Sonikace pro zlepšení dezintegrace buněk řas a extrakce

Řasy, makro- i mikrořasy, obsahují mnoho cenných sloučenin, které se používají jako výživové potraviny, potravinářská aditiva nebo jako palivo či surovina pro výrobu paliv. Pro uvolnění cílových látek z buněk řas je zapotřebí účinná a efektivní technika dezintegrace buněk. Ultrazvukové extraktory jsou vysoce účinné a spolehlivé, pokud jde o extrakci bioaktivních sloučenin z rostlin, řas a hub. Ultrazvukové extraktory Hielscher, dostupné v laboratorním, stolním a průmyslovém měřítku, jsou zavedené ve výrobě extraktů získávaných z buněk v potravinářství, farmacii a výrobě biopaliv.

Řasy jako cenný zdroj pro výživu a paliva

Buňky řas jsou všestranným zdrojem bioaktivních a energeticky bohatých sloučenin, jako jsou proteiny, sacharidy, lipidy a další bioaktivní látky, stejně jako alkany. Díky tomu jsou řasy zdrojem potravin a výživových složek i paliv.
Mikrořasy jsou ceněným zdrojem lipidů, které se využívají ve výživě a jako surovina pro biopaliva (např. bionaftu). Kmeny mořského fytoplanktonu Dicrateria, jako je Dicrateria rotunda, jsou známé jako řasy produkující benzin, které dokážou syntetizovat řadu nasycených uhlovodíků (n‐alkanů) od C₁₀H₂₂ do C₃₈H₇₈, které se dělí na benzin (C10–C15), motorovou naftu (C16–C20) a topné oleje (C21–C38).
Díky své nutriční hodnotě se řasy používají jako „funkční potraviny“ nebo „nutraceutika“. Mezi důležité mikroživiny extrahované z řas patří karotenoidy astaxanthin, fukoxanthin a zeaxanthin, dále fukoidan, laminari a další glukany, které se spolu s řadou dalších bioaktivních látek používají jako doplňky stravy a léčiva. Karagenan, alginát a další hydrokoloidy se používají jako potravinářská aditiva. Lipidy z řas se používají jako veganský zdroj omega-3 a také jako palivo nebo surovina pro výrobu bionafty.

Dezintegrace buněk řas a extrakce pomocí výkonového ultrazvuku

Ultrazvukové extraktory, nebo jednoduše sonikátory, se používají k extrakci cenných sloučenin z malých vzorků v laboratoři i k výrobě ve velkém komerčním měřítku.
Buňky řas jsou chráněny komplexními matricemi buněčných stěn, které se skládají z lipidů, celulózy, proteinů, glykoproteinů a polysacharidů. Základ většiny buněčných stěn řas tvoří mikrofibrilární síť v gelovité proteinové matrici; některé mikrořasy však mají anorganickou tuhou stěnu složenou z frustul z opálového oxidu křemičitého nebo z uhličitanu vápenatého. Pro získání bioaktivních sloučenin z biomasy řas je nezbytná účinná technika dezintegrace buněk. Kromě technologických faktorů extrakce (tj. metody extrakce a vybavení) je účinnost dezintegrace buněk řas a extrakce silně ovlivněna také různými faktory závislými na řasách, jako je složení buněčné stěny, umístění požadované biomolekuly v buňkách mikrořas a růstová fáze mikrořas v době sklizně.

Jak funguje ultrazvuková dezintegrace buněk řas a extrakce?

Když jsou ultrazvukové vlny o vysoké intenzitě přenášeny pomocí ultrazvukové sondy (označované také jako ultrazvuková sonotroda nebo jednoduše sonotroda) do kapaliny nebo suspenze, zvukové vlny se šíří kapalinou a vytvářejí přitom střídavé cykly vysokého a nízkého tlaku. Během těchto cyklů vysokého a nízkého tlaku vznikají drobné vakuové bubliny neboli kavity. Kavitační bubliny vznikají, když místní tlak během cyklů nízkého tlaku klesne dostatečně hluboko pod tlak nasycených par, což je hodnota daná pevností kapaliny v tahu při určité teplotě. Tyto bubliny rostou během několika cyklů. Když tyto vakuové bubliny dosáhnou velikosti, při které již nemohou absorbovat další energii, bublina během cyklu vysokého tlaku prudce imploduje. Imploze kavitačních bublin je prudký, energeticky hustý proces, který v kapalině generuje intenzivní rázové vlny, turbulence a mikrotrysky kapaliny. Navíc vznikají lokálně velmi vysoké tlaky a velmi vysoké teploty. Tyto extrémní podmínky snadno dokážou narušit buněčné stěny a membrány a uvolnit intracelulární sloučeniny účinným, efektivním a rychlým způsobem. Intracelulární sloučeniny, jako jsou proteiny, polysacharidy, lipidy, vitaminy, minerály a antioxidanty, tak lze účinně extrahovat pomocí výkonového ultrazvuku.

Ultrazvuková kavitace pro dezintegraci buněk a extrakci

Při působení intenzivní ultrazvukové energie se stěna nebo membrána jakéhokoli typu buňky (včetně rostlinných, savčích, řasových, houbových, bakteriálních atd.) naruší a buňka je mechanickými silami energeticky husté ultrazvukové kavitace roztrhána na menší fragmenty. Když je buněčná stěna porušena, buněčné metabolity, jako jsou proteiny, lipidy, nukleové kyseliny a chlorofyl, se uvolňují z matrice buněčné stěny i z vnitřku buňky a přecházejí do okolního kultivačního média nebo rozpouštědla.
Výše popsaný mechanismus ultrazvukové / akustické kavitace výrazně narušuje celé buňky řas nebo plynové a kapalinové vakuoly uvnitř buněk. Ultrazvuková kavitace, vibrace, turbulence a mikroproudění podporují přenos hmoty mezi vnitřkem buňky a okolním rozpouštědlem, takže se biomolekuly (tj. metabolity) uvolňují účinně a rychle. Sonikace je čistě mechanické ošetření, které nevyžaduje agresivní, toxické a/nebo drahé chemikálie.
Ultrazvuk o vysoké intenzitě a nízké frekvenci vytváří extrémní energeticky husté podmínky s vysokými tlaky, teplotami a vysokými smykovými silami. Tyto fyzikální síly podporují narušení buněčných struktur, a tím uvolnění intracelulárních sloučenin do média. Proto se nízkofrekvenční ultrazvuk hojně používá k extrakci bioaktivních látek a paliv z řas. Ve srovnání s konvenčními metodami extrakce, jako je extrakce rozpouštědlem, mletí v kuličkovém mlýně nebo vysokotlaká homogenizace, vyniká ultrazvuková extrakce tím, že ze sonoporované a narušené buňky uvolňuje většinu bioaktivních sloučenin (jako jsou lipidy, proteiny, polysacharidy a mikroživiny). Při použití správných procesních podmínek poskytuje ultrazvuková extrakce vynikající výtěžky extrakce během velmi krátké doby procesu. Například vysoce výkonné ultrazvukové extraktory vykazují vynikající extrakční výkon u řas, pokud se používají s vhodným rozpouštědlem. V kyselém nebo zásaditém prostředí se buněčná stěna řas stává porézní a zvrásněnou, což vede ke zvýšeným výtěžkům při nízké teplotě (pod 60°C) a krátké době sonikace (méně než 3 hodiny). Krátká doba extrakce při mírných teplotách zabraňuje degradaci fukoidanu, takže se získá vysoce bioaktivní polysacharid.
Sonikace je rovněž metodou přeměny vysokomolekulárního fukoidanu na nízkomolekulární fukoidan, který je díky své odvětvené struktuře výrazně bioaktivnější. Díky své vysoké bioaktivitě a biologické přístupnosti je nízkomolekulární fukoidan zajímavou sloučeninou pro léčiva a systémy pro podávání léčiv.

Případové studie: Ultrazvuková extrakce sloučenin z řas

Účinnost ultrazvukové extrakce a optimalizace parametrů ultrazvukové extrakce byly široce studovány. Níže naleznete příkladné výsledky extrakce pomocí sonikace z různých druhů řas.

Extrakce proteinů ze spiruliny pomocí mano-termo-sonikace

Výzkumná skupina prof. Chemata (Univerzita v Avignonu) zkoumala účinky manotermosonikace (MTS) na extrakci proteinů (jako je fykocyanin) ze sušených sinic Arthrospira platensis (známých také jako spirulina). Mano-termo-sonikace (MTS) je aplikace ultrazvuku v kombinaci se zvýšeným tlakem a teplotou za účelem intenzifikace procesu ultrazvukové extrakce.
„Podle experimentálních výsledků MTS podpořila přenos hmoty (vysoká efektivní difuzivita, De) a umožnila získat o 229% více proteinů (28,42 ± 1,15 g/100 g DW) než konvenční proces bez ultrazvuku (8,63 ± 1,15 g/100 g DW). S 28,42 g proteinů na 100 g suché biomasy spiruliny v extraktu bylo kontinuálním procesem MTS dosaženo 50% výtěžnosti proteinů za 6 efektivních minut. Mikroskopická pozorování ukázala, že akustická kavitace působila na vlákna spiruliny různými mechanismy, jako je fragmentace, sonoporace a detexturace. Tyto různé jevy usnadňují extrakci, uvolňování a solubilizaci bioaktivních sloučenin spiruliny.“ [Vernès et al., 2019]

Snímky z optické mikroskopie celých vláken spiruliny vystavených působení MTS v průběhu času. Měřítko (snímek A) = 50 μm pro všechny snímky.
snímek a studie: ©Vernès et al. 2019

Ultrazvuková extrakce fukoidanu a glukanů z Laminaria digitata

Výzkumná skupina Dr. Tiwariho z TEAGASC zkoumala extrakci polysacharidů, tj. fukoidanu, laminarinu a celkových glukanů, z makrořasy Laminaria digitata pomocí sonikátoru UIP500hdT. Studované parametry ultrazvukem asistované extrakce (UAE) vykázaly významný vliv na hladiny fukózy, FRAP a DPPH. Při optimalizovaných podmínkách teploty (76◦C), času (10 min) a ultrazvukové amplitudy (100%) s 0,1 M HCl jako rozpouštědlem byly pro fukózu, celkové glukany, FRAP a DPPH získány v uvedeném pořadí hodnoty 1060,75 mg/100 g ds, 968,57 mg/100 g ds, 8,70 μM trolox/mg fde a 11,02%. Popsané podmínky UAE pak byly úspěšně použity u dalších ekonomicky významných hnědých makrořas (L. hyperborea a A. nodosum) k získání extraktů bohatých na polysacharidy. Tato studie dokládá použitelnost UAE ke zlepšení extrakce bioaktivních polysacharidů z různých druhů makrořas.

Ultrazvuková extrakce fytochemikálií z F. vesiculosus a P. canaliculata

Výzkumný tým Garcíi-Vaquera porovnal různé nové extrakční techniky, včetně vysoce výkonné ultrazvukové extrakce, ultrazvukovo-mikrovlnné extrakce, mikrovlnné extrakce, hydrotermálně asistované extrakce a vysokotlakem asistované extrakce, s cílem vyhodnotit účinnost extrakce z druhů hnědých mikrořas Fucus vesiculosus a Pelvetia canaliculata. Pro sonikaci použil ultrazvukový extraktor Hielscher UIP500hdT. Analýza výtěžků extrakce ukázala, že ultrazvuková extrakce dosáhla nejvyšších výtěžků většiny fytochemikálií z obou F. vesiculosus. To znamená, že nejvyšší výtěžky sloučenin extrahovaných z F. vesiculosus pomocí ultrazvukového extraktoru UIP500hdT byly: celkový obsah fenolů (445,0 ± 4,6 mg ekvivalentů kyseliny gallové/g), celkový obsah florotaninů (362,9 ± 3,7 mg ekvivalentů floroglucinolu/g), celkový obsah flavonoidů (286,3 ± 7,8 mg ekvivalentů kvercetinu/g) a celkový obsah taninů (189,1 ± 4,4 mg ekvivalentů katechinu/g).
Tým ve své výzkumné studii dospěl k závěru, že použití ultrazvukem asistované extrakce „v kombinaci s 50% ethanolovým roztokem jako extrakčním rozpouštědlem by mohlo být slibnou strategií zaměřenou na extrakci TPC, TPhC, TFC a TTC při současném snížení koextrakce nežádoucích sacharidů z F. vesiculosus i P. canaliculata, s perspektivními aplikacemi při využití těchto sloučenin jako léčiv, nutraceutik a kosmeceutik.“ [García-Vaquero et al., 2021]

Zvětšení měřítka mano-termo-sonikace na Univerzitě v Avignonu pomocí sonikátorů Hielscher: od laboratorního zařízení UIP1000hdT (A) po zařízení v pilotním měřítku UIP4000hdT (B, C a D). Na snímku D je schematicky znázorněn příčný řez ultrazvukovou průtokovou celou FC100K.
snímek a studie: ©Vernès et al. 2019

Vysoce výkonné ultrazvukové extraktory pro dezintegraci řas

Špičkové ultrazvukové zařízení Hielscher umožňuje plnou kontrolu nad procesními parametry, jako je amplituda, teplota, tlak a vstup energie.
U ultrazvukové extrakce lze pro dosažení nejlepších výsledků měnit a optimalizovat parametry, jako je velikost částic suroviny, typ rozpouštědla, poměr pevné fáze k rozpouštědlu a doba extrakce.
Vzhledem k tomu, že ultrazvuková extrakce je netermální extrakční metoda, nedochází k tepelné degradaci bioaktivních složek přítomných v surovině, jako jsou řasy.
Celkově vzato dělají výhody, jako je vysoký výtěžek, krátká doba extrakce, nízká teplota extrakce a malé množství rozpouštědla, ze sonikace vynikající extrakční metodu.

Ultrazvuková extrakce: zavedená v laboratoři i v průmyslu

Ultrazvuková extrakce se široce používá k extrakci jakéhokoli druhu bioaktivních sloučenin z rostlin, řas, bakterií a savčích buněk. Ultrazvuková extrakce se etablovala jako jednoduchá, nákladově efektivní a vysoce účinná metoda, která předčí jiné tradiční extrakční techniky vyššími výtěžky extrakce a kratší dobou zpracování.
Díky snadno dostupným laboratorním, stolním a plně průmyslovým ultrazvukovým systémům je ultrazvuková extrakce dnes dobře zavedenou a důvěryhodnou technologií. Ultrazvukové extraktory Hielscher jsou instalovány po celém světě v průmyslových zpracovatelských závodech, které vyrábějí bioaktivní sloučeniny v potravinářské a farmaceutické kvalitě.

Standardizace procesů s Hielscher Ultrasonics

Extrakty z řas, které se používají v potravinách, léčivech nebo kosmetice, musí být vyráběny v souladu se správnou výrobní praxí (GMP) a podle standardizovaných specifikací zpracování. Digitální extrakční systémy Hielscher Ultrasonics jsou vybaveny inteligentním softwarem, který usnadňuje přesné nastavení a řízení procesu sonikace. Automatický záznam dat ukládá všechny parametry ultrazvukového procesu, jako je ultrazvuková energie (celková a čistá energie), amplituda, teplota a tlak (pokud jsou namontována čidla teploty a tlaku), s datem a časovým razítkem na vestavěnou SD kartu. To vám umožňuje revidovat každou ultrazvukem zpracovanou šarži. Zároveň je zajištěna reprodukovatelnost a trvale vysoká kvalita produktu.

Níže uvedená tabulka vám poskytne představu o přibližné zpracovatelské kapacitě našich sonikátorů: