סינתזת פפטידים אולטרסונית באמצעות טכניקת TAGGING
סינתזת פפטידים היא אבן יסוד במחקר ובפיתוח של תרופות, אך השיטות המקובלות – סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה (SPPS) וצימוד קלאסי בפאזת תמיסה – עדיין דורשות עבודה רבה, גורמות לבזבוז ריאגנטים וקשות להגדלה לקנה מידה רחב. חלופה יעילה יותר התפתחה משילוב של שתי אסטרטגיות אורתוגונליות: טכניקת TAGGING (קבוצת עיגון זמנית) להרכבת פפטידים בפאזת תמיסה, ועיבוד אולטרסוני (סונוכימי) להאצת שלבי הצימוד, הסרת קבוצות ההגנה ועיבוד תערובת התגובה. יחד, הן מאפשרות ייצור פפטידים טיפוליים בקנה מידה הנע מגרמים ועד לייצור בכמויות גדולות – כגון הליפופפטיד האנטיביוטי/נוגד הסרטן lipobactin – בטוהר גבוה, עם פחות עבודת טיהור ועם הרבה פחות פעולות ידניות.
אילו יתרונות מציעה סינתזת פפטידים אולטרסונית?
- כדאיות כלכלית של עבודה בפאזת תמיסה: התגובות מתבצעות בתמיסה תוך צריכה נמוכה משמעותית של חומצות אמינו בהשוואה לסינתזת פפטידים בפאזה מוצקה
- טיהור המבוסס על סינון: הפפטיד הקשור ל-TAG שוקע בממסים קוטביים, ולכן תוצרי הביניים מבודדים באמצעות סינון פשוט – ללא צורך בכרומטוגרפיית עמודה או באפיון בכל שלב.
- חיסכון עצום בעבודה: ביטול שלבי הטיהור של תוצרי הביניים והבדיקות הספקטרליות חוסך שעות עבודה רבות לאורך מערך סינתזה שלם.
- האצה סונוכימית: סוניקציה מקצרת כל שלב קריטי – הסרת קבוצת ההגנה Fmoc, צימוד בשרשרת הצדדית, ציקליזציה והסרה כוללת של קבוצות ההגנה – מבלי לפגוע בסלקטיביות.
- ניצולות גבוהות, טוהר גבוה: כל צימוד של מקטעים וההרכבה הסופית של lipobactin מתבצעים בניצולת גבוהה; ההסרה הכוללת של קבוצות ההגנה מניבה את תוצר המטרה בניצולת של ~83 %.
- מוכנות לייצור בכמויות גדולות: טכניקת TAGGING מתוארת במפורש כמאפשרת הכנת פפטידים בכמויות גדולות וברמת הטוהר המרבית, ולכן היא מהווה דרך מעשית להפקת ליפופפטידים בעלי חשיבות טיפולית בכמויות של גרמים וקילוגרמים.
- תאימות מלאה לשיטות: הגישה תואמת באופן מלא ל-SPPS המקובלת ולכימיה בפאזת תמיסה, כך שאפשר להמשיך להשתמש ללא שינוי באסטרטגיות הקיימות של קבוצות הגנה (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) ובריאגנטים לצימוד (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP).
ספרו לנו על האתגרים בתהליך סינתזת הפפטידים שלכם. מומחי הסוניקציה שלנו ימליצו לכם על תצורת הסוניקטור האידיאלית ליעדי ייצור הפפטידים שלכם!
סוניקטור תעשייתי UIP2000hdT עם ריאקטור אצווה ליישומים פרמצבטיים לשיפור סינתזת הפפטידים
מהי טכניקת TAGGING?
בגישת TAG, מקטע פפטידי מעוגן בקשר קוולנטי לקבוצת עיגון ניתנת להסרה, דמוית שרף (TAG), שנשארת בתמיסה. כך ניתן לטפל בשרשרת המתארכת כמו בפפטיד בפאזה מוצקה, אך בפאזה נוזלית:
- לאחר כל צימוד או הסרה של קבוצות הגנה, הפפטיד הקשור ל-TAG נאסף כמוצק באמצעות סינון פשוט או שיקוע בתווך קוטבי או בתווך המכיל נוגד ממס, ואילו זיהומים מסיסים ותוצרי לוואי נשטפים ומורחקים.
- מכיוון שהפפטיד נשאר מחובר למקשר, מתבטל במידה רבה הצורך בכרומטוגרפיית עמודה ובאפיון מלא של כל תוצר ביניים, וכך נחסכים זמן ומאמץ אנושי ניכרים.
- ניתן לבצע תגובות בפאזת תמיסה תוך שימוש בכמות קטנה בהרבה של חומצות אמינו בהשוואה ל-SPPS, והתוצר הסופי משתחרר באמצעות ביקוע קבוצת TAG לקראת סוף הסינתזה.
עבור lipobactin, ברטרוסינתזה נעשה שימוש בשלושה מקטעים – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH והמקטע הליפידי C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – שצומדו באסטרטגיה של עיבוי מקטעים לקבלת הפפטיד הארוך בניצולות גבוהות מאוד. (ראו Ramya et al., 2025)
הסינתזה המלאה של הפפטיד lipobactin בסיוע TAG מואצת באמצעות סוניקציה.
(מחקר: Ramya et al., 2025)
כיצד סוניקציה משפרת סינתזה של פפטידים בפאזה המומסת
טיפול אולטרסוני משמש להגברת היעילות ולקיצור השלבים המרכזיים בפאזה המומסת. בסינתזה של ליפובקטין, כפי שתוארה על ידי Ramya et al. (2025), סוניקציה מיושמת בשלבים הבאים:
מכיוון שכימיית TAG כבר מספקת תוצרי ביניים כמוצקים הניתנים לסינון, טיפול אולטרסוני ו-TAGGING משלימים זה את זה: אולטרסאונד מאיץ מעבר מסה, ערבוב וקינטיקת תגובה, ואילו העוגן שומר על הפפטיד כמוצק הניתן להשבה, לתהליך עבודה נקי המצריך שימוש מועט בכרומטוגרפיה.
מכשיר הסוניקציה UP200St: כור עם ערבול אולטרסוני לסינתזה מואצת של פפטידים.
הגדלה קלה של היקף ייצור פפטידים בטוהר גבוה באמצעות סוניקציה
אתגר נפוץ במעבר של תהליכי ייצור פפטידים ותרופות פפטידיות משולחן המעבדה לייצור הוא שימור האפקט הסונוכימי בנפחים גדולים יותר ובזרימה רציפה. Hielscher נותנת לכך מענה באמצעות מגוון רציף של מעבדים אולטרסוניים, מהיקף מעבדתי ועד להיקף תעשייתי מלא, המספקים הספק שעבר תיקוף וניתן לשחזור ובקרת תהליך מתועדת.
מכשיר הסוניקציה התעשייתי UIP4000hdT (4000W, 20kHz) לסינתזה של פפטידים המשופרת באמצעות אולטרסאונד
שאלות נפוצות על סינתזה של פפטידים באמצעות TAG בסיוע סוניקציה
מהי סינתזה של פפטידים בפאזה נוזלית (LPPS)?
סינתזה של פפטידים בפאזה נוזלית (LPPS) היא שיטה לבניית פפטידים שלב אחר שלב בתמיסה באמצעות כלים קלאסיים של כימיה אורגנית. זוהי אחת מארבע השיטות העיקריות ליצירת פפטידים, והיא ידועה ככדאית מבחינה כלכלית, כניתנת להגדלת היקף וכידידותית ביותר לסביבה מבין הגישות לסינתזה של פפטידים. היא מתאימה במיוחד לפפטידים קצרים יותר, אם כי היא עלולה להיתקל בקשיים ברצפים ארוכים יותר בשל האתגרים שבשמירה על עקביות התגובות ועל מסיסות ובהסרת תוצרי לוואי בלתי רצויים.
כיצד אולטרסאונד משפר סינתזה של פפטידים בפאזה נוזלית?
אולטרסאונד (סוניקציה) משפר LPPS באמצעות האצת שלבי הצימוד ושלבי הסרת קבוצות ההגנה כאחד. הגלים האולטרסוניים משפרים את מעבר המסה ואת קינטיקת התגובה, ומובילים ליתרונות הבאים:
- קיצור זמני התגובה: ניתן לקצר במידה ניכרת את מחזורי הצימוד והסרת קבוצות ההגנה
- ניצולות גבוהות יותר: המרה מלאה יותר בכל שלב
- שיפור טוהר התוצר הגולמי: פחות תוצרי לוואי של צימוד לא מלא
- צריכה מופחתת של ריאגנטים: נדרשים פחות אקוויוולנטים של ריאגנטים לצימוד ושל חומצות אמינו בזכות תגובות מהירות ויעילות יותר
מהי סינתזה של פפטידים בסיוע תג (TAPS)?
סינתזה של פפטידים בסיוע תג (TAPS) היא מקרה פרטי של סינתזה של פפטידים בפאזה נוזלית, שבו פפטידים נבנים שלב אחר שלב בתמיסה באמצעות תגים אורגניים מסיסים במקום מצע מוצק. תגים אלה, המקבילים למצעים המוצקים ב-SPPS, מפשטים את הבידוד לאחר כל שלב בסינתזה באמצעות מתן אפשרות להפרדה על ידי שיקוע, סינון או מיצוי. התגים חייבים להתמוסס בממסים אורגניים ובה בעת להישאר מובחנים מחומרים אחרים.
כיצד אולטרסאונד משפר את תהליך TAGGING?
כאשר משלבים סוניקציה עם סינתזה בסיוע TAG, היתרונות כוללים:
- מחזורי צימוד והסרת הגנה מהירים יותר – אולטרסאונד מאיץ את התגובות בפאזה של תמיסה ומקצר את הזמן הנדרש לכל שלב
- שיפור המסיסות ומעבר המסה – קוויטציה אולטרסונית מסייעת לשמור על הומוגניות הפפטיד הקשור ל-TAG בתמיסה, דבר חיוני משום שמסיסות היא יתרון מרכזי של TAPS על פני SPPS
- הפחתת כמות הריאגנטים – יעילות תגובה גבוהה יותר פירושה שנדרשים פחות אקוויוולנטים של חומצות אמינו וריאגנטים לצימוד
- תגובות המתקדמות באופן מלא יותר – הפחתת תוצרי לוואי של צימוד לא מלא, המובילה לטוהר גבוה יותר של התוצר הגולמי ולפישוט הטיהור בהמשך התהליך
דוגמה בולטת היא הסינתזה הכוללת של lipobactin בסיוע TAG ובתיווך סוניקציה, שהדגימה כי טכניקת TAGGING תואמת באופן מלא לשיטות בפאזה של תמיסה וכי סוניקציה מאפשרת ניצולות גבוהות בכל אחד מהשלבים. (ראו Ramya et al., 2025)
אילו אורכי פפטידים ניתן להשיג באמצעות TAPS בסיוע אולטרסאונד?
פפטידים קצרים עד בינוניים (~5–20 שיירים) הם הטווח המיטבי, שבו TAPS מספקת טוהר גבוה ותוצאות אמינות.
ניתן להשיג פפטידים ארוכים יותר באמצעות אסטרטגיית עיבוי מקטעים: מקטעים קטנים יותר (בני 6–10 שיירים) מסונתזים כשהם קשורים ל-TAG, ולאחר מכן מצומדים זה לזה ליצירת תוצר המטרה באורכו המלא.
עבור תוצרי מטרה ארוכים מאוד או מורכבים, ניתן להשתמש בגישה משולבת של SPPS/TAPS.
גלו כיצד סוניקציה שיפרה את סינתזת הפפטידים בפאזה מוצקה (SPPS)!
האם ניתן להגדיל את היקף סינתזת הפפטידים בפאזה נוזלית בסיוע אולטרסאונד לייצור תעשייתי?
כן, ניתן לשלב מכשירי סוניקציה תעשייתיים – כגון דגמי UIP2000hdT או UIP4000hdT של Hielscher – בכורים מנתיים ובתאי זרימה, וכך לאפשר ייצור פפטידים בקנה מידה גדול. התקנתם בכורים קיימים מאפשרת לשפר תהליכי סינתזת פפטידים מבוססים.
מהם היתרונות העיקריים של LPPS בסיוע אולטרסאונד לעומת LPPS קונבנציונלית?
- מהירות: זמני התגובה מתקצרים באופן דרמטי בכל שלב של צימוד והסרת הגנה.
- יעילות: ניצולות גבוהות יותר בכל שלב מובילות לניצולת כוללת גבוהה יותר עבור פפטידים מרובי שיירים.
- קיימות: פחות אקוויוולנטים של ריאגנטים, וייתכן שגם פחות ממס, בזכות תגובות מהירות יותר.
- נגישות: נדרש רק אמבט אולטרסוני סטנדרטי, ללא מכשור ייעודי.
- תאימות: מתאימה לשימוש בריאגנטים סטנדרטיים לצימוד (DIC, HATU, TBTU, Oxyma וכו׳) ובאסטרטגיות של קבוצות הגנה (Boc, Fmoc).
ספרות / מקורות
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
CupHorn אולטרסוני לסוניקציה עוצמתית של מבחנות ובקבוקונים סגורים לצורך סוניקציה סטרילית של פפטידים.
