ייצור כיטין וכיטוזן מפטריות

טיפול אולטרסוני הוא שיטה יעילה ביותר לשחרור כיטין וכיטוזן ממקורות פטרייתיים כגון פטריות. כדי לקבל ביופולימר באיכות גבוהה, הכיטין והכיטוזן חייבים לעבור דה־פולימריזציה ודה־אצטילציה בשלבי העיבוד הבאים. דה־פולימריזציה ודה־אצטילציה בסיוע אולטרסאונד הן טכניקה יעילה ביותר, פשוטה ומהירה, המניבה כיטוזנים באיכות גבוהה, בעלי משקל מולקולרי גבוה וזמינות ביולוגית מעולה.

הפקת כיטין וכיטוזן מפטריות באמצעות טיפול אולטרסוני

פטריות מאכל ומרפא כגון Lentinus edodes (שיטאקי), Ganoderma lucidum (לינגז'י או ריישי), Inonotus obliquus (צ'אגה), Agaricus bisporus (פטריות שמפיניון), Hericium erinaceus (רעמת האריה), Cordyceps sinensis (פטריית הזחל), Grifola frondosa (תרנגולת היער), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, זנב תרנגול הודו) ומינים רבים אחרים של פטריות משמשים בהיקף נרחב למאכל ולמיצוי תרכובות פעילות ביולוגית. ניתן להשתמש בפטריות אלה, וכן בשאריות עיבוד (פסולת פטריות), לייצור כיטוזן. טיפול אולטרסוני לא רק מקדם את שחרור הכיטין ממבנה דופן התא הפטרייתי, אלא גם מניע את המרת הכיטין לכיטוזן בעל ערך באמצעות דה־פולימריזציה ודה־אצטילציה בסיוע אולטרסאונד.

סוניקציה מקדמת דה־פולימריזציה ודה־אצטילציה של כיטין לכיטוזן

טיפול אולטרסוני עוצמתי באמצעות מערכת אולטרסונית מסוג גשוש הוא טכניקה המשמשת לקידום דה־פולימריזציה ודה־אצטילציה של כיטין, המובילות להיווצרות כיטוזן. כיטין הוא רב־סוכר טבעי המצוי בשלד החיצוני של סרטנאים וחרקים ובדופנות התאים של פטריות מסוימות. כיטוזן מופק מכיטין באמצעות הסרת קבוצות האצטיל ממולקולת הכיטין.

תהליך אולטרסוני להמרת כיטין ממקור פטרייתי לכיטוזן

כאשר משתמשים בטיפול אולטרסוני עוצמתי לייצור כיטוזן מכיטין, תרחיף כיטין עובר סוניקציה בגלי אולטרסאונד בעוצמה גבוהה ובתדר נמוך, בדרך כלל בטווח של 20 kHz עד 30 kHz. התהליך יוצר קוויטציה אקוסטית עוצמתית, המתבטאת בהיווצרות, בגדילה ובקריסה של בועות ריק מיקרוסקופיות בנוזל. הקוויטציה יוצרת באופן מקומי כוחות גזירה גבוהים ביותר, טמפרטורות גבוהות (עד כמה אלפי מעלות צלזיוס) ולחצים גבוהים (עד כמה מאות אטמוספרות) בנוזל המקיף את בועות הקוויטציה. תנאים קיצוניים אלה תורמים לפירוק פולימר הכיטין ולדה־אצטילציה שלאחר מכן.
 

תמונות SEM של כיטינים וכיטוזנים משני מיני פטריות: a) כיטין מ־L. vellereus; b) כיטין מ־P. ribis; c) כיטוזן מ־L.vellereus; d) כיטוזן מ־P. ribis.
תמונה ומחקר: © Erdoğan et al., 2017

דה־פולימריזציה אולטרסונית של כיטין

הדה־פולימריזציה של כיטין מתרחשת באמצעות ההשפעות המשולבות של כוחות מכניים, כגון מיקרו־זרימה וסילוני נוזל, וכן באמצעות תגובות כימיות שמאותחלות באולטרסאונד ומושרות על ידי רדיקלים חופשיים וצורונים תגובתיים אחרים הנוצרים במהלך הקוויטציה. גלי הלחץ הגבוה הנוצרים במהלך הקוויטציה גורמים לשרשראות הכיטין להיות נתונות למאמץ גזירה, המוביל לביקוע הפולימר למקטעים קטנים יותר.

דה־אצטילציה אולטרסונית של כיטין

בנוסף לדה־פולימריזציה, טיפול אולטרסוני עוצמתי מקדם גם את הדה־אצטילציה של כיטין. דה־אצטילציה כרוכה בהסרת קבוצות אצטיל ממולקולת הכיטין, המובילה להיווצרות כיטוזן. אנרגיה אולטרסונית עוצמתית, ובפרט הטמפרטורות והלחצים הגבוהים הנוצרים במהלך קוויטציה, מאיצים את תגובת הדה־אצטילציה. התנאים התגובתיים שיוצרת הקוויטציה מסייעים בפירוק הקשרים של קבוצות האצטיל בכיטין, וכתוצאה מכך משתחררת חומצה אצטית והכיטין מומר לכיטוזן.
בסך הכול, טיפול אולטרסוני עוצמתי משפר הן את תהליך הדה־פולימריזציה והן את תהליך הדה־אצטילציה באמצעות אספקת האנרגיה המכנית והכימית הדרושה לפירוק פולימר הכיטין ולהקלה על המרתו לכיטוזן. טכניקה זו מציעה שיטה מהירה ויעילה לייצור כיטוזן מכיטין, עם יישומים רבים בענפי תעשייה שונים, ובהם תרופות, חקלאות והנדסה ביו־רפואית.

ייצור תעשייתי של כיטוזן מפטריות באמצעות אולטרסאונד רב־עוצמה

ייצור מסחרי של כיטין וכיטוזן מבוסס בעיקר על פסולת מתעשיות הים (כלומר דיג, איסוף רכיכות וסרטנים וכו'). מקורות שונים של חומרי גלם מניבים כיטין וכיטוזן באיכויות שונות, כך שחלים שינויים בתפוקה ובאיכות עקב שינויים עונתיים בדיג. יתרה מכך, על פי דיווחים, כיטוזן המופק ממקורות פטרייתיים מציע תכונות עדיפות, כגון אורך פולימר אחיד ומסיסות גבוהה יותר בהשוואה לכיטוזן ממקורות ימיים. (ראו Ghormade et al., 2017) כדי לספק כיטוזן אחיד, מיצוי כיטין ממיני פטריות הפך לחלופת ייצור יציבה. ניתן לייצר כיטין וכיטוזן מפטריות בקלות ובאמינות באמצעות טכנולוגיית מיצוי ודה־אצטילציה אולטרסונית. סוניקציה עוצמתית מפרקת מבנים תאיים כדי לשחרר כיטין ומקדמת מעבר מסה בממסים מימיים, להשגת תפוקות כיטין ויעילות מיצוי מעולות. דה־אצטילציה אולטרסונית בהמשך ממירה את הכיטין לכיטוזן בעל הערך. ניתן להגדיל באופן ליניארי את קנה המידה הן של מיצוי הכיטין האולטרסוני והן של הדה־אצטילציה לכיטוזן, לכל היקף ייצור מסחרי.

סוניקציה מגבירה את ייצור הכיטוזן ממקור פטרייתי והופכת את הייצור ליעיל וחסכוני יותר.
(תמונה ומחקר: © Zhu et al., 2019)

תוצאות מחקרים על דה־אצטילציה אולטרסונית של כיטין וכיטוזן

Zhu et al. (2018) מסיקים במחקרם כי דה־אצטילציה אולטרסונית הוכחה כפריצת דרך מכרעת, הממירה β-chitin לכיטוזן בדרגת דה־אצטילציה של 83–94% בטמפרטורות תגובה מופחתות. התמונה משמאל מציגה תמונת מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM) של כיטוזן שעבר דה־אצטילציה אולטרסונית (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (תמונה ומחקר: © Zhu et al., 2018)
בפרוטוקול שלהם הוכנה תמיסת NaOH ‏(20 w/v %) באמצעות המסת פתיתי NaOH במים נטולי יונים. לאחר מכן נוספה התמיסה הבסיסית למשקע GLSP ‏(0.5 g) ביחס מוצק לנוזל של 1:20 (g: mL) בתוך מבחנת צנטריפוגה. כיטוזן הוסף ל־NaCl ‏(40 mL, 0.2 M) ולחומצה אצטית (0.1 M) ביחס נפחי תמיסות של 1:1. לאחר מכן נחשף התרחיף לאולטרסאונד בטמפרטורה מתונה של 25°C למשך 60 min באמצעות מכשיר אולטרסוני מסוג גשוש (250W, 20kHz). (cf Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) מצאו שקצב הפירוק בתמיסות כיטוזן מושפע רק לעיתים רחוקות מריכוזי החומצה המשמשת להמסת הפולימר, ותלוי במידה רבה בטמפרטורה, בעוצמת גלי האולטרסאונד ובחוזק היוני של התווך המשמש להמסת הפולימר. (cf. Pandit et al., 2021)
 
במחקר אחר השתמשו Zhu et al. (2019) באבקות נבגים של Ganoderma lucidum כחומר גלם פטרייתי, וחקרו דה־אצטילציה בסיוע אולטרסאונד ואת השפעותיהם של פרמטרי עיבוד כגון זמן הסוניקציה, היחס בין מוצק לנוזל, ריכוז NaOH והספק ההקרנה על דרגת הדה־אצטילציה (DD) של כיטוזן. ערך ה־DD הגבוה ביותר התקבל בפרמטרים האולטרסוניים הבאים: סוניקציה למשך 20 min בהספק של 80W, ‏10% (g:ml) NaOH, ‏1:25 (g:ml). מורפולוגיית פני השטח, הקבוצות הכימיות, היציבות התרמית והגבישיות של הכיטוזן שהתקבל באמצעות אולטרסאונד נבדקו באמצעות SEM, FTIR, TG ו־XRD. צוות המחקר מדווח על שיפור משמעותי בדרגת הדה־אצטילציה (DD), בצמיגות הדינמית ([η]) ובמשקל המולקולרי (Mv¯) של הכיטוזן שיוצר באמצעות אולטרסאונד. התוצאות הדגישו שטכניקת הדה־אצטילציה האולטרסונית של פטריות היא שיטה יעילה ביותר לייצור כיטוזן המתאים ליישומים ביו־רפואיים. (cf. Zhu et al., 2019)

איכות כיטוזן מעולה באמצעות דה־פולימריזציה ודה־אצטילציה אולטרסוניות

ניתן לשלוט במדויק בתהליכי מיצוי ודה־פולימריזציה של כיטין / כיטוזן המונעים באמצעות אולטרסאונד, וניתן להתאים את פרמטרי התהליך האולטרסוני לחומרי הגלם ולאיכות היעד של המוצר הסופי (למשל, משקל מולקולרי ודרגת דה־אצטילציה). כך ניתן להתאים את תהליך האולטרסאונד לגורמים חיצוניים ולקבוע פרמטרים מיטביים להשגת תוצאות ויעילות מעולות.
כיטוזן שעבר דה־אצטילציה אולטרסונית מפגין זמינות ביולוגית ותאימות ביולוגית מצוינות. בהשוואת התכונות הביו־רפואיות של ביופולימרים של כיטוזן שהוכנו באמצעות אולטרסאונד לאלו של כיטוזן שהופק בתהליך תרמי, הכיטוזן שיוצר באמצעות אולטרסאונד מפגין חיוניות משופרת משמעותית של פיברובלסטים (תאי L929) ופעילות אנטיבקטריאלית מוגברת הן נגד Escherichia coli (E. coli) והן נגד Staphylococcus aureus (S. aureus).
(cf. Zhu et al., 2018)
 

תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM) בהגדלה של 100× של א) גלדיוס, ב) גלדיוס שטופל באולטרסאונד, ג) β-כיטין, ד) β-כיטין שטופל באולטרסאונד, ו־ה) כיטוזן (מקור: Preto et al. 2017)

ציוד אולטרסוני בעל ביצועים גבוהים לעיבוד כיטין וכיטוזן

פרגמנטציה של כיטין ודה-אצטילציה של כיטין לכיטוזן דורשות ציוד אולטרסוני רב-עוצמה ואמין, המסוגל לספק אמפליטודות גבוהות, מאפשר שליטה מדויקת בפרמטרים של התהליך וניתן להפעלה 24/7 תחת עומס כבד ובסביבות תובעניות. מגוון המוצרים של Hielscher Ultrasonics עומד בדרישות אלה באופן אמין. לצד ביצועים אולטרסוניים יוצאי דופן, המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מתאפיינים ביעילות אנרגטית גבוהה, המהווה יתרון כלכלי משמעותי – במיוחד בייצור מסחרי בקנה מידה גדול.
המכשירים האולטרסוניים של Hielscher הם מערכות בעלות ביצועים גבוהים, שניתן לצייד באביזרים כגון סונוטרודות, מגברי אמפליטודה, כורים או תאי זרימה כדי להתאים באופן מיטבי לצורכי התהליך שלכם.
 עם צג צבעוני דיגיטלי, אפשרות להגדרה מראש של מחזורי סוניקציה, רישום נתונים אוטומטי בכרטיס SD מובנה, שליטה מרחוק דרך דפדפן ותכונות רבות נוספות, המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מבטיחים את רמת השליטה בתהליך ונוחות השימוש הגבוהות ביותר. בשילוב עמידות ויכולת לשאת עומסים כבדים, המערכות האולטרסוניות של Hielscher הן סוס העבודה האמין שלכם בייצור. 
פרגמנטציה ודה-אצטילציה של כיטין דורשות אולטרסאונד רב-עוצמה כדי להשיג את ההמרה הרצויה ומוצר כיטוזן סופי באיכות גבוהה. אמפליטודות גבוהות ולחצים מוגברים חיוניים במיוחד לפרגמנטציה של פתיתי הכיטין ולשלבי הדה-פולימריזציה / דה-אצטילציה. המעבדים האולטרסוניים התעשייתיים של Hielscher Ultrasonics מספקים בקלות אמפליטודות גבוהות מאוד. ניתן לפעול ברציפות באמפליטודות של עד 200µm בהפעלה 24/7. לאמפליטודות גבוהות עוד יותר, זמינות סונוטרודות אולטרסוניות מותאמות אישית. יכולת ההספק של המערכות האולטרסוניות של Hielscher מאפשרת דה-פולימריזציה ודה-אצטילציה יעילות ומהירות בתהליך בטוח ונוח למשתמש.
 

טיפול סינרגטי בכיטין המשופר באמצעות אולטרסאונד

כדי להתגבר על החסרונות (כלומר, יעילות נמוכה, עלות אנרגיה גבוהה, זמן עיבוד ארוך, ממסים רעילים) של דה-אצטילציה כימית ואנזימטית מסורתית של כיטין, שולב אולטרסאונד בעוצמה גבוהה בעיבוד כיטין וכיטוזן. סוניקציה בעוצמה גבוהה וההשפעות הנובעות ממנה של קוויטציה אקוסטית מובילות לביקוע מהיר של שרשראות פולימר ומפחיתות את הפולידיספרסיות, ובכך מקדמות את הסינתזה של כיטוזן. נוסף על כך, כוחות גזירה אולטרסוניים מגבירים את מעבר המסה בתמיסה, ובכך משפרים תגובות כימיות, הידרוליטיות או אנזימטיות. ניתן לשלב טיפול אולטרסוני בכיטין עם טכניקות קיימות לעיבוד כיטין, כגון שיטות כימיות, הידרוליזה או תהליכים אנזימטיים.

דה-אצטילציה ודה-פולימריזציה כימיות בסיוע אולטרסאונד

מכיוון שכיטין הוא ביופולימר שאינו פעיל כימית ואינו מסיס, עליו לעבור את שלבי התהליך של סילוק מינרלים, סילוק חלבונים ודה-פולימריזציה / דה-אצטילציה כדי לקבל כיטוזן מסיס ונגיש ביולוגית. שלבי תהליך אלה כוללים טיפולים בחומצות חזקות כגון HCl ובבסיסים חזקים כגון NaOH ו-KOH. מכיוון ששלבי התהליך המקובלים הללו אינם יעילים, איטיים ודורשים כמויות גדולות של אנרגיה, הגברת התהליך באמצעות סוניקציה משפרת באופן משמעותי את ייצור הכיטוזן. השימוש באולטרסאונד רב-עוצמה מגדיל את תפוקת הכיטוזן ומשפר את איכותו, מקצר את התהליך מימים לשעות ספורות, מאפשר שימוש בממסים מתונים יותר ומשפר את היעילות האנרגטית של התהליך כולו.

סילוק חלבונים מכיטין המשופר באמצעות אולטרסאונד

Vallejo-Dominguez et al. (2021) מצאו במחקרם על סילוק חלבונים מכיטין כי "השימוש באולטרסאונד לייצור ביופולימרים הפחית את תכולת החלבון וכן את גודל חלקיקי הכיטין. בסיוע אולטרסאונד הופק כיטוזן בעל דרגת דה-אצטילציה גבוהה ומשקל מולקולרי בינוני."

הידרוליזה אולטרסונית לדה-פולימריזציה של כיטין

בהידרוליזה כימית משתמשים בחומצות או בבסיסים לדה-אצטילציה של כיטין, אולם דה-אצטילציה באמצעות בסיסים (למשל, נתרן הידרוקסידי NaOH) נפוצה יותר. הידרוליזה חומצית היא שיטה חלופית לדה-אצטילציה הכימית המסורתית, שבה משתמשים בתמיסות של חומצות אורגניות לדה-פולימריזציה של כיטין וכיטוזן. שיטת ההידרוליזה החומצית משמשת בעיקר כאשר המשקל המולקולרי של הכיטין והכיטוזן חייב להיות אחיד. תהליך הידרוליזה קונבנציונלי זה ידוע כאיטי וכעתיר אנרגיה ועלויות. הצורך בחומצות חזקות, בטמפרטורות גבוהות ובלחצים גבוהים הוא בין הגורמים ההופכים את תהליך ההידרוליזה של כיטוזן להליך יקר מאוד וממושך. החומצות שבהן משתמשים מחייבות תהליכי המשך כגון נטרול וסילוק מלחים.
שילוב אולטרסאונד בהספק גבוה בתהליך ההידרוליזה מאפשר להפחית במידה ניכרת את דרישות הטמפרטורה והלחץ לביקוע ההידרוליטי של כיטין וכיטוזן. נוסף על כך, סוניקציה מאפשרת שימוש בריכוזי חומצה נמוכים יותר או בחומצות מתונות יותר. כך התהליך נעשה בר-קיימא יותר, יעיל יותר, כדאי יותר מבחינה כלכלית וידידותי יותר לסביבה.

דה-אצטילציה כימית בסיוע אולטרסאונד

פירוק כימי ודה-אצטילציה של כיטין וכיטוזן מתבצעים בעיקר באמצעות טיפול בכיטין או בכיטוזן בחומצות מינרליות (למשל, חומצה הידרוכלורית HCl), בנתרן ניטריט (NaNO₂), או במימן על-חמצני (H₂O₂). אולטרסאונד משפר את קצב הדה-אצטילציה ובכך מקצר את זמן התגובה הנדרש להשגת דרגת הדה-אצטילציה הרצויה. פירוש הדבר הוא שסוניקציה מקצרת את זמן העיבוד הנדרש מ-12–24 שעות לשעות ספורות. נוסף על כך, סוניקציה מאפשרת שימוש בריכוזים נמוכים משמעותית של חומרים כימיים, למשל 40% (w/w) נתרן הידרוקסידי בשימוש בסוניקציה, בעוד שללא שימוש באולטרסאונד נדרשים 65% (w/w).

דה-אצטילציה אולטרסונית-אנזימטית

אף שדה-אצטילציה אנזימטית היא שיטת עיבוד מתונה וידידותית לסביבה, יעילותה ועלויותיה הופכות אותה לבלתי כדאית מבחינה כלכלית. בשל תהליכי ההמשך המורכבים, עתירי העבודה והיקרים של בידוד האנזימים מתוצר הקצה וטיהורם, דה-אצטילציה אנזימטית של כיטין אינה מיושמת בייצור מסחרי, אלא משמשת רק במעבדות מחקר מדעי.
טיפול מקדים באולטרסאונד לפני דה-אצטילציה אנזימטית מפרק את מולקולות הכיטין למקטעים, ובכך מגדיל את שטח הפנים ומעמיד לרשות האנזימים שטח פנים זמין רב יותר. סוניקציה בעלת ביצועים גבוהים מסייעת לשפר את הדה-אצטילציה האנזימטית והופכת את התהליך לכדאי יותר מבחינה כלכלית.