UIP400MTP સોનીકેટરનો ઉપયોગ કરીને પ્રિઓન્સની ઉચ્ચ-થ્રુપુટ તપાસ માટે PMCA

UIP400MTP મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર પ્રોટીન મિસફોલ્ડિંગ સાયક્લિક એમ્પ્લીફિકેશન (PMCA) માં ઉચ્ચ-થ્રુપુટ નમૂનાની તૈયારી માટે શક્તિશાળી ઉકેલ પ્રદાન કરે છે. બહુવિધ કુવાઓમાં સમાન ઉર્જા વિતરણ કરીને અને ચોક્કસ સોનિકેશન પરિમાણો જાળવી રાખીને, આ સિસ્ટમ અસાધારણ પુનઃઉત્પાદનક્ષમતા સાથે અસંખ્ય નમૂનાઓની એક સાથે પ્રક્રિયાને સક્ષમ કરે છે. આ ક્ષમતાઓ લાળ જેવા પડકારજનક જૈવિક નમૂનાઓમાં ઓછી સાંદ્રતામાં પ્રાયોન્સને શોધવા માટે PMCA ને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવા માટે મહત્વપૂર્ણ છે, જ્યાં એસે અવરોધકો પરિણામોને અસ્પષ્ટ કરી શકે છે.

પ્રિઓન રોગો, જેમ કે સર્વિડમાં ક્રોનિક વેસ્ટિંગ ડિસીઝ (CWD) અને મનુષ્યોમાં ક્રુટ્ઝફેલ્ડ-જેકોબ ડિસીઝ (CJD), મિસફોલ્ડેડ પ્રિઓન પ્રોટીન (PrP) ને કારણે ન્યુરોડિજનરેટિવ ડિસઓર્ડર છે.^Sc). આ રોગોમાં ઘણીવાર લાળ, લોહી અને પેશાબ જેવા શારીરિક પ્રવાહીમાં ચેપી પ્રિઓન્સના નીચા સ્તરનો સમાવેશ થાય છે, જે નિદાન અને સંશોધનને જટિલ બનાવે છે. પર્યાવરણીય મેટ્રિસિસમાં પ્રિઓન્સ શેડ દ્વારા CWDનું આડું પ્રસારણ ખાસ કરીને વન્યજીવન વ્યવસ્થાપન અને પર્યાવરણીય સ્વાસ્થ્ય માટે નોંધપાત્ર અસરો ધરાવે છે. તેવી જ રીતે, ક્રુટ્ઝફેલ્ડ-જેકોબ રોગ જેવા રોગોમાં, ડાયગ્નોસ્ટિક્સને આગળ વધારવા અને રોગની પ્રગતિને સમજવા માટે માનવ નમૂનાઓમાંથી મિસફોલ્ડેડ પ્રિઓન પ્રોટીનનું વિશ્વસનીય એમ્પ્લીફિકેશન નિર્ણાયક છે.

સંશોધિત PMCA પ્રોટોકોલ લાગુ કરવાથી સામાન્ય એસે ઇન્હિબિટર્સ (દા.ત., લાળમાં મ્યુકિન) ને બાયપાસ કરવાની અને પ્રિઓન્સને શોધવામાં ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા પ્રાપ્ત કરવાની મંજૂરી આપે છે જે રીઅલ-ટાઇમ ક્વેકિંગ-પ્રેરિત રૂપાંતરણ (RT-QuIC) જેવી તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને અન્યથા શોધી ન શકાય તેવી અથવા અસ્પષ્ટ હશે. આ પ્રગતિઓ વિવિધ રોગો માટે પ્રિઓન શોધને વધારે છે, PMCA ને પ્રિઓન સંશોધન અને નિદાન માટે અનિવાર્ય સાધન બનાવે છે. મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP માઇક્રોપ્લેટ્સમાં અસંખ્ય નમૂનાઓ (દા.ત. 6-, 24-, અથવા 96-વેલ પ્લેટ્સ) અથવા ટ્યુબ રેકમાં શીશીઓમાં ઉચ્ચ-થ્રુપુટ PMCA સોનિકેટ કરવાની સુવિધા આપે છે.

હાઇ-થ્રુપુટ પ્રોટીન મિસફોલ્ડિંગ સાયકલ એમ્પ્લીફિકેશન (PMCA) માટે પ્રોટોકોલ

નીચેનો પ્રોટોકોલ મજબૂત સંશોધન પરિણામો માટે બરાબર સમાન શરતો હેઠળ ઉચ્ચ નમૂના નંબરની કાર્યક્ષમ પ્રક્રિયાને મંજૂરી આપે છે.

નમૂનાની તૈયારી

પ્રારંભિક સામગ્રી:
આના દ્વારા નમૂનાઓ તૈયાર કરો:

• PMCA સબસ્ટ્રેટમાં સાર્કોસિલ નિષ્કર્ષણ ગોળીઓને ફરીથી સસ્પેન્ડ કરી રહી છે.
• પ્રિઓન સીડ્સ સાથે મગજના હોમોજેનેટ્સ અથવા લોહીના નમૂનાઓને સીધા સ્પાઇકિંગ કરો.

સબસ્ટ્રેટ:

• ટ્રાન્સજેનિક ઉંદરથી બનેલા 10% (wt/vol) મગજના હોમોજેનેટનો ઉપયોગ કરો જે PrP ને વધારે વ્યક્ત કરે છે^સી (દા.ત., Tg ઉંદર).
• મગજની પેશીઓને એકરૂપ બનાવો:
  – 1× PBS.
  – 150 એમએમ NaCl.
  – 1% ટ્રાઇટોન X-100.
• ઉપયોગ થાય ત્યાં સુધી સબસ્ટ્રેટને -80ºC પર સ્ટોર કરો.

માઇક્રોપ્લેટ અથવા ટ્યુબમાં સેમ્પલ સેટઅપ:
ટ્યુબ્સ:

• 90 μL બ્રેઈન હોમોજેનેટ સબસ્ટ્રેટ ઉમેરો અને 10 μL સેમ્પલ સાથે બીજ ઉમેરો (દા.ત., લોહી, મગજ હોમોજેનેટ અથવા સરકોસિલ પેલેટ).
• દરેક 0.2 એમએલ ટ્યુબમાં 3 ટેફલોન મણકા (1.59-mm અથવા 2.38-mm વ્યાસ) મૂકો.
• UIP400MTP સોનિકેટર સાથે સુસંગત રેકમાં ટ્યુબને માઉન્ટ કરો.

6-વેલ માઇક્રોપ્લેટ:

• કૂવા દીઠ 500 μL નમૂના સાથે 5 એમએલ મગજ હોમોજેનેટ સબસ્ટ્રેટ અને બીજ ઉમેરો.
• દરેક કૂવામાં 3 ટેફલોન માળા ઉમેરો.

PMCA પ્રક્રિયા

પ્લેસમેન્ટ:
ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર UIP400MTP સોનિકેટરમાં ટ્યુબ રેક અથવા 6-વેલ માઇક્રોપ્લેટ મૂકો.

સાયકલિંગ કાર્યક્રમ:
નીચે પ્રમાણે 144 PMCA સાયકલ કરો:

• ઇન્ક્યુબેશન: 37 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 29 મિનિટ અને 30 સેકન્ડ.
• Sonication: 60% કંપનવિસ્તાર પર 30 સેકન્ડ.
• તાપમાનનું નિરીક્ષણ કરો: નમૂનાના તાપમાનને મોનિટર કરવા અને મહત્તમ સુધી UIP400MTP પ્રોગ્રામ કરવા માટે પ્લગેબલ તાપમાન સેન્સરનો ઉપયોગ કરો. 48-50 ° સે તાપમાન.

અનુગામી રાઉન્ડ:
144 ચક્રના પ્રથમ રાઉન્ડને પૂર્ણ કર્યા પછી, એમ્પ્લીફાઇડ સામગ્રીના અલિક્વોટને સ્થાનાંતરિત કરો:

• તાજા ટ્રાન્સજેનિક માઉસ બ્રેઇન હોમોજેનેટ સબસ્ટ્રેટમાં 10 ગણો પાતળું કરો.
• અનુગામી રાઉન્ડ માટે 96 PMCA ચક્રો કરો, સમાન સોનિકેશન પરિમાણો જાળવી રાખો.
• રાઉન્ડની ઇચ્છિત સંખ્યા માટે ચાલુ રાખો (સામાન્ય રીતે 5 સુધી).

પીઆરપીની તપાસ^Sc

1. પ્રોટીનનેઝ કે પાચન:
   – પ્રોટીનનેઝ K (50 μg/mL) સાથેના નમૂનાઓને 1 કલાક માટે 37°C પર ટ્રીટ કરો.
   – SDS-સેમ્પલ બફર ઉમેરીને અને 10 મિનિટ સુધી ઉકાળીને પાચનને સમાપ્ત કરો.
2. વેસ્ટર્ન બ્લૉટ વિશ્લેષણ:
   – આનો ઉપયોગ કરીને પચેલા નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરો:
   – 6H4 અથવા PRC1 વિરોધી PrP એન્ટિબોડીઝ.
   – SDS-PAGE કરો અને તપાસ માટે PVDF મેમ્બ્રેન પર ટ્રાન્સફર કરો.

 

 

વધુ મજબૂત પરિણામો માટે વધુ નમૂનાઓની પ્રક્રિયા કરો

UIP400MTP મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર પ્રોટીન મિસફોલ્ડિંગ સાયક્લિક એમ્પ્લીફિકેશન (PMCA) ની કાર્યક્ષમતા અને માપનીયતામાં નોંધપાત્ર વધારો કરે છે, જે પ્રક્રિયાની પરંપરાગત રીતે સમય લેતી પ્રકૃતિને સંબોધિત કરે છે. 96-વેલ પ્લેટમાં 96 જેટલા નમૂનાઓની એકસાથે પ્રક્રિયા કરવાની મંજૂરી આપીને, સિસ્ટમ PMCA વર્કફ્લોને સુવ્યવસ્થિત કરે છે જ્યારે તમામ કુવાઓમાં ચોક્કસ અને સમાન સોનિકેશન સ્થિતિ જાળવી રાખે છે. આ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ ક્ષમતા મેન્યુઅલ હેન્ડલિંગને ઘટાડે છે, શ્રમ-સઘન પગલાં ઘટાડે છે, અને પ્રજનનક્ષમતા સુનિશ્ચિત કરે છે, જે તેને પ્રિઓન સંશોધન માટે અનિવાર્ય સાધન બનાવે છે. ક્રોનિક વેસ્ટિંગ ડિસીઝ કે ક્રુટ્ઝફેલ્ડ-જેકોબ ડિસીઝની તપાસ કરવી હોય, UIP400MTP વધુ કાર્યક્ષમતા સાથે મોટા પાયે અભ્યાસની સુવિધા આપે છે, જે સંશોધકોને આધુનિક ડાયગ્નોસ્ટિક અને વૈજ્ઞાનિક એપ્લિકેશન્સની માંગને પહોંચી વળવા સક્ષમ બનાવે છે.

---

---

સાહિત્ય / સંદર્ભો

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.