזל ולצמצם אזורים מקומיים ללא זרימה או היווצרות אגרגטים | הגדלת קנה המידה באמצעות תכנון תא זרימה לחשיפה אחידה לאולטרסאונד |
| ליגציה של מקטעים וציקליזציה | סוניקציה יכולה להמיס מקטעים הידרופוביים, לפרק אגרגטים ולשפר מגע בין־מולקולרי | אין לה השפעה מאיצה מובנית על כל ליגציה כימית טבעית או מאקרוציקליזציה; דילול יתר או היווצרות אגרגטים בין־מולקולריים עשויים להישאר הגורמים הדומיננטיים |
| סינתזה אנזימטית של פפטידים | בעוצמה מתאימה, סוניקציה יכולה לשנות את הדינמיקה של האנזים ולשפר את מעבר הסובסטרט, במיוחד עם אנזימים מקובעים או בסביבות דו־פאזיות | תלויה מאוד באנזים; הספק מופרז גורם לאובדן הקיפול או לאובדן הפעילות |
| סינתזה ריבוזומלית/רקומביננטית | אין השפעה ישירה על התרגום | סוניקציה משמשת בעיקר לפירוק תאים לאחר הביטוי |
הגדלת קנה המידה באמצעות אולטרסאונד: עיבוד באצווה, בסחרור ובזרימה רציפה
ניתן לשלב סוניקטורים של Hielscher באופן חלק במערך הייצור הספציפי שלכם לסינתזת פפטידים.
שלוש תצורות כורים רלוונטיות להגדלת קנה המידה:
- סוניקציה באצווה היא פשוטה וגמישה, אך ככל שנפח הכלי גדל, קשה יותר לשלוט בה כדי להשיג סוניקציה הומוגנית מיטבית.
- עיבוד בסחרור מעביר את תכולת הכור שוב ושוב באמצעות משאבה דרך תא זרימה אולטרסוני, ומספק טיפול אחיד יותר תוך שמירה על הגמישות של עבודה באצווה.
- בזרימה רציפה, זרם התגובה עובר דרך אזור סוניקציה מבוקר אחד או יותר. ניתן להגדיר במדויק את זמן השהייה, ספיקת הזרימה והאנרגיה המושקעת, ולכן זו התצורה המועדפת לייצור בתפוקה גבוהה ובעל שחזוריות.
בתהליכים המבוססים על שרף, נתיב הזרימה, המשאבה והשסתומים חייבים להתאים לגודל החרוזים בלי לגרום לשחיקה או לחסימה. חלופה היא להשאיר את השרף בכור עם בחישה ולסחרר רק את הפאזה הנוזלית דרך התא האולטרסוני.
2x סוניקטורים תעשייתיים מדגם UIP4000hdT מחוברים לכור עם תא זרימה מפלדת אל־חלד לייצור פפטידים.
שאלות נפוצות על הגדלת קנה המידה של סינתזת פפטידים אולטרסונית
מהי סינתזת פפטידים אולטרסונית?
סינתזת פפטידים אולטרסונית משתמשת בגלי קול בעוצמה גבוהה לשיפור הערבוב, מעבר המסה וקינטיקת התגובה במהלך הרכבת הפפטיד. קוויטציה אקוסטית מסייעת לריאגנטים לחדור לשרף תפוח, מפזרת אגרגטים ומאיצה את שלבי הצימוד, הסרת קבוצות ההגנה, השטיפה והביקוע.
כיצד אולטרסאונד משפר סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה?
בסינתזת פפטידים בפאזה מוצקה בסיוע אולטרסאונד (US-SPPS), סוניקציה משפרת את המגע בין הפפטיד הקשור לשרף לבין הריאגנטים המומסים. הדבר יכול לקצר את מחזורי התגובה, לקדם צימוד שלם יותר ולהפחית חסרים ברצף, במיוחד בסינתזה של פפטידים הידרופוביים, נוטים להיווצרות אגרגטים או קשים לסינתזה מסיבות אחרות.
האם סוניקציה יכולה להגדיל את נצולת הפפטיד ולשפר את טוהרו?
סוניקציה יכולה לשפר את שיעור ההמרה, את נצולת התוצר הגולמי ואת הטוהר באמצעות קידום פיזור אחיד של ריאגנטים וצמצום צימוד בלתי שלם. התוצאה תלויה ברצף הפפטיד, בשרף, בממס, בכימיית הצימוד ובפרמטרים האולטרסוניים, ולכן יש למטב כל תהליך ולאמת אותו בשיטות אנליטיות.
באילו שלבים של סינתזת פפטידים ניתן להשתמש בסוניקציה?
אולטרסאונד יכול לסייע בתפיחת השרף, בהסרת קבוצות ההגנה Fmoc או Boc, בצימוד חומצות אמינו, בשטיפה, בעיבוי מקטעים, בציקליזציה ובביקוע מהנשא המוצק. הוא יכול גם לשפר המסה והעברת מסה בסינתזת פפטידים בפאזה נוזלית ובסינתזה בסיוע תג.
גלו את סינתזת הפפטידים האולטרסונית – לסינתזת פפטידים בפאזה מוצקה וכן – לסינתזה בפאזה נוזלית בטכניקת TAGGING!
האם סינתזת פפטידים אולטרסונית מתאימה לרצפים קשים לסינתזה?
כן. אולטרסאונד מועיל במיוחד לרצפים הידרופוביים ולרצפים הנוטים לאגרגציה, משום שקוויטציה ומיקרו־זרימה מסייעות בפירוק אגרגטים על גבי השרף ומשפרות את גישת המגיבים לאתרים הפעילים. צימודים קשים עדיין עשויים לדרוש מגיבים שעברו אופטימיזציה, צימוד חוזר או התאמה של תנאי התגובה.
האם ניתן להגדיל את קנה המידה של סינתזת פפטידים אולטרסונית?
ניתן להעביר סינתזת פפטידים אולטרסונית מניסויי מעבדה לייצור באצוות, בסחרור חוזר או בזרימה רציפה. הגדלת קנה המידה מושגת באמצעות שמירה על פרמטרים קריטיים כגון אמפליטודה, אנרגיה סגולית, טמפרטורה וזמן שהייה, תוך הגדלת ההספק האולטרסוני, שטח הסונוטרודה או מספר מודולי העיבוד.
מהי המשמעות של הגדלת קנה מידה ליניארית בסוניקציה?
הגדלת קנה מידה ליניארית פירושה שהתפוקה יכולה לגדול בקירוב ביחס ישר להספק האולטרסוני המותקן, כאשר האנרגיה הנדרשת ליחידת נפח ושאר תנאי התהליך נשארים קבועים. לדוגמה, הכפלת ההספק האולטרסוני האפקטיבי יכולה להכפיל בקירוב את ספיקת הזרימה, בתנאי שנשמרים גאומטריית הריאקטור, הטמפרטורה ויעדי איכות המוצר.
מדוע מכשירי הסוניקציה של Hielscher מתאימים להגדלת קנה המידה של ייצור פפטידים?
מכשירי הסוניקציה של Hielscher מכסים טווחי הספק למעבדה, לפיילוט ולתעשייה, תוך שימוש בפרמטרי הפעלה עקביים הניתנים לבקרה. האמפליטודה המתכווננת, רישום הנתונים האוטומטי, ניטור הטמפרטורה והלחץ, התאימות לתאי זרימה והתצורות המודולריות שלהם תומכים בהעברת תהליכים באופן הדיר ובייצור אמין.
האם מכשירי הסוניקציה של Hielscher יכולים לפעול בייצור פפטידים רציף?
כן. ניתן לשלב את מכשירי הסוניקציה התעשייתיים של Hielscher בלולאות סחרור חוזר ובריאקטורים עם תאי זרימה המותקנים בקו ופועלים בזרימה רציפה. תצורות אלה מספקות זמן שהייה והזנת אנרגיה מבוקרים, תוך צמצום השונות בין אצוות. מערכות תעשייתיות מתוכננות לפעולה רציפה 24/7 בתנאי ייצור תובעניים.
האם אמבטיות אולטרסוניות או מכשירי סוניקציה מסוג גשוש מתאימים יותר לסינתזת פפטידים?
אמבטיות אולטרסוניות עשויות להיות נוחות לסריקה ראשונית ולטיפול בו־זמני בכלים סגורים קטנים. מכשירי סוניקציה מסוג גשוש מעבירים אולטרסאונד ישירות לתווך, ומציעים עוצמה גבוהה יותר, בקרה טובה יותר על הפרמטרים ויכולת רבה יותר להגדלת קנה המידה. לפיכך, גשושים ותאי זרימה מועדפים בדרך כלל לייצור בקנה מידה של פיילוט ולייצור תעשייתי.
כיצד מבקרים את הטמפרטורה במהלך סינתזת פפטידים אולטרסונית?
מכיוון שסוניקציה מכניסה אנרגיה לתערובת התגובה, קירור יעיל הוא חיוני. מכשירי הסוניקציה של Hielscher זמינים עם כלים בעלי מעטפת קירור, מחליפי חום חיצוניים, סחרור חוזר מבוקר טמפרטורה וסוניקציה בפולסים, כך שנמנעת התחממות יתר ביעילות. חיישני טמפרטורה הניתנים לחיבור וגבולות טמפרטורה הניתנים לתכנות מאפשרים ניטור ורישום אמינים של הטמפרטורה לאורך כל שלבי הפיתוח והייצור.
כיצד בוחרים מכשיר סוניקציה של Hielscher לסינתזת פפטידים?
הבחירה תלויה בנפח האצווה, בספיקת הזרימה הרצויה, בממס, בצמיגות, בריכוז המוצקים או השרף, באנרגיה הסגולית הנדרשת ובלוח הזמנים של הייצור. בדיקות מעבדה קובעות את טווח תנאי התהליך היעילים, ולאחר מכן ניתן להתאים את גודלם של מכשיר הסוניקציה של Hielscher, הסונוטרודה ותצורת תא הזרימה לתפוקה המיועדת.
ספרות / מקורות
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
