Formiranje amiloidnih fibrila pomoću UIP400MTP Microplate Sonicator

Amiloidna vlakna, slično kristalima, formiraju se procesom nukleacije i naknadnog rasta. Međutim, zbog visoke slobodne energetske barijere nukleacije, do spontanog formiranja amiloidnih fibrila dolazi tek nakon produžene lag faze. Ultrazvuk se pojavio kao moćan alat za indukciju nukleacije amiloida, čime se značajno ubrzava formiranje fibrila. Kada se kombinuje sa čitačem mikroploča koji koristi fluorescenciju tioflavina T (ThT), ultrazvučna obrada omogućava detekciju amiloidnih fibrila visoke propusnosti u više uzoraka istovremeno.

Ultrazvučno indukovano formiranje amiloidnih fibrila sa sonikatorom za mikroploče UIP400MTP

Uz UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica, amiloidna vlakna istog kvaliteta u velikim količinama mogu se brzo sintetizirati u istraživačke svrhe. Ovaj efikasan pristup omogućava proučavanje amiloidogenosti proteina. Ova tehnika olakšava brzu i reproducibilnu amiloidnu fibrilaciju, kao što je pokazano kod β2-mikroglobulina (β2-m), amiloidogenog proteina povezanog s amiloidozom povezanom s dijalizom.

Jednostavan eksperimentalni pristup: ultrazvučno indukovana amiloidna fibrilacija

Da bi se izazvalo formiranje fibrila, mikroploča sa 96 jažica postavljena je u centar ultrazvučnog aparata za ploče UIP400MTP sa više jažica, koji osigurava ujednačenu ultrazvučnu ekspoziciju u svim jažicama. Eksperimentalni uslovi su bili sledeći:

1. Svaki bunar je sadržavao 0,2 ml rastvora β2-mikroglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) sa dodatkom 5 μM ThT.
2. Ploča je podvrgnuta ciklusima ultrazvučne obrade, kao što je 1-minutna ultrazvučna obrada nakon čega je uslijedilo 9 minuta pauze.
3. Nakon sonikacije, ThT fluorescencija je izmjerena pomoću čitača mikroploče.

(usp. So et al., 2011.)

Poređenje sa konvencionalnom agitacijom

U poređenju sa tradicionalnim metodama agitacije, ultrazvuk je drastično smanjio fazu kašnjenja formiranja fibrila. U konvencionalnim uslovima protresanja mikroploče, samo 1 od 10 jažica je pokazalo povećanu fluorescenciju ThT nakon 20 sati. Nasuprot tome, korištenjem ciklusne ultrazvučne obrade (15 minuta ultrazvučne obrade nakon čega slijedi 5 minuta mirovanja), značajno povećanje fluorescencije ThT otkriveno je odmah nakon prvog tretmana ultrazvukom.

Brzo ubrzanje kinetike fibrilacije

Rezultati dobiveni od So et al. (2011) su pokazali da se spontano formiranje fibrila β2-mikroglobulina pri pH 2,5 može ubrzati sa nekoliko sati na samo 10-15 minuta ultrazvukom.
Mikroskopija atomske sile (AFM) potvrdila je da se fibrila generirana ultrazvukom u trajanju od 10 minuta svakih 15 minuta morfološki ne razlikuju od onih formiranih jednom minutnom ultrazvukom svakih 10 minuta. Ovo naglašava reproduktivnost i robusnost ultrazvučno indukovane amiloidne fibrilacije.

AFM slike amiloidnih fibrila proizvedene 1-minutnom ultrazvukom svakih 10 minuta (i), 10-minutnom ultrazvučnom obradom svakih 15 minuta (ii) i reakcijom zasijavanja bez ultrazvučne obrade (iii). Bijela traka skale predstavlja 1 μm.
Studija i slike: ©So et al., 2011

Fibrilacija u neutralnim pH uslovima

Čak i pod neutralnim pH uslovima, formiranje fibrila je postignuto nakon vremena kašnjenja od 1,5 sati, što pokazuje da ultrazvuk značajno smanjuje energetsku barijeru za nukleaciju i rast. Ovo dalje podržava hipotezu da je amiloidna fibrilacija prvenstveno fizička reakcija, u velikoj mjeri ograničena energetskom barijerom nukleacije, koju ultrazvuk učinkovito smanjuje.

Utjecaj na istraživanje bolesti povezanih s amiloidom

Lako i pouzdano formiranje amiloidnih fibrila korištenjem ultrazvučnog aparata za mikroploču UIP400MTP ima značajne implikacije za istraživanje Alchajmerove bolesti (AD) i drugih poremećaja povezanih s amiloidom, kao što su Parkinsonova bolest, dijabetes tipa II i sistemska amiloidoza. U AD, agregacija amiloida-β (Aβ) je ključni patološki znak, ali proučavanje njegove kinetike fibrilacije ostaje izazovno zbog dugih faza kašnjenja i varijabilnosti u konvencionalnim metodama. Formiranje fibrila vođeno ultrazvukom ubrzava nukleaciju, osiguravajući visoku reproduktivnost i smanjenu varijabilnost, što je ključno za skrining potencijalnih inhibitora i razumijevanje amiloidogenih mehanizama. Nadalje, sposobnost visoke propusnosti UIP400MTP omogućava istraživanja velikih razmjera pogrešnog savijanja i agregacije proteina, olakšavajući otkrivanje terapeutskih agenasa koji mogu modulirati formiranje fibrila i potencijalno ublažiti neurodegenerativnu progresiju.

Ova studija utvrđuje ultrazvučnu obradu pomoću ultrazvučnog uređaja UIP400MTP sa više jažica kao visoko efikasnu metodu za ubrzavanje formiranja amiloidnih fibrila. Ključne prednosti ovog pristupa uključuju:

• Dramatično smanjenje vremena kašnjenja za fibrilaciju.
• Ujednačeno izlaganje ultrazvuku u svim bunarima, omogućavajući ponovljivo formiranje fibrila.
• Mogućnost skrininga visoke propusnosti, što ga čini pogodnim za istraživanje amiloidogenosti proteina u cijelom genomu.

Integracijom ultrazvučne obrade sa detekcijom fluorescencije ThT, ova metoda pruža brzu, skalabilnu i pouzdanu platformu za proučavanje amiloidne fibrilacije. S obzirom na njegovu efikasnost i potencijal visokog protoka, ovaj pristup može olakšati laku sintezu amiloidnih fibrila za biofizička i farmaceutska istraživanja, nudeći obećavajući alat za studije vezane za amiloid i skrining lijekova.