סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה – יעילה יותר בעזרת סוניקציה
סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה (SPPS) היא השיטה הנפוצה לסינתזת פפטידים. סוניקציה היא כלי אמין להגברת היעילות של סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה, המוביל לניצולות גבוהות יותר, לטוהר משופר, להיעדר רצמיזציה ולהאצה משמעותית של קצב התגובה. Hielscher Ultrasonics מציעה מגוון פתרונות אולטרסוניים לסינתזת פפטידים, לביקוע ולהמסה.
סינתזת פפטידים אולטרסונית בפאזה מוצקה
סוניקציה כבר מיושמת באופן נרחב כשיטה להגברת היעילות בסינתזה אורגנית, ויתרונותיה מוכרים היטב: קיצור דרסטי של זמני התגובה, ניצולות גבוהות יותר, פחות תוצרי לוואי, הפעלת מסלולי תגובה שלא ניתן היה להשיג בדרכים אחרות ו/או סלקטיביות טובה יותר. ניתן להשיג יתרונות ניכרים גם כאשר משלבים סוניקציה בתגובות של סינתזת פפטידים. תוצאות מחקרים הראו שסינתזת פפטידים בסיוע אולטרסאונד משיגה ניצולת מיטבית של פפטידים בעלי טוהר גבוה, ללא רצמיזציה ובזמן תגובה קצר.
- ניצולות פפטידים גבוהות
- סינתזה מהירה יותר באופן משמעותי
- טוהר פפטידים גבוה יותר
- ללא רצמיזציה
- סינתזה מקבילה של פפטידים שונים
- ניתנת להתאמה לכל נפח
cuphorn אולטרסוני לסוניקציה אחידה של כמה כלי תגובה לשיפור סינתזת פפטידים.
תרשים המדגים את סינתזת הפפטידים בפאזה מוצקה בשיטת Merrifield. סוניקציה משמשת לקידום ולהגברת תגובת הסינתזה וכן לביקוע הפפטידים שסונתזו מהשרף.
תרשים: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| מחקר | הפפטידים שנחקרו | זמן תגובה (השיטה הקלאסית לעומת US-SPPS) | טוהר התוצר הגולמי (השיטה הקלאסית לעומת US-SPPS) | רצמיזציה ותגובות לוואי | מסקנות עיקריות |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkephalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorphin | 600–1920 min → 48–284 min | 24.2–71.3% → 60.6–89.9% | לא נצפו עבור Cys/His, אפילו ב-70°C | סינתזה מהירה פי ~7–12; שיפורים ניכרים בטוהר, במיוחד ברצפים הנוטים לאגרגציה כמו TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (בן 12 שיירים), Pep2 (בן 9 שיירים), Pep3 (בן 25 שיירים) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (באולטרסאונד בלבד) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | לא נבדקו; צוינה ירידה קלה בטוהר של Pep2 | קיצור זמן פי 14 עבור Pep1; ניצולות התוצר הגולמי עלו באופן משמעותי. |
| Merlino et al. (2019) | פנטפפטידים המשמשים כמודל, פפטידים באורך של עד 44 שיירים, "רצפים קשים" (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (מודל) | 84% → 93% (מודל); גבוה משמעותית מזה שהושג בחימום תרמי (~45°C) | ללא עלייה משמעותית באננטיומרים של Cys/His | יעילה מאוד לרצפים קשים או לרצפים הנוטים לאגרגציה; מאפשרת להפחית את עודף המגיבים תוך שמירה על טוהר גבוה. |
שיפור סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה בעזרת אולטרסאונד
סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה (SPPS) היא תגובה כימית המאפשרת להרכיב שרשרת פפטידית באמצעות תגובות עוקבות של נגזרות חומצות אמינו על מצע נקבובי בלתי מסיס. עם זאת, סינתזת פפטידים מסורתית בפאזה מוצקה היא תהליך איטי ולא יעיל יחסית. לכן, הגברת סינתזת פפטידים באמצעות אולטרסאונד היא כלי מוערך מאוד לסינתזה יעילה ומהירה יותר של פפטידים.
Silva ועמיתיו (2021) השוו סינתזת פפטידים "קלאסית" בפאזה מוצקה (SPPS) המבוססת על פלואורנילמתוקסיקרבוניל (Fmoc) ל-SPPS בסיוע אולטרסאונד (US), על בסיס הכנת שלושה פפטידים: הפפטיד Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), הספציפי לקולטן 3 לגורם גדילה של פיברובלסטים (FGFR3), והפפטידים החדשים Pep2 (RQMATADEA-NH2) ו-Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS בסיוע אולטרסאונד קיצרה את הזמן הדרוש להרכבת הפפטידים פי 14 (Pep1) ופי 4 (Pep2) בהשוואה לשיטה ה"קלאסית". מעניין לציין כי SPPS בסיוע אולטרסאונד הניבה Pep1 בדרגת טוהר גבוהה יותר (82%) מזו שהתקבלה ב-SPPS ה"קלאסית" (73%). הקיצור המשמעותי בזמן, בשילוב דרגת הטוהר הגבוהה שהושגה בפפטיד הגולמי, הניעו את צוות המחקר ליישם SPPS בסיוע אולטרסאונד על הפפטיד הגדול Pep3, המכיל מספר רב של חומצות אמינו הידרופוביות ורצפים הומואוליגומריים. ראוי לציון שסינתזת פפטיד זה, המורכב מ-25 יחידות, הושגה בתוך פחות מ-6 שעות (347 min), בדרגת טוהר בינונית (כ-49%).
סינתזת פפטידים מהירה יותר באמצעות סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה תוך שימוש בערבול אולטרסוני.
(מחקר וניתוח: Wołczański ועמיתיו, 2019)
Merlino ועמיתיו (2019) ערכו גם מחקר מקיף על השפעות האולטרסאונד על סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה המבוססת על Fmoc, שאפשרה לסנתז פפטידים שונים בעלי פעילות ביולוגית (באורך של עד 44 יחידות), תוך חיסכון ניכר בחומרים ובזמן התגובה. הם הראו שסוניקציה לא החמירה את תגובות הלוואי העיקריות ושיפרה את הסינתזה של פפטידים בעלי "רצפים קשים", ובכך הציבו את סינתזת הפפטידים בפאזה מוצקה המוגברת באמצעות אולטרסאונד (US-SPPS) בין האסטרטגיות העכשוויות היעילות ביותר לסינתזת פפטידים.
הזמינות של מערכות עתירות ביצועים לסינתזה אולטרסונית (סונית) של פפטידים מאפשרת לשפר במידה ניכרת את קצבי הסינתזה ולהעלות את דרגת הטוהר של התוצרים הגולמיים. (ראו Wołczański ועמיתיו, 2019)
חקר הרצמיזציה. השוואה בין ספקטרומי 1H NMR משמעותיים של פפטידי מודל שסונתזו ידנית בגישה הקלאסית בטמפרטורת החדר לבין אלו שסונתזו בשיטה האולטרסונית בטמפרטורה מוגברת. ההיסטים הכימיים של פרוטוני α של His ושל Cys ושל קבוצת המתילן של Acm (התרשימים משמאל), ושל פרוטוני קבוצת המתיל בעמדה ɣ של Val (התרשימים מימין), מראים שסוניקציה ב-70°C אינה גורמת לרצמיזציה.
(מחקר וניתוח: Wołczański ועמיתיו, 2019)
ביקוע אולטרסוני של פפטידים
לאחר סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה (SPPS), יש לבקע את הפפטידים שסונתזו מהשרפים הפולימריים. שלב זה מוכר גם כהסרת קבוצות הגנה. בהשוואה בין ניעור רגיל לבין סוניקציה לצורך ביקוע פפטידים מהשרף, שיטת הניעור דורשת כ-1 שעה, ואילו ביקוע אולטרסוני ניתן להשלים בתוך 15 עד 20 min. ניתן ליישם ביקוע אולטרסוני של פפטידים לביקוע חומצות אמינו מוגנות ופפטידים הקשורים לשרפי פוליסטירן באמצעות קשרי אסטר בנזיליים.
ביקוע אולטרסוני של פפטידים משרף פוליסטירן מניב תפוקות גבוהות של פפטידים בדרגת טוהר גבוהה, ללא רצמיזציה, בתהליך מהיר.
(מחקר ואיור: ©Anuradha ו-Ravindranath, 1995)
כור המעורבל באמצעות אולטרסאונד לסינתזת פפטידים משופרת ומואצת. התמונה מציגה את מכשיר הסוניקציה UP200St בכור זכוכית מעורבל.
מכשירי סוניקציה עתירי ביצועים לסינתזת פפטידים
Hielscher Ultrasonics מציעה מגוון פתרונות אולטרסוניים לסוניקציה ישירה ועקיפה. מעבדים אולטרסוניים רבי־עוצמה המאפשרים שליטה מדויקת מספקים לכלי התגובה בדיוק את כמות האנרגיה האולטרסונית הנדרשת. בין שאתם משתמשים במזרקים, במבחנות, בצלחות מרובות באריות או בריאקטורים מזכוכית ככלי לסינתזה, Hielscher Ultrasonics מציעה את מכשיר הסוניקציה המתאים ביותר ליישום הפפטידים שלכם.
- פפטידים מותאמים אישית
- ייצור פפטידים בקנה מידה גדול
- ספריות פפטידים
תהליכי סינתזה רבים של פפטידים מבוצעים במזרקים (למשל, ריאקטורים בצורת מזרק עם מסנן נקבובי). המנער האולטרסוני למזרקים של Hielscher מבצע סוניקציה של תמיסת הפפטידים באמצעות העברת גלי האולטרסאונד דרך דופן המזרק אל הנוזל. המנער האולטרסוני למזרקים הוא אחד הפתרונות האולטרסוניים הפופולריים ביותר לסינתזת פפטידים בסיוע אולטרסאונד.
ה־cuphorn האולטרסוני הוא כלי מתאים לסוניקציה של עד 5 כלי תגובה, ואילו VialTweeter יכול להכיל עד עשר מבחנות תגובה ובנוסף חמישה כלים גדולים יותר באמצעות אביזר הידוק חיצוני.
לסוגי ריאקטורים אחרים, כגון ריאקטור הפאזה המוצקה של Merrifield או Kamysz, ולכלים וריאקטורים אחרים מפוליפרופילן או מזכוכית בורוסיליקט, Hielscher מציעה מכשירי סוניקציה לסוניקציה עקיפה וישירה, עם תושבת הידוק חיצונית או אוגן בהתאמה אישית.
כמובן, ניתן לצייד בקלות ריאקטורים גדולים יותר מזכוכית עם ערבול, למשל לסינתזה בפאזת התמיסה, בגשושים אולטרסוניים (המכונים גם סונוטרודות או קרניים אולטרסוניות) בכל גודל.
- מגוון סוגים של מכשירי סוניקציה
- סוניקציה ישירה ועקיפה
- בקרה מדויקת של העוצמה
- בקרה מדויקת של הטמפרטורה
- אולטרסאונד רציף או בפולסים
- תכונות חכמות, מכשירים הניתנים לתכנות
- זמינים לכל נפח
- יכולת הגדלת קנה המידה באופן ליניארי
לסינתזת פפטידים בפאזה מוצקה בצלחות מרובות באריות או בצלחות מיקרוטיטר, UIP400MTP הוא המכשיר האידאלי. קוויטציה אולטרסונית מועברת בעקיפין ובאופן אחיד אל באריות הדגימה הרבות, להשגת מעבר מסה ותגובת סינתזה משופרים. צפו בסרטון שלהלן כדי לראות את מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP בפעולה!
צרו איתנו קשר! / שאלו אותנו!
Hielscher Ultrasonics מייצרת הומוגנייזרים אולטרסוניים עתירי ביצועים ליישומי ערבוב, דיספרסיה, תחלוב ומיצוי בקנה מידה מעבדתי, פיילוט ותעשייתי.
עובדות שכדאי לדעת על סינתזת פפטידים באולטרסאונד
מהם פפטידים?
פפטידים הם תרכובות שבהן חומצות אמינו רבות מקושרות באמצעות קשרים אמידיים, המכונים קשרים פפטידיים. כאשר הן קשורות במבנים מורכבים – המורכבים בדרך כלל מ־50 חומצות אמינו או יותר – מבנים פפטידיים גדולים אלה מכונים חלבונים. פפטידים הם אבן בניין חיונית של החיים וממלאים תפקידים רבים בגוף.
כיצד מתבצעת סינתזת פפטידים?
בכימיה אורגנית, בביולוגיה מולקולרית ובמדעי החיים, סינתזת פפטידים היא התהליך של ייצור פפטידים. פפטידים מסונתזים באופן כימי באמצעות תגובת דחיסה בין הקבוצה הקרבוקסילית של חומצת אמינו אחת לקבוצה האמינית של חומצת אמינו אחרת. בדרך כלל משתמשים באסטרטגיות המבוססות על קבוצות הגנה כדי למנוע תגובות לוואי בלתי רצויות עם שרשראות הצד השונות של חומצות האמינו.
סינתזה כימית של פפטידים (in-vitro) מתחילה לרוב בצימוד הקבוצה הקרבוקסילית של חומצת האמינו הנכנסת (הקצה ה־C־טרמינלי) לקצה ה־N־טרמינלי של שרשרת הפפטיד המתארכת. בניגוד לסינתזה זו בכיוון C-to-N, הביוסינתזה הטבעית של חלבונים מפפטידים ארוכים באורגניזמים חיים מתרחשת בכיוון ההפוך. משמעות הדבר היא שבביוסינתזה, הקצה ה־N־טרמינלי של חומצת האמינו הנכנסת מקושר לקצה ה־C־טרמינלי של שרשרת החלבון (N-to-C).
רוב פרוטוקולי המחקר והפיתוח לסינתזת פפטידים מבוססים על שיטות בפאזה מוצקה, ואילו שיטות סינתזה בפאזת התמיסה משמשות בייצור תעשייתי של פפטידים בקנה מידה גדול.
מהי חזית הטכנולוגיה הנוכחית בסינתזת פפטידים?
SUS-SPPS (SPPS בת־קיימא בסיוע אולטרסאונד) הוכחה כמצמצמת את התהליך לשני שלבים בלבד בכל מחזור (צימוד/חסימה/הסרת קבוצות הגנה משולבים + שטיפה יחידה), תוך הפחתה משמעותית בצריכת הממסים ובזמן. (ראו Mottola et al., 2025)
TAPS בסיוע אולטרסאונד הוא שילוב מתפתח שהצלחתו הודגמה בסינתזות מלאות (למשל, lipobactin), ונבחן על ידי ארגונים לפיתוח וייצור בחוזה (CDMOs) לצורך ייצור חומרים פעילים לתרופות (API).
גלו את היתרונות של סינתזת פפטידים בשיטת TAGGING בסיוע אולטרסאונד!
עיבוד רציף נבחן כשיפור נוסף – תוארו פלטפורמות לסינתזה רציפה בכלי אחד בסיוע תג שעבר סילילציה.
התחום מתקדם לעבר עקרונות הכימיה הירוקה, כאשר הן אולטרסאונד והן TAPS תורמים להפחתת השימוש בממסים, להפחתת כמויות הריאגנטים ולשיפור הקיימות.
ספרות / מקורות
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics מייצרת הומוגנייזרים אולטרסוניים עתירי ביצועים החל מקנה מידה מעבדתי ועד לקנה מידה תעשייתי.