הגדלת היקף סינתזת פפטידים: אסטרטגיות אולטראסוניות לייצור אצווה + זרימה רציפה
סינתזה של פפטידים בסיוע סוניקציה משלבת את הכימיה המוכרת של הפפטידים עם אנרגיה מכנית בתדר גבוה כדי להאיץ את תהליכי התגובה וההובלה. קוויטציה אקוסטית – היווצרות וקריסה של בועות מיקרוסקופיות – יוצר ערבוב מקומי אינטנסיבי, מיקרו-סילונים וכוחות גזירה. בסינתזת פפטידים, השפעות אלו משפרות את הובלת החומרים הכימיים, את הרטבת הרזין, את המסת החומרים ואת פירוק האגרגטים. לפיכך, אולטרסאונד בתדר נמוך משמש בעיקר ככלי להגברת יעילות התהליך: הוא אינו מחליף את הכימיה של הצימוד, אך יכול להפוך את תהליכי הצימוד, הסרת ההגנה, השטיפה, הפיצול והעיבוד למהירים ויעילים יותר באופן משמעותי.
האתגר הכרוך בהגדלת היקף ייצור הפפטידים
הרחבת ייצור הפפטידים מהמעבדה לייצור תעשייתי מהווה אתגר, שכן חוסר יעילות קטן מצטבר לאורך מחזורי צימוד והסרת הגנה רבים, מה שמפחית את התפוקה ומגביר את כמות הזיהומים שקשה להסיר. כורים גדולים יותר מטילים גם מגבלות על הערבוב, העברת החום, התנפחות השרף והובלת החומרים הכימיים, בעוד שצריכת הממסים, דרישות הטיהור ועלויות הייצור עולות באופן חד. לפיכך, הגדלת היקף הייצור מוצלחת חייבת לשמר את אחידות התגובה ואת איכות המוצר, תוך שמירה על תפוקה ניתנת לשחזור, שימוש יעיל במשאבים ובקרה מדויקת על כל הפרמטרים הקריטיים בתהליך.
אצווה פרמצבטית עם מכשיר סוניקציה UIP2000hdT לשיפור סינתזת הפפטידים
אסטרטגיות לסינתזת פפטידים בסיוע סוניקציה
סינתזה אולטראסונית של פפטידים בשלב מוצק
סינתזת פפטידים בשלב מוצק (SPPS) בשיטת Fmoc היא השיטה האולטראסונית שנחקרה באופן הנרחב ביותר. השימוש באולטרסאונד משפר את חדירתם של חומרי הסרת ההגנה וחומרי הצימוד אל תוך חרוזי הפולימר התפוחים, תוך צמצום שכבות הגבול הסטטיות סביב הרזין. כמו כן, הוא יכול לשבש את תהליך ההתלכדות על הרזין, שהוא גורם חשוב להמרה לא מלאה בפפטידים הידרופוביים ובפפטידים אחרים “קשה” רצפים.
מחקרים ניסיוניים הוכיחו כי ניתן לבצע סינתזה בסיוע אולטרסאונד של פפטידים בעלי פעילות ביולוגית המכילים עד 44 שאריות, תוך צריכת חומרים נמוכה יותר וזמני תגובה קצרים יותר, מבלי שנצפתה עלייה בתגובות הלוואי העיקריות בתנאים שדווחו. (ראו: Merlino et al., 2019)
מחקר אחר דיווח על קיצור זמן ההרכבה פי 4 עד פי 14 עבור פפטידים נבחרים; פפטיד בן 25 חומצות אמינו, העשיר בשאריות הידרופוביות, הורכב תוך 347 דקות. (ראו: Silva et al., 2021)
ניתן לבצע בדיקת אולטרסאונד במהלך:
- התנפחות של שרף והחלפת חומרים כימיים
- הסרת ההגנה מ-Fmoc או מ-Boc
- הפעלה וצימוד של חומצות אמינו
- שטיפה ביניים
- ציקליזציה על גבי שרף
- ניתוק הפפטיד המוגמר מהמצע
סינתזה בשלב נוזלי וסינתזה בסיוע תגים
אולטרסאונד יכול גם להגביר את יעילות הסינתזה הקונבנציונלית של פפטידים בשלב נוזלי, באמצעות האצת המסה, פיזור החומרים הכימיים והעברת המסה בתערובות הטרוגניות או צמיגות. יתרונו בולט בדרך כלל כאשר התהליך מוגבל על ידי הערבוב או ההובלה; בתגובה הומוגנית לחלוטין, הנשלטת אך ורק על ידי קינטיקה כימית פנימית, השיפור עשוי להיות מצומצם יותר.
בסינתזת פפטידים בסיוע תגים, הפפטיד המתהווה נקשר לעוגן אורגני מסיס או ניתן לשקיעה. התגובות מתרחשות בתמיסה, ולאחר מכן החומר הביניים המתויג מופרד באמצעות שקיעה או סינון. טיפול בקול יכול להאיץ את תהליכי הצימוד, הסרת ההגנה, הציקליזציה ופיצול התג, תוך שמירה על חומרים ביניים בעלי מסיסות נמוכה במצב מפוזר.
| טכניקה | כיצד הסוניקציה תורמת לכך | חשיבות ומגבלות |
|---|---|---|
| סינתזת פפטידים בשלב מוצק בשיטת Fmoc | השימוש באולטרסאונד מאיץ את חדירת הפיפרידין ואת הסרת תוצרי ה-Fmoc; משפר את העברת חומצות האמינו המופעלות אל תוך הרזין התפוח; ומונע הצטברות על הרזין | הראיות החזקות ביותר, ובדרך כלל התועלת הגדולה ביותר |
| סינתזה בשלב מוצק בשיטת Boc | השימוש באולטרסאונד משפר את חדירת החומצה, חילוף הריאגנטים, הצימוד והשטיפה, בדומה לכימיה מסוג Fmoc | יש לנקוט זהירות בעת אחסון חומצות וחימום |
| סינתזה בתמיסה/בשלב נוזלי | השימוש באולטרסאונד משפר את התמוססותן של חומצות אמינו מוגנות, מפרק משקעים ומגביר את המגע בתגובות דו-פאזיות או בתגובות מסוג "סלורי" | היתרון קטן יותר כאשר התגובה כבר הומוגנית ומוגבלת בקצב הכימי |
| סינתזה באמצעות תווית מסיסה או באמצעות משקעים | השימוש באולטרסאונד שומר על פיזורם של החומרים הביניים המסומנים במהלך תהליך הצימוד, ויכול לשפר את המסתם לפני הסינון או השקיעה | שימושי עבור תכשירים בעלי מסיסות נמוכה או תכשירים בתפזורת; האולטרסאונד מסייע בעיקר בטיפול ובהעברת מסה |
| סינתזה זורמת או רציפה | השימוש בסוניקציה מסייע בשמירה על מגע בין השרף לנוזל ובמניעת אזורים מקומיים של קיפאון או הצטברות | הרחבת הייצור באמצעות תכנון תא זרימה לחשיפה אחידה לאולטרסאונד |
| חיבור קטעים ויצירת טבעות | השימוש באולטרסאונד יכול להפוך שברי חומרים הידרופוביים למסיסים, לפרק אגרגטים ולשפר את המגע הבין-מולקולרי | זה אינו מאיץ כשלעצמו כל ליגציה כימית או מקרוציקליזציה טבעית; דילול יתר או אגרגציה בין-מולקולרית עשויים להישאר הדומיננטיים |
| סינתזה אנזימטית של פפטידים | בעוצמה מתאימה, טיפול באולטרסאונד יכול לשנות את הדינמיקה האנזימטית ולשפר את העברת הסובסטרט, במיוחד במקרה של אנזימים מקובעים או במדיום דו-פאזי | תלוי מאוד באנזימים; עוצמה מוגזמת גורמת לפרישת המבנה או להשבתה |
| סינתזה ריבוזומית/רקומביננטית | אין השפעה ישירה על התרגום | שיטת הסוניקציה משמשת בעיקר לפירוק תאים לאחר ביטוי |
הרחבת תהליך אולטראסוני: עיבוד אצווה, עיבוד עם מחזור חוזר ועיבוד בזרימה רציפה
ניתן לשלב את מכשירי הסוניקציה של Hielscher בצורה חלקה במערך הייצור הספציפי שלכם לסינתזת פפטידים.
יש שלוש תצורות של כורים הרלוונטיות להגדלת היקף הייצור:
- עיבוד קולי אצווה הוא תהליך פשוט וגמיש, אך ככל שנפח המיכל גדל, כך מתגבר הקושי לשלוט בתהליך כדי להשיג עיבוד קולי הומוגני מיטבי.
- תהליך מחזור הזרימה מזרים את תכולת הכור שוב ושוב דרך תא זרימה קולי, ובכך מספק טיפול אחיד יותר תוך שמירה על גמישות בתהליכי ייצור אצוותיים.
- בזרימה רציפה, זרם התגובה עובר דרך אזור אחד או יותר של טיפול בקוליות מבוקרת. ניתן לקבוע במדויק את זמן השהייה, קצב הזרימה וכמות האנרגיה המושקעת, מה שהופך את הארכיטקטורה הזו למועדפת לייצור בעל תפוקה גבוהה וניתן לשחזור.
בתהליכים המבוססים על שרף, על מסלול הזרימה, המשאבה והשסתומים להתאים לגודל הגרגרים מבלי לגרום לשחיקה או לחסימה. חלופה לכך היא להחזיק את השרף בכור מעורבב ולהזרים רק את השלב הנוזלי דרך התא האולטראסוני.
2 יחידות של מכשיר סוניקטור תעשייתי מדגם UIP4000hdT המחובר לכור תא זרימה מפלדת אל-חלד לייצור פפטידים.
שאלות נפוצות בנוגע להרחבת היקף הסינתזה האולטראסונית של פפטידים
מהי סינתזה אולטראסונית של פפטידים?
בסינתזת פפטידים באמצעות אולטרה-סאונד נעשה שימוש בגלי קול בעוצמה גבוהה כדי לשפר את הערבוב, העברת המסה וקינטיקת התגובה במהלך הרכבת הפפטידים. קוויטציה אקוסטית מסייעת לחומרים הכימיים לחדור לתוך הרזין שהתנפח, מפרקת אגרגטים ומאיצה את שלבי הצימוד, הסרת ההגנה, השטיפה והפיצול.
כיצד משפר האולטרסאונד את סינתזת הפפטידים בשלב מוצק?
בסינתזה של פפטידים בשלב מוצק בסיוע אולטרסאונד (US-SPPS), השימוש באולטרסאונד משפר את המגע בין הפפטיד הקשור לשרף לבין החומרים המומסים. דבר זה יכול לקצר את מחזורי התגובה, לקדם צימוד מלא יותר ולהפחית מחיקות ברצף, במיוחד בעת סינתזה של פפטידים הידרופוביים, הנוטים להתאגד או פפטידים קשים אחרים.
האם שימוש באולטרסאונד יכול להגדיל את התפוקה והטוהר של הפפטידים?
שימוש באולטרסאונד יכול לשפר את היעילות, את התפוקה הגולמית ואת הטוהר, באמצעות קידום פיזור אחיד של החומרים הכימיים והפחתת תופעות של צימוד לא מלא. התוצאה תלויה ברצף הפפטיד, בשרף, בממס, בתהליך הכימי של הצימוד ובפרמטרים האולטרסוניים; לפיכך, יש לבצע אופטימיזציה של כל תהליך ולאמת אותו באופן אנליטי.
אילו שלבים בתהליך סינתזת הפפטידים ניתן לבצע באמצעות אולטרסאונד?
אולטרסאונד יכול לסייע בתהליך התנפחות הרזין, הסרת ההגנה מ-Fmoc או מ-Boc, צימוד חומצות אמינו, שטיפה, עיבוי מקטעים, ציקליזציה וניתוק מהמצע המוצק. כמו כן, הוא יכול לשפר את תהליך ההמסה והעברת המסה בסינתזת פפטידים בשלב נוזלי ובסינתזת פפטידים בסיוע תגים.
גלו את סינתזת הפפטידים באמצעות אולטרסאונד – לסינתזה של פפטידים בשלב מוצק ו – סינתזה בשיטת TAGGING בשלב נוזלי!
האם סינתזת פפטידים באמצעות אולטרסאונד מתאימה לרצפים מורכבים?
כן. אולטרסאונד מועיל במיוחד עבור רצפים הידרופוביים ונוטים לאגרגציה, שכן תופעות הקוויטציה והמיקרו-זרימה מסייעות בפירוק האגרגציות על גבי הרזין ומשפרות את גישת החומרים הכימיים לאתרים התגובתיים. במקרים של צימוד קשה, ייתכן שיהיה צורך בחומרים כימיים מותאמים, בצימוד חוזר או בתנאי תגובה מותאמים.
האם ניתן להגדיל את היקף הסינתזה האולטראסונית של פפטידים?
ניתן להעביר את סינתזת הפפטידים באמצעות אולטרסאונד מניסויים במעבדה לייצור אצווה, לייצור במחזור סגור או לייצור בזרימה רציפה. ההרחבה מתבצעת על ידי שמירה על פרמטרים קריטיים כגון משרעת, אנרגיה ספציפית, טמפרטורה וזמן שהייה, תוך הגדלת עוצמת האולטרסאונד, שטח הסונוטרוד או מספר מודולי העיבוד.
מהי משמעותה של "מדרגיות ליניארית" בתחום האולטראסוניקה?
מדרגיות ליניארית פירושה שהתפוקה יכולה לעלות באופן יחסי בערך לעוצמת האולטראסאונד המותקנת, כאשר האנרגיה הנדרשת ליחידת נפח ותנאי תהליך אחרים נשארים קבועים. לדוגמה, הכפלת עוצמת האולטראסאונד היעילה עשויה להכפיל בערך את קצב הזרימה, בתנאי שנשמרים המאפיינים הגיאומטריים של הכור, הטמפרטורה ויעדי איכות המוצר.
מדוע מכשירי האולטרסאונד של Hielscher מתאימים להגדלת היקף הייצור של פפטידים?
מכשירים סוניקטוריים של חברת Hielscher מכסים טווחי הספק של מעבדה, פיילוט ותעשייה, תוך שימוש בפרמטרים תפעוליים עקביים וניתנים לשליטה. המשרעת הניתנת לכוונון, רישום הנתונים האוטומטי, ניטור הטמפרטורה והלחץ, התאימות לתאי זרימה והתצורות המודולריות שלהם תומכים בהעברת תהליכים הניתנת לשחזור ובייצור אמין.
האם מכשירי האולטרסאונד של Hielscher יכולים לפעול בייצור פפטידים רציף?
כן. ניתן לשלב את מכשירי האולטרסאונד התעשייתיים של Hielscher במעגלי מחזור ובכורים רציפים עם תא זרימה מובנה. תצורות אלו מאפשרות שליטה בזמן השהייה ובכמות האנרגיה המושקעת, תוך צמצום השונות בין אצוות ייצור שונות. המערכות התעשייתיות מתוכננות לפעולה רציפה 24 שעות ביממה, 7 ימים בשבוע, בתנאי ייצור תובעניים.
מה עדיף לסינתזה של פפטידים: אמבטיות אולטראסוניות או מכשירי סוניקציה עם בדיקה?
אמבטיות אולטראסוניות עשויות להיות נוחות לביצוע סינון ראשוני וטיפול בו-זמני בכלי דם קטנים וסגורים. מכשירי אולטראסוניקה מסוג בדיקה (סונרים) מעבירים את גלי האולטראסאונד ישירות לתוך המדיום, ומספקים עוצמה גבוהה יותר, שליטה טובה יותר בפרמטרים ויכולת הרחבה רבה יותר. לפיכך, בדרך כלל מעדיפים להשתמש בבדיקות ובתאי זרימה בייצור ניסיוני ותעשייתי.
כיצד מבקרים את הטמפרטורה במהלך סינתזה אולטראסונית של פפטידים?
מכיוון שהשימוש באולטרסאונד מכניס אנרגיה לתערובת התגובה, קירור יעיל הוא חיוני. מכשירי האולטרסאונד של Hielscher זמינים עם מיכלים בעלי מעטפת, מחליפי חום חיצוניים, מערכת מחזור מבוקרת טמפרטורה ושימוש באולטרסאונד פועם, כך שמתבצע מניעה יעילה של התחממות יתר. חיישני טמפרטורה ניתנים לחיבור ומגבלות טמפרטורה ניתנות לתכנות מאפשרים ניטור ורישום אמינים של הטמפרטורה לאורך כל שלבי הפיתוח והייצור.
כיצד בוחרים מכשיר סוניקציה של Hielscher לסינתזה של פפטידים?
הבחירה תלויה בנפח האצווה, בקצב הזרימה הרצוי, בממס, בצמיגות, בריכוז המוצקים או השרף, באנרגיה הספציפית הנדרשת ובלוח הזמנים של הייצור. בדיקות מעבדה קובעות את טווח התנאים היעיל לתהליך, ולאחר מכן ניתן להתאים את גודל מכשיר הסוניקטור של Hielscher, הסונוטרוד ותצורת תא הזרימה לתפוקה המיועדת.
ספרות / מקורות
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Hielscher Ultrasonics מייצרת הומוגנייזרים קוליים בעלי ביצועים גבוהים מ המעבדה ל גודל תעשייתי.