Ultrazvučna priprema lipozoma

Lipozomi proizvedeni ultrazvukom pokazuju vrlo visoku efikasnost inkapsulacije, veliki kapacitet punjenja i ujednačeno malu sferičnu veličinu. Zahvaljujući tome ultrazvučni lipozomi nude izvrsnu bioraspoloživost. Hielscher Ultrasonics nudi ultrazvučne uređaje za pouzdanu proizvodnju lipozoma farmaceutskog kvaliteta u šaržnom i kontinuiranom načinu rada.

Prednosti ultrazvučne proizvodnje lipozoma

Ultrazvučna inkapsulacija lipozoma je tehnika kojom se lijekovi ili druga terapijska sredstva inkapsuliraju u lipozome pomoću ultrazvučne energije. U poređenju s drugim metodama inkapsulacije lipozoma, ultrazvučna inkapsulacija ima nekoliko prednosti zbog kojih je superiorna proizvodna tehnika.

• Veliko opterećenje, visoka efikasnost inkapsulacije: Dobro je poznato da se ultrazvučnom proizvodnjom lipozoma dobijaju lipozomi s visokim opterećenjem aktivnim sastojcima, npr. vitaminom C, molekulama lijekova itd. Istovremeno, metoda ultrazvučne obrade (sonikacije) pokazuje visoku efikasnost inkapsulacije. To znači da se ultrazvučnom obradom inkapsulira visok postotak aktivne tvari. Zaključno, to ultrazvučnu obradu čini vrlo efikasnom metodom za proizvodnju lipozoma.
• Ujednačeno mali lipozomi: Jedna od prednosti ultrazvučne inkapsulacije lipozoma je mogućnost proizvodnje vrlo ujednačenih lipozoma uske raspodjele veličina. Ultrazvučna energija može se koristiti za razbijanje većih lipozoma ili lipidnih agregata u manje, ujednačenije lipozome. To dovodi do veće dosljednosti veličine i oblika lipozoma, što može biti važno za primjene u isporuci lijekova, gdje veličina čestica može utjecati na njihovu farmakokinetiku i djelotvornost.
• Primjenjivo na bilo koje molekule: Još jedna prednost ultrazvučne inkapsulacije lipozoma je mogućnost inkapsulacije širokog spektra lijekova i drugih terapijskih sredstava. Tehnika se može koristiti za inkapsulaciju i hidrofilnih i hidrofobnih lijekova, što je drugim metodama teško postići. Osim toga, ultrazvučna energija može se koristiti za inkapsulaciju makromolekula i nanočestica, koje mogu biti prevelike za inkapsulaciju drugim metodama.
• Brzo i pouzdano: Ultrazvučna inkapsulacija lipozoma je također relativno jednostavan i brz proces. Ne zahtijeva upotrebu agresivnih kemikalija ni visokih temperatura, koje mogu štetiti terapijskim sredstvima koja se inkapsuliraju.
• Povećanje razmjera (scale-up): Osim toga, tehnika se može lako povećati na razmjer velike proizvodnje, što je čini isplativom opcijom za primjene u isporuci lijekova.

Ukratko, ultrazvučna inkapsulacija lipozoma je superiorna tehnika inkapsulacije lipozoma zahvaljujući mogućnosti proizvodnje ujednačenih lipozoma uske raspodjele veličina, inkapsulacije širokog spektra terapijskih sredstava te svojoj jednostavnosti i skalabilnosti.

Nakon formiranja lipidnog filma i naknadne rehidracije, ultrazvučna obrada koristi se za poticanje zarobljavanja aktivnih sastojaka u lipozomu. Osim toga, ultrazvučnom obradom postiže se željena veličina lipozoma.

Ultrazvučna priprema lipozoma za farmaceutske i kozmetičke proizvode

Lipozomi (vezikule na bazi lipida), transferosomi (ultradeformabilni lipozomi), etosomi (ultradeformabilne vezikule s visokim sadržajem alkohola) i niosomi (sintetičke vezikule) su mikroskopske vezikule koje se mogu vještački pripremiti kao globularni nosači u koje se mogu inkapsulirati aktivne molekule. Te vezikule promjera između 25 i 5000 nm često se koriste kao nosači lijekova u farmaceutskoj i kozmetičkoj industriji, na primjer za oralnu ili topikalnu isporuku lijekova, genetsku terapiju i imunizaciju. Ultrazvučna obrada je naučno dokazana metoda za vrlo efikasnu proizvodnju lipozoma. Ultrazvučni uređaji Hielscher proizvode lipozome s visokim opterećenjem aktivnim sastojcima i vrhunskom bioraspoloživošću.

Lipozomi i lipozomalne formulacije

Lipozomi su unilamelarni, oligolamelarni ili multilamelarni vezikularni sistemi i sastoje se od istog materijala kao i ćelijska membrana (lipidni dvosloj). S obzirom na sastav i veličinu, lipozomi se razlikuju kako slijedi:

• multilamelarne vezikule (MLV, 0,1-10μm)
• male unilamelarne vezikule (SUV, <100 nm)
• velike unilamelarne vezikule (LUV, 100–500 nm)
• džinovske unilamelarne vezikule (GUV, ≥1 μm)

Osnovnu strukturu lipozoma čine fosfolipidi. Fosfolipidi imaju hidrofilnu glavu i hidrofobni rep, koji se sastoji od duge ugljikovodične lanca.
Membrana lipozoma ima vrlo sličan sastav kao kožna barijera, pa se lako mogu ugraditi u ljudsku kožu. Kako se lipozomi spajaju s kožom, mogu zarobljene tvari isporučiti direktno na odredište, gdje aktivne tvari mogu ispuniti svoju funkciju. Tako lipozomi povećavaju penetrabilnost/permeabilnost kože za zarobljene farmaceutske i kozmetičke tvari. Također su lipozomi bez inkapsuliranih tvari, tzv. prazne vezikule, snažne aktivne tvari za kožu, jer «phosphatidylcholin» sadrži dvije esencijalne komponente koje ljudski organizam ne može sam proizvesti: linolnu kiselinu i holin.
Lipozomi se koriste kao biokompatibilni nosači lijekova, peptida, proteina, «plasmic DNA», antisense oligonukleotida ili ribozima, u farmaceutske, kozmetičke i biohemijske svrhe. Ogromna raznolikost veličine čestica i fizičkih parametara lipida pruža privlačan potencijal za izradu vozila po mjeri za širok spektar primjena. (Ulrich 2002)

Formiranje lipozoma ultrazvukom

Lipozomi se mogu formirati upotrebom ultrazvuka. Osnovni materijal za pripremu lipozoma su molekule «amphilic» izvedene iz lipida bioloških membrana ili zasnovane na njima. Za formiranje malih unilamelarnih vezikula (SUV) lipidna disperzija se blago ultrazvučno obrađuje – npr. ručnim ultrazvučnim uređajem UP50H (50W, 30kHz), uređajem VialTweeter ili ultrazvučnim reaktorom CupHorn – u ledenom kupatilu. Trajanje takve ultrazvučne obrade je otprilike 5 – 15 minuta. Druga metoda za proizvodnju malih unilamelarnih vezikula je ultrazvučna obrada lipozoma multilamelarnih vezikula.
Dinu-Pirvu et al. (2010) izvještavaju o dobijanju transferosoma ultrazvučnom obradom MLV na sobnoj temperaturi.
Hielscher Ultrasonics nudi razne ultrazvučne uređaje, sonotrode i pribor te na taj način može osigurati najprikladniju ultrazvučnu postavku za vrlo efikasnu inkapsulaciju lipozoma u bilo kojem razmjeru.

Ultrazvučna inkapsulacija aktivnih tvari u lipozome

Lipozomi djeluju kao nosači aktivnih sastojaka kao što su vitamini, terapijske molekule, peptidi itd. Ultrazvuk je efikasan alat za pripremu i formiranje lipozoma za zarobljavanje aktivnih tvari. Istovremeno, ultrazvučna obrada pomaže procesu inkapsulacije i zarobljavanja, tako da se proizvode lipozomi s visokim opterećenjem aktivnim sastojcima. Prije inkapsulacije lipozomi se zbog međudjelovanja površinskih naboja polarnih glava fosfolipida teže stvaranju nakupina (usp. Míckova i sur. 2008), a osim toga moraju se otvoriti. Primjera radi, Zhu i sur. (2003) opisuju inkapsulaciju biotina u prahu u lipozome ultrazvučnom obradom. Nakon što je biotin u prahu dodan u otopinu suspenzije vezikula, otopina je ultrazvučno obrađena. Nakon ove obrade biotin je bio zarobljen u lipozomima.
Saznajte više o ultrazvučnoj inkapsulaciji GLP-1 peptida (npr. semaglutida) u lipozome!

Lipozomalne emulzije uz ultrazvučnu obradu

Da bi se pojačao njegujući učinak hidratantnih ili anti-age krema, losiona, gelova i drugih kozmeceutskih formulacija, lipozomalnim disperzijama dodaju se emulgatori kako bi se stabilizirale veće količine lipida. Međutim, istraživanja su pokazala da je sposobnost lipozoma općenito ograničena. Dodatkom emulgatora ovaj učinak će se pojaviti ranije, a dodatni emulgatori slabe barijerni afinitet fosfatidilholina. Nanočestice – sastavljene od fosfatidilholina i lipida – odgovor su na taj problem. Te nanočestice čini kapljica ulja prekrivena monoslojem fosfatidilholina. Upotreba nanočestica omogućava formulacije koje mogu apsorbirati više lipida i ostati stabilne, tako da dodatni emulgatori nisu potrebni.
Ultrazvučna obrada je dokazana metoda za proizvodnju nanoemulzija i nanodisperzija. Ultrazvuk visokog intenziteta daje snagu potrebnu za dispergiranje tekuće faze (dispergirana faza) u sitne kapljice u drugoj fazi (kontinuirana faza). U zoni dispergiranja kavitacijski mjehurići koji implodiraju uzrokuju intenzivne udarne talase u okolnoj tekućini i dovode do stvaranja tečnih mlazova velike brzine. Kako bi se novoformirane kapljice dispergirane faze stabilizirale protiv koalescencije, emulziji se dodaju emulgatori (površinski aktivne tvari, surfaktanti) i stabilizatori. Budući da koalescencija kapljica nakon njihova razbijanja utječe na konačnu raspodjelu veličine kapljica, koriste se efikasno stabilizirajući emulgatori kako bi se konačna raspodjela veličine kapljica održala na razini jednakoj raspodjeli neposredno nakon razbijanja kapljica u ultrazvučnoj zoni dispergiranja.

Lipozomalne disperzije uz ultrazvučnu obradu

Lipozomalnim disperzijama koje se zasnivaju na nezasićenom «phosphatidylchlorine» nedostaje stabilnost protiv oksidacije. Stabilizacija disperzije može se postići antioksidansima, kao što je kompleks vitamina C i E.

Formiranje lipozoma metodom reverzne fazne evaporacije uz ultrazvučnu obradu

Ortan i sur. (2002) postigli su u svojoj studiji o ultrazvučnoj pripremi eteričnog ulja Anethum graveolens u lipozomima dobre rezultate. Nakon ultrazvučne obrade dimenzije lipozoma bile su između 70-150 nm, a za MLV između 230-475 nm; te su vrijednosti bile približno konstantne i nakon 2 mjeseca, ali su porasle nakon 12 mjeseci, posebno u SUV disperziji (vidi histograme ispod). Mjerenje stabilnosti, koje se odnosilo na gubitak eteričnog ulja i raspodjelu veličina, također je pokazalo da su lipozomalne disperzije zadržale sadržaj hlapljivog ulja. To upućuje na to da je zarobljavanje eteričnog ulja u lipozomima povećalo stabilnost ulja.

Ortan i sur. (2009): Stabilnost MLV i SUV disperzija nakon 1 godine. Lipozomalne formulacije čuvane su na 4±1 ºC.

Hielscher ultrazvučni procesori idealni su uređaji za primjene u kozmetičkoj i farmaceutskoj industriji. Sistemi sastavljeni od više ultrazvučnih procesora snage do 16.000 watta svaki pružaju kapacitet potreban da se ova laboratorijska primjena prevede u efikasnu proizvodnu metodu za dobijanje fino dispergiranih emulzija u kontinuiranom protoku ili u šarži – uz postizanje rezultata uporedivih s rezultatima današnjih najboljih dostupnih visokotlačnih homogenizatora, kao što su ventili s otvorom. Pored ove visoke efikasnosti pri kontinuiranoj emulgaciji, Hielscher ultrazvučni uređaji zahtijevaju vrlo malo održavanja te se vrlo lako koriste i čiste. Ultrazvuk zapravo pomaže čišćenju i ispiranju. Ultrazvučna snaga je podesiva i može se prilagoditi pojedinim proizvodima i zahtjevima emulgacije. Dostupni su i posebni reaktori s protočnom ćelijom koji ispunjavaju napredne zahtjeve CIP (clean-in-place) i SIP (sterilize-in-place).

Često postavljana pitanja o lipozomima

Koje se vrste lipozoma razlikuju?

Lipozomi se razvrstavaju u različite vrste prema veličini i broju dvoslojeva koje sadrže. Te kategorije uključuju:

• Male unilamelarne vezikule (SUV): To su najmanji lipozomi s jednim lipidnim dvoslojem.
• Velike unilamelarne vezikule (LUV): Veće od SUV-ova, i one imaju jedan dvosloj.
• Multilamelarne vezikule (MLV): One sadrže više koncentričnih dvoslojeva.
• Multivezikularne vezikule (MVV): One se sastoje od više manjih vezikula unutar veće vezikule.

Druge specijalizirane vrste uključuju:

• PEGilirani lipozomi: Lipozomi modificirani polietilen glikolom (PEG) radi poboljšanja stabilnosti i vremena cirkulacije.
• Nanolipozomi: Vrlo mali lipozomi, tipično korišteni za ciljanu isporuku lijekova.

Koje strukture vezikula mogu imati lipozomi?

Lipozomi se dalje razvrstavaju prema strukturi vezikule u sedam glavnih vrsta:

• Multilamelarne velike vezikule (MLV): Sadrže više dvoslojeva.
• Oligolamelarne vezikule (OLV): Imaju nekoliko dvoslojeva.
• Male unilamelarne vezikule (SUV): Najmanje, s jednim dvoslojem.
• Unilamelarne vezikule srednje veličine (MUV): Srednje veličine, s jednim dvoslojem.
• Velike unilamelarne vezikule (LUV): Veće, s jednim dvoslojem.
• Džinovske unilamelarne vezikule (GUV): Vrlo velike, s jednim dvoslojem.
• Multivezikularne vezikule (MVV): Više vezikula unutar jedne velike vezikule.

Koje su razlike između lipozoma i niosoma?

Lipozomi i niosomi razlikuju se uglavnom po sastavu:
Lipozomi: Izrađeni od fosfolipida s dvostrukim lancem, koji mogu biti neutralni ili nabijeni.
Niosomi: Izrađeni od nenabijenih surfaktanata s jednostrukim lancem i kolesterola.
Obje strukture nastaju ultrazvučnom obradom, koja potiče sastavljanje vezikula s dvoslojem.

Koja je idealna veličina lipozoma?

Za terapijsku isporuku idealna veličina lipozoma teoretski je između 50 i 200 nanometara u promjeru. Taj raspon veličina optimizira stabilnost i bioraspoloživost. Ultrazvučna obrada se uobičajeno koristi za smanjenje vezikule na željenu veličinu.

Mogu li lipozomi nositi hidrofilne lijekove?

Da, lipozomi mogu nositi hidrofilne lijekove. Cijene se u biomedicinskim primjenama zbog sposobnosti inkapsulacije i hidrofobnih i hidrofilnih tvari. Osim toga, nude visoku biokompatibilnost i biorazgradivost, zbog čega su efikasni sistemi za isporuku.

Kako se prave lipozomi?

Najčešće tehnike pripreme lipozoma su metoda tankog filma i metoda reverzne fazne evaporacije.
Metoda hidratacije tankog filma:

1. Otopite lipide u organskom otapalu.
2. Isparite otapalo da se formira tanki lipidni film.
3. Hidrirajte film vodenom otopinom uz ultrazvučnu obradu kako biste formirali multilamelarne vezikule.

Metoda reverzne fazne evaporacije:

1. Otopite lipide u vodi i etanolu.
2. Ultrazvučno obradite otopinu na 60°C oko 10 minuta kako biste dobili lipidnu pastu.
3. Ohladite lipidnu kašu i dodajte vodu ili pufer kap po kap uz miješanje.
4. Hidrirajte suspenziju 1 sat kako biste formirali multilamelarne vezikule.
5. Smanjite veličinu lipozoma daljnjom ultrazvučnom obradom.

Šta su arheosomi?

Arheosomi su lipozomi izrađeni od arhealnih lipida, koji su poznati po svojoj stabilnosti i otpornosti na ekstremne uvjete. Ta svojstva čine arheosome posebno korisnima za isporuku lijekova i razvoj vakcina u zahtjevnim okruženjima.

Kako se pripremaju arheosomi?

Postupak ultrazvučne obrade prema Piseu (2022): Arheosomi se mogu izraditi od frakcije polarnih lipida “PLF” bakterije Sulfolobussolfataricus ultrazvučnom obradom na 60°C bez potrebe za vanjskim dopunjavanjem lipida. Na 0°C polarni lipidi iz Sulfolobusacidocaldarius uspješno su ultrazvučno obrađeni da bi se formirali arheosomi. Arheosomi s BMD-om i konvencionalni lipozomi, kao i arhealni lipidi izolirani iz Archaea H. salinarum i obogaćeni fosfatidilholinom, izrađeni su tehnikama ultrazvučne obrade. Ultrazvučno obrađene vezikule stvorene su za topikalnu isporuku ultrazvučnom obradom MLV disperzija pri amplitudi od 80 posto tokom 4 minute pomoću sonde Hielscher UP50H (vidi sliku lijevo).

Literatura/reference

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.