استخلاص البروتين بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نسيج الورم – بروتوكول

يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخلاص البروتين من نسيج الورم بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، تُطوّر سير عمل التحلل القياسي باليوريا وفق CPTAC بإضافة خطوة مضبوطة للمعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام مسبار أثناء تفكيك النسيج. واستنادًا إلى استراتيجية CPTAC المعتمدة لتحضير البروتيوم والبروتيوم الفوسفوري بتحليل معمّق، يُحسّن هذا التعديل تفكيك الخلايا والبنى تحت الخلوية، ويقلل لزوجة العينة، ويعزز تحرير البروتينات التي يصعب عادةً استخلاصها بالتحلل باليوريا وحده، ولا سيما البروتينات المرتبطة بالأغشية والبروتينات المرتبطة بـ DNA أو بالنواة. وفي الدراسة التي يستند إليها البروتوكول، زاد سير العمل المدعوم بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية من الكشف عن البروتينات والببتيدات الفوسفورية، مع الحفاظ على التوافق مع المراحل اللاحقة ضمن مسار التحليل وفق نهج CPTAC، وهي الهضم، والوسم بـ TMT، والتجزئة، وإثراء الببتيدات الفوسفورية، والتحليل بـ LC-MS/MS.

استخلاص البروتين بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نسيج الورم للتحليل البروتيومي والبروتيومي الفوسفوري المعمّق

جرى تحسين البروتوكول التالي لاستخلاص البروتينات من نسيج الورم المسحوق بالتبريد في محلول منظم للتحلل يحتوي على اليوريا بتركيز 8 M: تُحسّن خطوة إضافية للمعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام مسبار استخلاص فئات البروتينات التي يصعب استخلاصها، ولا سيما البروتينات المرتبطة بالأغشية والبروتينات المرتبطة بـ DNA أو بالنواة، قبل الهضم والتحليل اللاحق بـ LC-MS/MS. وفي الدراسة التي يستند إليها البروتوكول، التي أجراها Li et al. (2025)، زادت إضافة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من الكشف عن البروتينات المرتبطة بالأغشية والنواة، وأتاحت تغطية معمّقة لأكثر من >12,000 بروتين وأكثر من >25,000 ببتيد فوسفوري ضمن سير عملهم.

مجال تطبيق البروتوكول

استخدم هذا الإجراء مع:

• نسيج الورم المجمّد حديثًا والمسحوق بالتبريد
• رواسب الخلايا أو العينات البيولوجية الأخرى التي اعتُمد فيها بالفعل الاستخلاص باستخدام اليوريا
• مسارات عمل البروتيوميات الشاملة والبروتيوميات الفوسفورية التي تستخدم الهضم بالتربسين والوسم الاختياري بـ TMT

تذكر دراسة Li et al. (2025) أن سير العمل ينطبق أيضًا على أنواع أخرى من العينات، مثل الخطوط الخلوية والدم والبول، إلا أنه قد يلزم تحسينه بحسب نوع العينة.

سير عمل محسّن لتحضير العينات يتضمن خطوة للمعالجة بالموجات فوق الصوتية. يستند سير العمل المحسّن والتصميم التجريبي إلى بروتوكول CPTAC لتحضير العينات للتحليل البروتيومي الشامل والتحليل البروتيومي الفوسفوري.
الدراسة والمخطط: ©Li et al., 2025

مبدأ العمل

أضافت الدراسة الأصلية المعالجة بالموجات فوق الصوتية إلى سير عمل التحلل القياسي باليوريا وفق CPTAC، ووجدت تحسنًا في الكشف عن البروتينات المرتبطة بالأغشية والنوى. ويذكر المؤلفون أنه يجب ضبط معلمات المعالجة بالموجات فوق الصوتية بدقة وفق حجم العينة/تركيزها – باختيار حجم السونوترود والطاقة المُدخلة وتوقيت النبضات.

وعلى سبيل المثال، يعني ذلك بالنسبة إلى Hielscher UP200Ht وUP200St ما يلي:

• استخدام السعة ونمط التشغيل النبضي بوصفهما متغيرَي التحكم الرئيسيين
• الحفاظ على برودة العينات طوال العملية (أي على الثلج)
• البدء بإعدادات محافظة
• تحسين الإعدادات وفق صفاء العينة ودرجة حرارتها ومردود البروتين وجودة الببتيدات في المراحل اللاحقة

 
صُمّم طرازا أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية UP200Ht وUP200St من Hielscher، بقدرة 200 واط، لأحجام العينات الصغيرة والمتوسطة، مع إعدادات قابلة للضبط للسعة والنبضات؛ ويوفر كلا المجانسَين بالموجات فوق الصوتية تحكمًا رقميًا عبر شاشة لمس لضبط المعلمات بدقة، وتسجيلًا آليًا للبيانات، ومستشعرًا لدرجة الحرارة قابلًا للتوصيل، وتحكمًا عن بُعد، وإضاءة للعينة.
 

كواشف استخلاص البروتين بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية

المحلول المنظم للتحلل باليوريا

حضّره طازجًا مباشرةً قبل الاستخدام:

• يوريا بتركيز 8 M
• NaCl بتركيز 75 mM
• Tris بتركيز 50 mM، وpH 8.0
• EDTA بتركيز 1 mM
• أبروتينين بتركيز 2 µg/mL
• ليوبيبتين بتركيز 10 µg/mL
• PMSF بتركيز 1 mM
• NaF بتركيز 10 mM
• PUGNAc بتركيز 20 µM
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2، بنسبة 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3، بنسبة 1:100 (v/v)

يجب إذابة اليوريا تمامًا قبل إضافة المواد المضافة؛ وينبغي إضافة المثبطات مباشرةً قبل الاستخدام؛ ويجب إبقاء المحلول المنظم على الثلج؛ ويُوصى بالتحريك الدائري بدلًا من الخلط الدوامي العنيف بعد إضافة المواد المضافة.
 

كواشف إضافية:

• كواشف اختبار البروتين بطريقة BCA
• Tris-HCl بتركيز 50 mM، وpH 8.0
• DTT
• يودوأسيتاميد
• LysC
• تربسين
• حمض الفورميك
• كواشف TMT، عند استخدام البروتيوميات الكمية متعددة الإرسال
• كواشف IMAC، عند إجراء إثراء الببتيدات الفوسفورية

معدات استخلاص البروتين بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية

المعدات المطلوبة

اختيار المسبار الموصى به

للعينات التي يبلغ حجمها نحو 200–1000 µL، استخدم سونوترود صغير القطر مناسبًا للمعالجة المباشرة عالية الشدة للأحجام الصغيرة. توفر Hielscher أقطارًا متعددة للسونوترود، وتوفر الأقطار الأصغر للطرف شدة أعلى عند الطرف.

ملاحظة عملية: استخدم أصغر مسبار يحقق خلطًا فعّالًا دون تكوّن رغوة مفرطة أو ملامسة جدار الوعاء.

إذا كنت تعمل على عينات متعددة في الوقت نفسه، فيمكنك النظر في استخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية متعدد الأنابيب VialTweeter أو جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP!

تعليمات خطوة بخطوة: إجراء استخلاص البروتين بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية

A. التبريد المسبق والتحضير

1. برّد جهاز الطرد المركزي إلى 4°C.
2. حضّر محلولًا منظمًا طازجًا للتحلل باليوريا وأبقِه على الثلج.
3. ثبّت UP200Ht أو UP200St على حامل داخل حاوية عازلة للصوت.
4. حضّر حمامًا ثلجيًا كبيرًا بما يكفي لإبقاء أنابيب العينات قائمة وثابتة.

يُعد تحضير المحلول المنظم طازجًا والحفاظ على البرودة أثناء التعامل مع العينات أمرين بالغَي الأهمية.

B. الاستخلاص الأولي باليوريا

1. أبقِ النسيج المسحوق بالتبريد على الثلج.
2. أضف 200 µL من المحلول المنظم المبرّد للتحلل باليوريا لكل 50 mg من النسيج الرطب.
3. اخلط بالخلاط الدوامي لمدة 5–10 s بسرعة عالية.
4. احضن لمدة 15 min عند 4°C.
5. كرّر خطوة الخلط الدوامي ثم الحضانة مرة أخرى.
6. أجرِ الطرد المركزي عند 20,000g لمدة 10 min عند 4°C.
7. انقل المُحلَّل/السائل الطافي إلى أنبوب نظيف منخفض الارتباط.

C. المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام UP200Ht أو UP200St

الشروط الابتدائية للمعالجة بالموجات فوق الصوتية

• السعة: ابدأ عند 20–30%
• مدة النبضة: 5 s في حالة التشغيل
• التبريد: 2 min على الثلج بين النبضات
• عدد الدورات: 4 دورات
• إجمالي زمن المعالجة الفعلي بالموجات فوق الصوتية: 20 s
• إجمالي زمن العملية بما يشمل التبريد: نحو 8–10 min

خطوات المعالجة بالموجات فوق الصوتية

1. انقل المُحلَّل إلى أنبوب مناسب للمعالجة بالموجات فوق الصوتية. استخدم أنبوبًا ضيقًا رقيق الجدار يتيح تبادلًا حراريًا جيدًا وغمرًا آمنًا للمسبار.
2. ضع الأنبوب في حمام ثلجي. تحدد الورقة البحثية التبريد أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية بوصفه أمرًا بالغ الأهمية لمنع الضرر الحراري.
3. اغمر طرف المسبار في العينة. أبقِ الطرف مغمورًا بعمق كافٍ لتحقيق تجويف مستقر، لكن لا تدعه يلامس جدار الأنبوب أو قاعه.
4. شغّل نبضة واحدة مدتها 5 s عند السعة الابتدائية.
5. أعِد العينة فورًا بالكامل إلى الثلج لمدة 2 min.
6. كرّر حتى تكتمل 4 دورات.
7. افحص المُحلَّل بعد الدورة.
8. واصل فقط عند الحاجة، باستخدام نبضة إضافية واحدة مدتها 5 s في كل مرة، يتبعها دائمًا تبريد كامل.
9. توقف بمجرد أن يصبح المُحلَّل أكثر تجانسًا وأقل خيطيةً/لزوجةً.
   تتمثل نقطة النهاية في مُحلَّل أكثر شفوفًا يشكّل قطرات بدلًا من تدفق لزج متواصل.
10. أجرِ الطرد المركزي عند نحو 16,000g لمدة 15 min عند 4°C.
11. انقل السائل الطافي المُروَّق إلى أنبوب جديد وقِس تركيز البروتين.

مقارنة البروتيوميات الشاملة والبروتيوميات الفوسفورية بين العينات المعالجة وغير المعالجة بالموجات فوق الصوتية.
a. عدد البروتينات التي جرى تحديدها (البروتيوميات الشاملة) في جميع أنسجة أورام PDX مع المعالجة بالموجات فوق الصوتية أو بدونها. b. عدد الببتيدات الفوسفورية التي جرى تحديدها (الإثراء باستخدام IMAC) في جميع أنسجة أورام PDX مع المعالجة بالموجات فوق الصوتية أو بدونها. اقتصر العدّ على البروتينات والببتيدات الفوسفورية التي كانت نسبة وفرتها أكبر من المئين 25 أو مساوية له. حُسبت نسبة الوفرة بين عينات من الأنواع نفسها.
الدراسة والرسوم البيانية: ©Li et al., 2025

الهضم والتحليل اللاحقان

بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية والترويق، تابع كما هو موصوف في سير العمل الأصلي وفق نهج CPTAC:

1. خفّف المُحلَّل بنسبة 1:3 (v/v) باستخدام Tris-HCl بتركيز 50 mM وpH 8.0 لتقليل تركيز اليوريا إلى <2 M.
2. أضف LysC بمقدار 1 mAU لكل 50 µg من البروتين، واحضن لمدة 2 h عند 25°C.
3. أضف التربسين بنسبة إنزيم:ركيزة تبلغ 1:49 (w/w)، وأجرِ الهضم طوال الليل عند 25°C.
4. أوقف التفاعل بإضافة حمض الفورميك إلى تركيز نهائي قدره 1%.
5. تابع إزالة الأملاح والوسم بـ TMT والتجزئة وإثراء الببتيدات الفوسفورية والتحليل بـ LC-MS/MS بحسب الحاجة.

التعبير التفاضلي للببتيدات الفوسفورية وفق قياس الطيف الكتلي (MS) باستخدام الوسم بـ TMT.
a. النمط الفرعي القاعدي، مع إبراز بعض الببتيدات الفوسفورية البشرية (بداية protein-sequence ونهايته) التي ازداد تعبيرها في العينات المعالجة بالموجات فوق الصوتية مقارنةً بالعينات غير المعالجة بالموجات فوق الصوتية. b. النمط الفرعي اللمعي، مع إبراز بعض الببتيدات الفوسفورية البشرية (بداية protein_sequence ونهايته) التي ازداد تعبيرها في العينات المعالجة بالموجات فوق الصوتية مقارنةً بالعينات غير المعالجة بالموجات فوق الصوتية. c. مسارات KEGG المُثرَاة استنادًا إلى بروتينات الببتيدات الفوسفورية التي ازداد تعبيرها في النمط الفرعي القاعدي للأورام المعالَج بالموجات فوق الصوتية. d. مسارات KEGG المُثرَاة استنادًا إلى بروتينات الببتيدات الفوسفورية التي ازداد تعبيرها في النمط الفرعي اللمعي للأورام المعالَج بالموجات فوق الصوتية.
الدراسة والرسوم البيانية: ©Li et al., 2025

التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صُنعت في ألمانيا

تشتهر أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher بأعلى معايير الجودة والتصميم. وتتيح المتانة وسهولة التشغيل دمج أجهزتنا للمعالجة بالموجات فوق الصوتية بسلاسة في المنشآت الصناعية. وتتعامل أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher بسهولة مع الظروف القاسية والبيئات ذات المتطلبات الصعبة.

Hielscher Ultrasonics شركة حاصلة على شهادة ISO، وتولي اهتمامًا خاصًا بأجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. وبالطبع، تتوافق أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher مع CE وتستوفي متطلبات UL وCSA وRoHs.

المؤلفات / المراجع

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.