Formiranje amiloidnih fibrila pomoću ultrazvučnog uređaja za mikroploče UIP400MTP

Amiloidni fibrili, slično kristalima, nastaju procesom nukleacije i potonjeg rasta. Međutim, zbog visoke barijere slobodne energije nukleacije, spontano formiranje amiloidnih fibrila događa se tek nakon duge lag faze. Ultrazvučna obrada pokazala se kao moćan alat za indukciju amiloidne nukleacije, čime se formiranje fibrila značajno ubrzava. U kombinaciji s čitačem mikroploča koji koristi fluorescenciju tioflavina T (ThT), ultrazvučna obrada omogućava detekciju amiloidnih fibrila u više uzoraka istovremeno uz visoku propusnost.

Ultrazvukom inducirano formiranje amiloidnih fibrila pomoću ultrazvučnog uređaja za mikroploče UIP400MTP

Pomoću ultrazvučnog uređaja za višejažične ploče UIP400MTP amiloidni fibrili iste kvalitete mogu se brzo sintetizirati u velikim količinama za istraživačke svrhe. Ovaj efikasan pristup omogućava proučavanje amiloidogenosti proteina. Ova tehnika olakšava brzu i ponovljivu fibrilizaciju amiloida, kao što je pokazano na β2-mikroglobulinu (β2-m), amiloidogenom proteinu povezanom s amiloidozom povezanom s dijalizom.

Jednostavan eksperimentalni pristup: ultrazvukom inducirana fibrilizacija amiloida

Za indukciju formiranja fibrila, mikroploča sa 96 jažica postavljena je u središte ultrazvučnog uređaja za višejažične ploče UIP400MTP, što osigurava ravnomjernu ultrazvučnu izloženost u svim jažicama. Eksperimentalni uvjeti bili su sljedeći:

1. Svaka jažica sadržavala je 0,2 ml otopine β2-mikroglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) uz dodatak 5 μM ThT.
2. Ploča je izlagana ciklusima ultrazvučne obrade, kao što je 1 minuta ultrazvučne obrade nakon koje slijedi 9 minuta pauze.
3. Nakon sonikacije, ThT fluorescencija mjerena je pomoću čitača mikroploča.

(usp. So et al., 2011)

Usporedba s konvencionalnim miješanjem

U poređenju s tradicionalnim metodama miješanja, ultrazvučna obrada drastično je skratila lag fazu formiranja fibrila. U uvjetima konvencionalnog mućkanja mikroploča, samo 1 od 10 jažica pokazala je povećanu ThT fluorescenciju nakon 20 sati. Nasuprot tome, pri cikličnoj ultrazvučnoj obradi (15 minuta sonikacije nakon čega slijedi 5 minuta mirovanja), značajno povećanje ThT fluorescencije detektirano je odmah nakon prvog tretmana sonikacijom.

Brzo ubrzanje kinetike fibrilizacije

Rezultati koje su dobili So et al. (2011) pokazali su da se spontano formiranje fibrila β2-mikroglobulina pri pH 2,5 može ubrzati s nekoliko sati na samo 10–15 minuta uz ultrazvučnu obradu.
Slike dobivene mikroskopijom atomskih sila (AFM) potvrdile su da su fibrili nastali ultrazvučnom obradom od 10 minuta svakih 15 minuta morfološki nerazlučivi od onih formiranih ultrazvučnom obradom od 1 minute svakih 10 minuta. To ističe ponovljivost i robusnost ultrazvukom inducirane fibrilizacije amiloida.

AFM slike amiloidnih fibrila proizvedenih ultrazvučnom obradom od 1 min svakih 10 min (i), sonikacijom od 10 min svakih 15 min (ii) i reakcijom zasijavanja bez ultrazvučne obrade (iii). Bijela skala predstavlja 1 μm.
Studija i slike: ©So et al., 2011

Fibrilizacija u uvjetima neutralnog pH

Čak i u uvjetima neutralnog pH, formiranje fibrila postignuto je nakon lag vremena od 1,5 sati, što pokazuje da ultrazvučna obrada značajno snižava energetsku barijeru nukleacije i rasta. Ovo dodatno podupire hipotezu da je fibrilizacija amiloida prvenstveno fizička reakcija, u velikoj mjeri ograničena energetskom barijerom nukleacije, koju ultrazvučna obrada učinkovito smanjuje.

Utjecaj na istraživanje bolesti povezanih s amiloidom

Jednostavno i pouzdano formiranje amiloidnih fibrila pomoću ultrazvučnog uređaja za mikroploče UIP400MTP ima značajne implikacije za istraživanje Alzheimerove bolesti (AD) i drugih poremećaja povezanih s amiloidom, kao što su Parkinsonova bolest, dijabetes tipa II i sistemske amiloidoze. Kod AD-a je agregacija amiloida-β (Aβ) ključno patološko obilježje, no proučavanje kinetike njegove fibrilizacije i dalje je izazovno zbog dugih lag faza i varijabilnosti konvencionalnih metoda. Formiranje fibrila potaknuto ultrazvučnom obradom ubrzava nukleaciju, osiguravajući visoku ponovljivost i smanjenu varijabilnost, što je ključno za skrining potencijalnih inhibitora i razumijevanje amiloidogenih mehanizama. Nadalje, visoka propusnost uređaja UIP400MTP omogućava opsežna istraživanja pogrešnog savijanja i agregacije proteina, olakšavajući otkrivanje terapijskih agenasa koji mogu modulirati formiranje fibrila i potencijalno ublažiti neurodegenerativnu progresiju.

Ova studija utvrđuje ultrazvučnu obradu pomoću ultrazvučnog uređaja za višejažične ploče UIP400MTP kao visoko efikasnu metodu za ubrzavanje formiranja amiloidnih fibrila. Ključne prednosti ovog pristupa uključuju:

• Dramatično skraćenje lag vremena fibrilizacije.
• Ravnomjerna izloženost ultrazvuku u svim jažicama, što omogućava ponovljivo formiranje fibrila.
• Mogućnost skrininga visoke propusnosti, zbog čega je pogodan za pretraživanja amiloidogenosti proteina na nivou cijelog genoma.

Integracijom ultrazvučne obrade s detekcijom ThT fluorescencije, ova metoda pruža brzu, skalabilnu i pouzdanu platformu za proučavanje fibrilizacije amiloida. S obzirom na njenu efikasnost i potencijal visoke propusnosti, ovaj pristup može olakšati jednostavnu sintezu amiloidnih fibrila za biofizička i farmaceutska istraživanja, nudeći obećavajući alat za studije povezane s amiloidom i skrining lijekova.