PMCA za visokopropusnu detekciju priona pomoću UIP400MTP Sonicator-a
UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica nudi moćno rješenje za pripremu uzoraka visokog protoka u cikličnoj amplifikaciji pogrešno savijanja proteina (PMCA). Pružajući ujednačenu distribuciju energije u više bunara i održavajući precizne parametre sonikacije, ovaj sistem omogućava istovremenu obradu brojnih uzoraka sa izuzetnom ponovljivošću. Ove sposobnosti su kritične za optimizaciju PMCA za otkrivanje priona u niskim koncentracijama u izazovnim biološkim uzorcima, kao što je pljuvačka, gdje inhibitori analize mogu prikriti rezultate.
Prionske bolesti, kao što je bolest hroničnog trošenja (CWD) kod cervida i Creutzfeldt-Jakobova bolest (CJD) kod ljudi, su neurodegenerativni poremećaji uzrokovani pogrešno savijenim prionskim proteinima (PrPSc). Ove bolesti često uključuju niske razine infektivnih priona u tjelesnim tekućinama, kao što su pljuvačka, krv i urin, što otežava dijagnozu i istraživanje. Horizontalni prijenos CWD kroz prione izlivene u matrice okoliša ima posebno značajne implikacije na upravljanje divljim životinjama i ekološko zdravlje. Slično, kod bolesti kao što je Creutzfeldt-Jakobova bolest, pouzdana amplifikacija pogrešno savijenih prionskih proteina iz ljudskih uzoraka je ključna za unapređenje dijagnostike i razumijevanje progresije bolesti.
Visokoefikasna proteinska misfolding amplifikacija sa UIP400MTP High-Throughput Sonicator
Primjena modificiranog PMCA protokola omogućava da se zaobiđu uobičajeni inhibitori analize (npr. mucini u pljuvački) i postigne visoka osjetljivost u otkrivanju priona koji bi inače bili nedetektljivi ili dvosmisleni korištenjem tehnika kao što je konverzija izazvana potresom u realnom vremenu (RT-QuIC). Ovaj napredak poboljšava otkrivanje priona za različite bolesti, čineći PMCA nezamjenjivim alatom za istraživanje i dijagnostiku priona. Sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP olakšava PMCA ultrazvučnu obradu brojnih uzoraka u mikropločama (npr. pločama sa 6, 24 ili 96 jažica) ili bočicama u stalku za epruvete.
Protokol za cikličku amplifikaciju pogrešno savijanja proteina visoke propusnosti (PMCA)
Sljedeći protokol omogućava efikasnu obradu velikog broja uzoraka pod potpuno istim uvjetima za robusne rezultate istraživanja.
priprema uzorka
Početni materijal:
Pripremite uzorke prema:
- Resuspendiranje peleta za ekstrakciju sarkozila u PMCA supstratu.
- Direktno sipanje homogenata mozga ili uzoraka krvi sa sjemenkama priona.
podloga:
- Koristite 10% (wt/vol) homogenat mozga pripremljen od transgenih miševa koji prekomjerno eksprimiraju PrPC (npr. Tg miševi).
- Homogenizirati moždano tkivo u:
– 1× PBS.
– 150 mM NaCl.
– 1% Triton X-100. - Čuvati podlogu na -80ºC do upotrebe.
Postavljanje uzorka u mikroploči ili epruvetama:
cijevi:
- Dodajte 90 μL supstrata homogenata mozga i zasijajte s 10 μL uzorka (npr. krv, homogenat mozga ili sarkozil peleta).
- Stavite 3 teflonske perle (prečnika 1,59 mm ili 2,38 mm) u svaku epruvetu od 0,2 mL.
- Montirajte cijevi u stalak kompatibilan sa UIP400MTP sonikatorom.
Mikroploča sa 6 jažica:
- Dodajte 5 mL supstrata homogenata mozga i zasijajte s 500 μL uzorka po jažici.
- Dodajte 3 teflonske perle u svaku udubinu.
PMCA procedura
plasman:
Stavite stalak za epruvetu ili mikroploču sa 6 jažica u sonikator UIP400MTP prema uputstvima proizvođača.
Biciklistički program:
Izvršite 144 PMCA ciklusa na sljedeći način:
- Inkubacija: 29 minuta i 30 sekundi na 37°C.
- Sonikacija: 30 sekundi pri 60% amplitude.
- Praćenje temperature: Koristite temperaturni senzor koji se može priključiti da nadgledate temperaturu uzorka i programirajte UIP400MTP na maks. temperatura od 48-50°C.
Naredne runde:
Nakon završetka prvog kruga od 144 ciklusa, prenesite alikvot pojačanog materijala:
- Razrijediti 10 puta u svježem homogenom supstratu transgenog mozga miša.
- Izvedite 96 PMCA ciklusa za naredne runde, održavajući iste parametre sonikacije.
- Nastavite do željenog broja rundi (obično do 5).
Detekcija PrPSc
- Probava proteinaze K:
– Tretirajte uzorke Proteinazom K (50 μg/mL) na 37°C 1 sat.
– Prekinite varenje dodavanjem SDS pufera za uzorke i kuhanjem 10 minuta. - Western blot analiza:
– Analizirajte probavljene uzorke koristeći:
– 6H4 ili PRC1 anti-PrP antitijela.
– Izvršite SDS-PAGE i prenesite na PVDF membrane radi detekcije.
UIP400MTP osigurava pouzdanu pripremu uzoraka i laku integraciju sa postojećim laboratorijskim radnim procesima
UIP400MTP nije ultrazvučna kupka. To je rog za čaše visokog intenziteta za fokusiranu sonikaciju. Ovaj moćni beskontaktni sonikator pruža ujednačenu sonikaciju u svim bunarima vaše standardne ploče za bušotine. Imate preciznu kontrolu nad amplitudom, snagom i pulsiranjem. Ugrađeni tajmer i temperaturna sonda osiguravaju konzistentne rezultate. Sonikator ploča UIP400MTP hladi uzorke vodenim kupatilom (opciono eksterni rashladni uređaj).
Obradite više uzoraka za robusnije rezultate
UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica značajno poboljšava efikasnost i skalabilnost ciklične amplifikacije pogrešno savijanja proteina (PMCA), rješavajući tradicionalno dugotrajnu prirodu procedure. Omogućujući istovremenu obradu do 96 uzoraka u ploči sa 96 jažica, sistem pojednostavljuje radni tok PMCA, održavajući precizne i ujednačene uslove sonikacije u svim bunarima. Ova sposobnost visoke propusnosti minimizira ručno rukovanje, smanjuje radno intenzivne korake i osigurava reproduktivnost, što ga čini nezamjenjivim alatom za istraživanje priona. Bilo da se istražuje hronična bolest iscrpljivanja ili Creutzfeldt-Jakobova bolest, UIP400MTP olakšava studije velikih razmjera sa većom efikasnošću, omogućavajući istraživačima da ispune zahtjeve modernih dijagnostičkih i naučnih aplikacija.
Literatura / Reference
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Sonikator za mikroploče UIP400MTP za visokopropusni PMCA
Često Postavljena Pitanja
Šta su prioni?
Prioni su pogrešno savijeni proteini koji mogu izazvati abnormalno savijanje normalnih, ćelijskih proteina, posebno u mozgu. Za razliku od bakterija ili virusa, prionima nedostaju nukleinske kiseline i razmnožavaju se putem samo-templatirajućeg mehanizma, što dovodi do progresivnih neurodegenerativnih bolesti kao što su Creutzfeldt-Jakobova bolest, goveđa spongiformna encefalopatija (bolest kravljeg ludila) i scrapie kod ovaca. Njihova otpornost na standardne procese sterilizacije naglašava njihovu jedinstvenu patogenost i predstavlja značajne izazove u medicinskim i istraživačkim okruženjima.
Šta je PMCA tehnika?
Ciklična amplifikacija pogrešno savijenog proteina (PMCA) je laboratorijska tehnika koja se koristi za amplifikaciju pogrešno savijenih prionskih proteina (PrP^Sc) in vitro. On oponaša pretvaranje normalnog ćelijskog prionskog proteina (PrP^C) u njegov pogrešno savijen infektivni oblik (PrP^Sc), što je znak prionskih bolesti. Proces uključuje cikluse inkubacije i ultrazvuka kako bi se ubrzala agregacija PrP^Sc, što ga čini moćnim alatom za otkrivanje niskih nivoa priona.
Šta pogrešno savijanje proteina uzrokuje Creutzfeldt Jakobovu bolest?
Creutzfeldt-Jakobova bolest (CJD) je uzrokovana pogrešnim savijanjem prionskog proteina (PrP). Normalna izoforma (PrPC) usvaja abnormalnu konformaciju bogatu β listovima (PrPSc) koji postaje infektivan, stvarajući amiloidne agregate u mozgu, što dovodi do neurodegeneracije.
Šta je ciklična amplifikacija infektivnih priona pogrešno savijanja proteina?
Ciklična amplifikacija sa pogrešno savijanjem proteina (PMCA) je metoda za pojačavanje infektivnog oblika priona (PrPSc) uzastopnim inkubiranjem normalnog PrPC sa malim količinama PrPSc. Tokom svakog ciklusa, PrPSc katalizuje pogrešno savijanje PrPC, i agregati fragmenata ultrazvuka, stvarajući više mjesta za zasijavanje. Ovo oponaša replikaciju priona in vivo i omogućava osjetljivu detekciju priona u biološkim uzorcima.
Šta uzrokuje pogrešno savijanje PrP-a?
PrP se pogrešno savija u patogeni PrPSc obrazac može pokrenuti:
- Spontano pogrešno savijanje kod sporadičnih prionskih bolesti.
- Genetske mutacije u PRNP genu (npr. porodične prionske bolesti).
- Izloženost infektivnom PrPSc putem kontaminirane hrane, medicinskih procedura ili drugih sredstava.
- Okolinski ili strukturni faktori kao što su pH, metalni joni ili kofaktori koji destabilizuju PrPC.
Šta je RT-QuIC test?
Konverzija izazvana potresom u realnom vremenu (RT-QuIC) je visoko osjetljiv dijagnostički test za prionske bolesti. Otkriva PrPSc pojačavajući njegovu sposobnost da konvertuje rekombinantni PrPC u pogrešno složene agregate. Test koristi detekciju formiranja amiloidnih fibrila na osnovu fluorescencije, što ga čini korisnim za dijagnosticiranje bolesti poput CJD u cerebrospinalnoj tekućini (CSF) ili drugim tkivima.
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi lab to industrijska veličina.