Fermentacija potpomognuta ultrazvukom za proizvodnju bioetanola

Fermentacija potpomognuta ultrazvukom može poboljšati proizvodnju bioetanola tako što potiče razgradnju složenih ugljikohidrata na jednostavnije šećere, zbog čega su oni dostupniji kvascu za pretvaranje u etanol. Istovremeno, ultrazvučna obrada (sonikacija) poboljšava i propusnost ćelijskog zida kvasca, što omogućava brže oslobađanje etanola i veću ukupnu proizvodnju. Stoga fermentacija bioetanola potpomognuta ultrazvukom daje veće stope konverzije i povećan prinos.

Fermentacija

Fermentacija može biti aerobni (= oksidativna fermentacija) ili anaerobni proces koji se koristi u biotehnološkim primjenama za pretvaranje organskog materijala pomoću bakterijskih, gljivičnih ili drugih bioloških ćelijskih kultura ili pomoću enzima. Fermentacijom se energija dobija oksidacijom organskih spojeva, npr. ugljikohidrata.
Šećer je najčešći supstrat fermentacije, a nakon fermentacije nastaju proizvodi poput mliječne kiseline, laktoze, etanola i vodika. Kod alkoholne fermentacije fermentacijom se proizvodi etanol – posebno za upotrebu kao gorivo, ali i za alkoholna pića. Kada određeni sojevi kvasca, kao što je Saccharomyces cerevisiae metaboliziraju šećer, ćelije kvasca pretvaraju polazni materijal u etanol i ugljikov dioksid.

Sljedeće hemijske jednačine sažimaju tu konverziju:

Ako je polazni materijal škrob, npr. iz kukuruza, škrob se prvo mora pretvoriti u šećer. Za bioetanol koji se koristi kao gorivo potrebna je hidroliza radi pretvaranja škroba. Hidroliza se obično ubrzava kiselinskim ili enzimskim tretmanom ili njihovom kombinacijom. Fermentacija se uobičajeno provodi na oko 35–40 °C.
Pregled različitih procesa fermentacije:

Hrana :

• proizvodnja & konzerviranje
• mliječni proizvodi (mliječnokiselinska fermentacija), npr. jogurt, mlaćenica, kefir
• mliječnokiselinski fermentirano povrće, npr. kimchi, miso, natto, tsukemono, kiseli kupus
• razvoj aromatičnih tvari, npr. sojin sos
• razgradnja tanina, npr. čaj, kakao, kafa, duhan
• alkoholna pića, npr. pivo, vino, viski

Lijekovi :

• proizvodnja medicinskih spojeva, npr. inzulina, hijaluronske kiseline

Bioplin/ etanol :

• poboljšanje proizvodnje bioplina/ bioetanola

Različiti istraživački radovi i testovi u laboratorijskoj i pilot veličini pokazali su da ultrazvuk poboljšava proces fermentacije tako što čini dostupnijom veću količinu biomase za enzimsku fermentaciju. U sljedećem dijelu bit će detaljnije objašnjeni efekti ultrazvuka u tekućini.

Efekti ultrazvučne obrade tekućina

Ultrazvukom velike snage i niske frekvencije mogu se generirati velike amplitude. Stoga se ultrazvuk velike snage i niske frekvencije može koristiti za obradu tekućina, kao što su miješanje, emulgiranje, dispergiranje i deaglomeracija ili mljevenje.
Pri ultrazvučnoj obradi tekućina visokim intenzitetima zvučni talasi koji se šire kroz tekući medij uzrokuju naizmjenične cikluse visokog pritiska (kompresija) i niskog pritiska (razrjeđenje), čija brzina zavisi od frekvencije. Tokom ciklusa niskog pritiska ultrazvučni talasi visokog intenziteta stvaraju male vakuumske mjehuriće ili šupljine u tekućini. Kada mjehurići dosegnu volumen pri kojem više ne mogu apsorbirati energiju, silovito kolabiraju tokom ciklusa visokog pritiska. Ta se pojava naziva kavitacija. Kavitacija, odnosno „stvaranje, rast i implozivni kolaps mjehurića u tekućini. Kavitacijski kolaps proizvodi intenzivno lokalno zagrijavanje (~5000 K), visoke pritiske (~1000 atm) i enormne brzine zagrijavanja i hlađenja (>109 K/sec)” i mlazeve tekućine (~400 km/h)”. (Suslick 1998)

Postoje različiti načini za stvaranje kavitacije, kao što su mlaznice visokog pritiska, rotor-stator miješalice ili ultrazvučni procesori. U svim tim sistemima ulazna energija pretvara se u trenje, turbulencije, talase i kavitaciju. Udio ulazne energije koji se pretvara u kavitaciju zavisi od nekoliko faktora koji opisuju kretanje opreme za stvaranje kavitacije u tekućini. Intenzitet ubrzanja jedan je od najvažnijih faktora koji utiču na efikasno pretvaranje energije u kavitaciju. Veće ubrzanje stvara veće razlike pritiska. To zauzvrat povećava vjerovatnoću nastanka vakuumskih mjehurića umjesto nastanka talasa koji se šire kroz tekućinu. Stoga je udio energije koji se pretvara u kavitaciju veći što je ubrzanje veće.
Kod ultrazvučnog pretvarača amplituda oscilacije opisuje intenzitet ubrzanja. Veće amplitude rezultiraju efikasnijim stvaranjem kavitacije. Pored intenziteta, tekućinu treba ubrzavati na način koji stvara minimalne gubitke u pogledu turbulencija, trenja i stvaranja talasa. Za to je optimalan jednosmjeran smjer kretanja. Promjenom intenziteta i parametara procesa ultrazvučne obrade ultrazvuk može biti vrlo oštar ili vrlo blag. Zbog toga je ultrazvuk vrlo svestran alat za različite primjene.

Blage primjene, u kojima se primjenjuje blaga ultrazvučna obrada pod blagim uvjetima, uključuju otplinjavanje, emulgiranje, te aktivaciju enzima. Zahtjevne primjene ultrazvukom visokog intenziteta/ velike snage (uglavnom pod povišenim pritiskom) su mokro mljevenje, deaglomeracija & smanjenje veličine čestica te dispergiranje. Kod mnogih primjena kao što su ekstrakcija, dezintegracija ili sonohemija, potrebni ultrazvučni intenzitet zavisi od konkretnog materijala koji se obrađuje ultrazvukom. Zahvaljujući raznolikosti parametara koji se mogu prilagoditi pojedinačnom procesu, ultrazvuk omogućava pronalaženje optimalne tačke za svaki pojedinačni proces.
Pored izvanredne konverzije snage, ultrazvučna obrada nudi veliku prednost potpune kontrole nad najvažnijim parametrima: amplitudom, pritiskom, temperaturom, viskoznošću i koncentracijom. To pruža mogućnost podešavanja svih tih parametara s ciljem pronalaženja idealnih parametara obrade za svaki pojedini materijal. Rezultat su veća djelotvornost i optimizirana efikasnost.

Ultrazvuk za poboljšanje procesa fermentacije, objašnjen na primjeru proizvodnje bioetanola

Bioetanol je proizvod razgradnje biomase ili biorazgradive materije iz otpada djelovanjem anaerobnih ili aerobnih bakterija. Proizvedeni etanol uglavnom se koristi kao biogorivo. Zbog toga je bioetanol obnovljiva i ekološki prihvatljiva alternativa fosilnim gorivima, kao što je prirodni plin.
Za proizvodnju etanola iz biomase kao sirovina se mogu koristiti šećer, škrob i lignocelulozni materijal. U industrijskoj proizvodnji trenutno prevladavaju šećer i škrob jer su ekonomski povoljni.
Kako ultrazvuk poboljšava proces prilagođen kupcu, s određenom sirovinom i u zadanim uvjetima, može se vrlo jednostavno isprobati testovima izvodljivosti. U prvom koraku ultrazvučna obrada male količine suspenzije sirovine ultrazvučnim laboratorijskim uređajem pokazat će utiče li ultrazvuk na sirovinu.

Testiranje izvodljivosti

U prvoj fazi testiranja prikladno je unijeti relativno veliku količinu ultrazvučne energije u mali volumen tekućine jer se time povećava šansa da se vidi mogu li se postići ikakvi rezultati. Mali volumen uzorka također skraćuje vrijeme rada s laboratorijskim uređajem i smanjuje troškove prvih testova.
Ultrazvučni talasi prenose se u tekućinu preko površine sonotrode. Ispod površine sonotrode intenzitet ultrazvuka je najveći. Zato se preferiraju male udaljenosti između sonotrode i materijala koji se obrađuje ultrazvukom. Kada se izlaže mali volumen tekućine, udaljenost od sonotrode može se održati malom.
Tabela u nastavku prikazuje tipične nivoe energije/volumena za procese ultrazvučne obrade nakon optimizacije. Budući da se prva ispitivanja neće provoditi pri optimalnoj konfiguraciji, ultrazvučna obrada intenzitetom i vremenom koji su 10 do 50 puta veći od tipične vrijednosti pokazat će ima li ikakvog učinka na materijal koji se obrađuje ultrazvukom ili ne.

Proces	Energija/ Volumen	Volumen uzorka	Snaga	Vrijeme
Jednostavan	< 100Ws/mL	10mL	50W	< 20 sek
Srednji	100Ws/mL do 500Ws/mL	10mL	50W	20 do 100 sek
Zahtjevan	> 500Ws/mL	10mL	50W	>100 sek

Tabela 1 – Tipične vrijednosti ultrazvučne obrade nakon optimizacije procesa

Stvarni unos snage tokom probnih ispitivanja može se bilježiti putem integriranog bilježenja podataka (UP200Ht i UP200St), PC sučelja ili mjerača snage. U kombinaciji sa zabilježenim podacima o postavci amplitude i temperaturi mogu se evaluirati rezultati svakog ispitivanja i utvrditi donja granica za energiju/volumen.
Ako je tokom testova odabrana optimalna konfiguracija, performanse te konfiguracije mogle bi se provjeriti u koraku optimizacije i na kraju povećati na komercijalni nivo. Radi lakše optimizacije toplo se preporučuje ispitati i granice ultrazvučne obrade, npr. temperaturu, amplitudu ili energiju/volumen za specifične formulacije. Budući da ultrazvuk može imati negativne efekte na ćelije, hemikalije ili čestice, kritične nivoe za svaki parametar potrebno je ispitati kako bi se naredna optimizacija ograničila na raspon parametara u kojem se negativni efekti ne primjećuju. Za studiju izvodljivosti preporučuju se mali laboratorijski ili stolni uređaji kako bi se ograničili troškovi opreme i uzoraka u takvim ispitivanjima. Općenito uređaji od 100 do 1.000 vati vrlo dobro služe svrsi studije izvodljivosti. (usp. Hielscher 2005)

Optimizacija

Rezultati postignuti tokom studija izvodljivosti mogu pokazati prilično visoku potrošnju energije s obzirom na mali obrađeni volumen. Ali svrha testa izvodljivosti prvenstveno je pokazati efekte ultrazvuka na materijal. Ako su se u testiranju izvodljivosti pojavili pozitivni efekti, moraju se uložiti daljnji napori da se optimizira omjer energije/volumena. To znači istražiti idealnu konfiguraciju ultrazvučnih parametara kako bi se postigao najveći prinos uz najmanju moguću potrošnju energije, čime proces postaje ekonomski najrazumniji i efikasan. Da bi se pronašla optimalna konfiguracija parametara – kojom se postižu željene prednosti uz minimalan unos energije – mora se istražiti korelacija između najvažnijih parametara: amplitude, pritiska, temperature i sastava tekućine. U ovom drugom koraku preporučuje se prelazak s šaržne ultrazvučne obrade na kontinuiranu ultrazvučnu postavku s reaktorom s protočnom ćelijom jer se važan parametar pritiska ne može mijenjati kod šaržne ultrazvučne obrade. Tokom ultrazvučne obrade u šarži pritisak je ograničen na okolni pritisak. Ako proces ultrazvučne obrade prolazi kroz komoru protočne ćelije pod pritiskom, pritisak se može povećati (ili smanjiti), što općenito utiče na ultrazvučnu kavitaciju drastično. Korištenjem protočne ćelije može se odrediti korelacija između pritiska i efikasnosti procesa. Ultrazvučni procesori snage između 500 vati i 2000 vati najpogodniji su za optimizaciju procesa.

Povećanje razmjera na komercijalnu proizvodnju

Kada se pronađe optimalna konfiguracija, daljnje povećanje razmjera je jednostavno jer su ultrazvučni procesi potpuno ponovljivi na linearnoj skali. To znači da je, kada se ultrazvuk primjenjuje na identičnu formulaciju tekućine uz identičnu konfiguraciju parametara obrade, za postizanje identičnog rezultata potrebna ista energija po volumenu, neovisno o razmjeru obrade. (Hielscher 2005). To omogućava primjenu optimalne konfiguracije ultrazvučnih parametara na proizvodnju u punom razmjeru. Praktično, volumen koji se može obraditi ultrazvukom nije ograničen. Dostupni su komercijalni ultrazvučni sistemi snage do 16.000 vati po jedinici, koji se mogu instalirati u klastere. Takvi klasteri ultrazvučnih procesora mogu se instalirati paralelno ili serijski. Klasterskom instalacijom ultrazvučnih procesora velike snage ukupna snaga je gotovo neograničena, tako da se veliki tokovi volumena mogu obrađivati bez problema. Također, ako je potrebna prilagodba ultrazvučnog sistema, npr. radi podešavanja parametara za izmijenjenu formulaciju tekućine, to se uglavnom može učiniti promjenom sonotrode, boostera ili protočne ćelije. Linearna skalabilnost, ponovljivost i prilagodljivost ultrazvuka čine ovu inovativnu tehnologiju efikasnom i isplativom.

Parametri ultrazvučne obrade

Ultrazvučna obrada tekućina opisuje se nizom parametara. Najvažniji su amplituda, pritisak, temperatura, viskoznost i koncentracija. Rezultat procesa, kao što je veličina čestica, za zadanu konfiguraciju parametara funkcija je energije po obrađenom volumenu. Funkcija se mijenja s promjenama pojedinačnih parametara. Nadalje, stvarna izlazna snaga po površini sonotrode ultrazvučne jedinice zavisi od tih parametara. Izlazna snaga po površini sonotrode je površinski intenzitet (I). Površinski intenzitet zavisi od amplitude (A), pritiska (p), volumena reaktora (VR), temperature (T), viskoznosti (η) i drugih parametara.

Učinak generirane kavitacije zavisi od površinskog intenziteta. Na isti način korelira i rezultat procesa. Ukupna izlazna snaga ultrazvučne jedinice je proizvod površinskog intenziteta (I) i površine (S):

P [W] I [W / mm²]* S[mm²]

Amplituda

Amplituda oscilacije opisuje put (npr. 50 µm) koji površina sonotrode pređe u zadanom vremenu (npr. 1/20.000 s pri 20 kHz). Što je amplituda veća, to je veća brzina kojom se pritisak snižava i povećava pri svakom hodu. Pored toga, povećava se i volumen istisnut pri svakom hodu, što rezultira većim volumenom kavitacije (veličina i/ili broj mjehurića). Kada se primjenjuju na disperzije, veće amplitude pokazuju veće razorno djelovanje na čvrste čestice. Tabela 1 prikazuje opće vrijednosti za neke ultrazvučne procese.

Pritisak

Tačka ključanja tekućine zavisi od pritiska. Što je pritisak veći, to je tačka ključanja viša, i obrnuto. Povišeni pritisak omogućava kavitaciju na temperaturama blizu tačke ključanja ili iznad nje. Također povećava intenzitet implozije, koji je povezan s razlikom između statičkog pritiska i pritiska pare unutar mjehurića (usp. Vercet et al. 1999). Budući da se ultrazvučna snaga i intenzitet brzo mijenjaju s promjenama pritiska, preferira se pumpa konstantnog pritiska. Pri dovođenju tekućine u protočnu ćeliju pumpa treba biti sposobna da podnese konkretan protok tekućine pri odgovarajućim pritiscima. Membranske pumpe; pumpe s elastičnom cijevi, crijevom ili stiskanjem; peristaltičke pumpe; ili klipne ili plunžerske pumpe stvarat će naizmjenične fluktuacije pritiska. Preferiraju se centrifugalne pumpe, zupčaste pumpe, spiralne pumpe i pumpe s progresivnom šupljinom koje tekućinu za ultrazvučnu obradu dovode pod kontinuirano stabilnim pritiskom. (Hielscher 2005)

Temperatura

Ultrazvučnom obradom tekućine snaga se prenosi u medij. Budući da ultrazvučno generirana oscilacija uzrokuje turbulencije i trenje, tekućina koja se obrađuje ultrazvukom – u skladu sa zakonom termodinamike – zagrijavat će se. Povišene temperature obrađivanog medija mogu biti razorne za materijal i smanjiti djelotvornost ultrazvučne kavitacije. Inovativne ultrazvučne protočne ćelije opremljene su rashladnim plaštom (vidi sliku). Time je omogućena tačna kontrola temperature materijala tokom ultrazvučne obrade. Za ultrazvučnu obradu manjih volumena u čaši preporučuje se ledena kupka za odvođenje toplote.

Viskoznost i koncentracija

Ultrazvučno mljevenje i dispergiranje su procesi u tekućini. Čestice moraju biti u suspenziji, npr. u vodi, ulju, otapalima ili smolama. Upotrebom ultrazvučnih protočnih sistema postaje moguće ultrazvučno obrađivati vrlo viskozne, pastozne materijale.
Ultrazvučni procesor velike snage može raditi pri prilično visokim koncentracijama čvrstih tvari. Visoka koncentracija doprinosi djelotvornosti ultrazvučne obrade, jer je efekt ultrazvučnog mljevenja uzrokovan sudarima među česticama. Istraživanja su pokazala da je brzina lomljenja silicijevog dioksida neovisna o koncentraciji čvrstih tvari do 50% po masi. Obrada master batcheva s visoko koncentriranim udjelom materijala uobičajen je proizvodni postupak koji koristi ultrazvučnu obradu.

Snaga i intenzitet naspram energije

Površinski intenzitet i ukupna snaga opisuju samo intenzitet obrade. Da bi se proces ultrazvučne obrade opisao tako da bude skalabilan i ponovljiv, moraju se uzeti u obzir volumen uzorka koji se obrađuje ultrazvukom i vrijeme izlaganja određenom intenzitetu. Za zadanu konfiguraciju parametara rezultat procesa, npr. veličina čestica ili hemijska konverzija, zavisit će od energije po volumenu (E/V).

Rezultat = f (E /V )

Pri čemu je energija (E) proizvod izlazne snage (P) i vremena izlaganja (t).

E[Ws] = P[W]*t[s]

Promjene u konfiguraciji parametara mijenjat će funkciju rezultata. To zauzvrat mijenja količinu energije (E) potrebnu za zadanu vrijednost uzorka (V) da bi se dobila određena vrijednost rezultata. Zbog toga nije dovoljno u proces unijeti određenu snagu ultrazvuka da bi se dobio rezultat. Potreban je sofisticiraniji pristup da bi se odredila potrebna snaga i konfiguracija parametara pri kojoj tu snagu treba unijeti u procesni materijal. (Hielscher 2005)

Proizvodnja bioetanola potpomognuta ultrazvukom

Već je poznato da ultrazvuk poboljšava proizvodnju bioetanola. Preporučuje se tekućinu s biomasom zgusnuti u visokoviskoznu suspenziju koja se još uvijek može pumpati. Ultrazvučni reaktori mogu podnijeti prilično visoke koncentracije čvrstih tvari, tako da se proces ultrazvučne obrade može provoditi što efikasnije. Što je više materijala u suspenziji, to se manje obrađuje tekućine nosača, koja nema koristi od procesa ultrazvučne obrade. Budući da unos energije u tekućinu prema zakonu termodinamike uzrokuje njeno zagrijavanje, to znači da se ultrazvučna energija, koliko je god moguće, primjenjuje na ciljni materijal. Takvim efikasnim dizajnom procesa izbjegava se nepotrebno zagrijavanje viška tekućine nosača.
Ultrazvuk potpomaže ekstrakciju intracelularnog materijala i time ga čini dostupnim za enzimsku fermentaciju. Blaga ultrazvučna obrada može pojačati enzimsku aktivnost, ali za ekstrakciju biomase bit će potreban intenzivniji ultrazvuk. Stoga enzime treba dodati u suspenziju biomase nakon ultrazvučne obrade, jer intenzivan ultrazvuk inaktivira enzime, što je neželjeni efekt.

Aktualni rezultati postignuti naučnim istraživanjem:

Studije Yoswathane i sar. (2010) o proizvodnji bioetanola iz slame riže pokazale su da kombinacija kiselinskog predtretmana i ultrazvuka prije enzimskog tretmana dovodi do povećanog prinosa šećera do 44% (na osnovi slame riže). To pokazuje djelotvornost kombinacije fizičkog i hemijskog predtretmana prije enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala u šećer. 

Grafikon 2 grafički prikazuje pozitivne efekte ultrazvučnog zračenja tokom proizvodnje bioetanola iz slame riže. (Drveni ugalj je korišten za detoksikaciju predtretiranih uzoraka nakon kiselinskog/ enzimskog predtretmana i ultrazvučnog predtretmana.)

U drugoj nedavnoj studiji ispitivan je utjecaj ultrazvučne obrade na vanćelijske i unutarćelijske nivoe enzima β-galaktozidaze. Sulaiman i sar. (2011) uspjeli su znatno poboljšati produktivnost proizvodnje bioetanola primjenom ultrazvuka pri kontroliranoj temperaturi, čime su stimulirali rast kvasca Kluyveromyces marxianus (ATCC 46537). Autori rada zaključuju da je isprekidana ultrazvučna obrada ultrazvukom velike snage (20 kHz) pri radnim ciklusima od ≤20% stimulirala proizvodnju biomase, metabolizam laktoze i proizvodnju etanola kod K. marxianus pri relativno visokom intenzitetu ultrazvučne obrade od 11,8Wcm². Pod najboljim uvjetima ultrazvučna obrada povećala je konačnu koncentraciju etanola za skoro 3,5 puta u odnosu na kontrolu. To je odgovaralo 3,5 puta većoj produktivnosti etanola, ali je zahtijevalo 952W dodatnog unosa snage po kubnom metru podloge putem ultrazvučne obrade. Taj dodatni zahtjev za energijom bio je svakako u okviru prihvatljivih operativnih normi za bioreaktore i, za proizvode visoke vrijednosti, mogao se lako nadoknaditi povećanom produktivnošću.

Zaključak: Prednosti fermentacije potpomognute ultrazvukom

Ultrazvučni tretman pokazao se kao efikasna i inovativna tehnika za povećanje prinosa bioetanola. Ultrazvuk se prvenstveno koristi za ekstrakciju intracelularnog materijala iz biomase, kao što su kukuruz, soja, slama, lignocelulozni materijal ili biljni otpad.

• Povećanje prinosa bioetanola
• Dezintegracija/ razgradnja ćelija i oslobađanje intracelularnog materijala
• Poboljšana anaerobna razgradnja
• Aktivacija enzima blagom ultrazvučnom obradom
• Poboljšanje efikasnosti procesa korištenjem suspenzija visoke koncentracije

Jednostavno testiranje, ponovljivo povećanje razmjera i lahka instalacija (također u već postojećim proizvodnim tokovima) čine ultrazvuk isplativom i efikasnom tehnologijom. Pouzdani industrijski ultrazvučni procesori za komercijalnu obradu su dostupni i omogućavaju ultrazvučnu obradu praktično neograničenih volumena tekućine.