استخلاص البروتين من أنسجة الورم بمساعدة الصوتيات – بروتوكول

يصف هذا البروتوكول طريقة استخلاص البروتين بمساعدة الصوتيات لأنسجة الأورام التي تعمل على تطوير سير عمل تحلل اليوريا القياسي CPTAC عن طريق إضافة خطوة صوتنة مسبار محكومة أثناء تمزيق الأنسجة. واستنادًا إلى استراتيجية إعداد البروتينات والبروتينات الفوسفوبروتينية على نطاق واسع في CPTAC، يعمل هذا التعديل على تحسين تمزيق بنية الخلية والبنية تحت الخلوية، ويقلل من لزوجة العينة، ويعزز إطلاق البروتينات التي يصعب عادةً استعادتها باستخدام تحلل اليوريا وحده، خاصةً البروتينات المرتبطة بالأغشية والبروتينات المرتبطة بالحمض النووي أو النواة. في الدراسة الأساسية، أدى سير العمل بمساعدة الصوتنة إلى زيادة الكشف عن كل من البروتينات والفوسفوبيبتيدات الفوسفورية مع الحفاظ على التوافق مع عملية الهضم على غرار CPTAC، ووضع العلامات TMT، والتجزئة، وإثراء الفوسفوبيبتيد، وخط أنابيب تحليل LC-MS/MS.

استخراج البروتين بمساعدة الصوتيات من أنسجة الورم للتحليل البروتيني العميق وتحليل البروتينات الفوسفوبروتينية

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

مجال تطبيق البروتوكول

استخدم هذا الإجراء من أجل:

• أنسجة الورم الطازجة المجمدة والمجمدة بالتبريد
• كريات الخلايا أو العينات البيولوجية الأخرى حيث تم بالفعل استخلاص اليوريا من اليوريا
• سير عمل علم البروتيوميات العالمية وعلم البروتينات الفوسفاتية باستخدام الهضم التجريبي ووضع العلامات الاختيارية على البروتينات الفوسفاتية

تشير الدراسة التي أجراها لي وآخرون (2025) إلى أن سير العمل قابل للتطبيق أيضًا على أنواع العينات الأخرى مثل خطوط الخلايا والدم والبول، ولكن قد يتطلب الأمر تحسينه حسب نوع العينة.

سير العمل المحسّن لتحضير العينة مع تنفيذ خطوة الصوتيات. يعتمد سير العمل المحسّن والتصميم التجريبي على بروتوكول إعداد عينة CPTAC للتحليل البروتيني والفوسفوبروتيني العالمي.
الدراسة والمخطط: ©لي وآخرون، 2025

مبدأ العمل

أضافت الدراسة الأصلية الصوتنة إلى سير عمل تحلل اليوريا القياسي CPTAC ووجدت تحسنًا في الكشف عن البروتينات المرتبطة بالأغشية والنوى. ذكر المؤلفون أنه يجب ضبط معلمات الصوتيات بدقة فيما يتعلق بحجم/تركيز العينة – عن طريق اختيار حجم القطب الصوتي، ومدخلات الطاقة، وتوقيت النبض.

على سبيل المثال، بالنسبة إلى HIELSCHER UP200Ht و UP200St، يعني ذلك:

• استخدام السعة ووضع النبض كمتغيرات تحكم رئيسية
• الحفاظ على العينات باردة طوال الوقت (أي في الثلج)
• البدء بإعدادات متحفظة
• التحسين مقابل نقاء العينة، ودرجة الحرارة، وإنتاجية البروتين، وجودة الببتيد في المرحلة النهائية

 
تم تصميم كلا الطرازين Hielscher 200 واط من مجانس الموجات فوق الصوتية UP200Ht و UP200St لأحجام العينات الصغيرة والمتوسطة، مع إعدادات سعة ونبضات قابلة للتعديل؛ يوفر كلا المجانسين بالموجات فوق الصوتية تحكم رقمي بشاشة لمس لضبط المعلمات بدقة وتسجيل البيانات آليًا ومستشعر درجة حرارة قابل للتوصيل وجهاز تحكم عن بعد وإضاءة للعينة.
 

كواشف استخلاص البروتين بمساعدة الصوتيات

مخفف تحلل اليوريا العازل

يُحضّر طازجاً مباشرةً قبل الاستخدام:

• 8 م يوريا
• 75 ملي مولار من كلوريد الصوديوم (NaCl)
• 50 مليمتر ملي مولار تريس، أس هيدروجيني 8.0
• 1 مليمتر ملي مولار EDTA
• 2 ميكروغرام/ملل من الأبروتينين
• لوبيبتين 10 ميكروغرام/ملليتر
• 1 ملي ملي مولار فلوريد متعدد البروتينات
• 10 ملي مولار فلوريد الصوديوم الصوديوم
• 20 ميكرومتر ميكرومتر بوجناك
• كوكتيل مثبط الفوسفاتيز 2، 1:100 (v/v)
• كوكتيل مثبط الفوسفاتيز 3، 1:100 (v/v)

يجب إذابة اليوريا بالكامل قبل إضافة المواد المضافة؛ يجب إضافة المثبطات مباشرةً قبل الاستخدام؛ يجب حفظ المخزن المؤقت في الثلج؛ ويوصى بالدوران بدلاً من الدوامة القوية بعد إضافة المواد المضافة.
 

كواشف إضافية:

• كواشف مقايسة البروتين BCA
• 50 مليمتر ميلي موليتر تريز-كلوريد، أس هيدروجيني 8.0
• DTT
• يودوأسيتاميد الأسيتاميد
• ليسك
• التربسين
• حمض الفورميك
• كواشف TMT، في حالة استخدام البروتيوميات الكمية المتعددة الإرسال
• كواشف IMAC، في حالة إجراء تخصيب الفوسفوببتيد الفوسفوبيبتيد

معدات استخلاص البروتين بمساعدة الصوتيات

مطلوب

اختيار المسبار الموصى به

بالنسبة للعينات التي يتراوح قطرها بين 200 و1000 ميكرولتر، استخدم سونوترود صغير القطر مناسب للمعالجة المباشرة عالية الكثافة للأحجام الصغيرة. تقدم Hielscher أقطار سونوترود متعددة، وتوفر أقطار الأطراف الأصغر كثافة أعلى عند الطرف.

ملاحظة عملية: استخدم أصغر مسبار يعطي خلطًا فعالاً دون رغوة مفرطة أو تلامس مع جدار الوعاء.

إذا كنت تعمل مع عينات متعددة في نفس الوقت، يمكنك التفكير في مكبر الصوت متعدد الأنبوب الصوتي متعدد الأنبوب أو جهاز صوتيات الصفيحة المجهرية UIP400MTP

إرشادات خطوة بخطوة: إجراء استخلاص البروتين بمساعدة الصوتيات

A. التبريد المسبق والتحضير

1. برد جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
2. تحضير مخفف تحلل اليوريا العازل الطازج والاحتفاظ به في الثلج.
3. قم بإعداد UP200Ht أو UP200St على حامل داخل حاوية صوت.
4. إعداد حمام ثلج كبير بما يكفي لحمل أنابيب العينة في وضع مستقيم وثابت.

يعد تحضير المخزن المؤقت الطازج والمناولة الباردة أمرًا بالغ الأهمية.

B. الاستخلاص الأولي لليوريا

1. احتفظ بالأنسجة المبردة في الثلج.
2. أضف 200 ميكرولتر من سائل تحلل اليوريا المبرد لكل 50 مجم من الأنسجة الرطبة.
3. دوامة 5-10 ق بسرعة عالية.
4. يُحضن لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
5. كرر خطوة الاحتضان مع الدوامة مرة أخرى.
6. الطرد المركزي عند 20,000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. انقل المادة المحللة/السائل المائع إلى أنبوب نظيف منخفض الربط.

C. سونيكيشن باستخدام UP200Ht أو UP200St

شروط بدء التشغيل بالصوتنة

• السعة: تبدأ من 20-30%
• طول النبضة: 5 ثوانٍ في وضع التشغيل
• التبريد: 2 دقيقة على الثلج بين النبضات
• عدد الدورات: 4 دورات
• إجمالي وقت الصوتيات النشط: 20 ثانية
• إجمالي وقت العملية بما في ذلك التبريد: حوالي 8-10 دقائق

خطوات الصوتيات

1. نقل المحلّل إلى أنبوب مناسب للصوتنة. استخدم أنبوباً ضيقاً ورفيع الجدران يسمح بتبادل حراري جيد وغمر المجس بأمان.
2. ضع الأنبوب في حمام ثلج. تحدد الورقة البحثية التبريد أثناء عملية الصوتيات على أنه أمر بالغ الأهمية لمنع التلف الناتج عن الحرارة.
3. اغمر طرف المجس في العينة. أبقِ الطرف مغمورًا بشكل كافٍ لتحقيق تجويف مستقر، ولكن لا تدعه يلمس جدار الأنبوب أو قاعه.
4. قم بتشغيل نبضة واحدة مدتها 5 ثوانٍ عند سعة البداية.
5. أعد العينة على الفور إلى الثلج بالكامل لمدة دقيقتين.
6. كرر حتى تكتمل 4 دورات.
7. فحص المحلول بعد الدورة.
8. استمر فقط عند الحاجة، باستخدام نبضة واحدة إضافية مدتها 5 ثوانٍ في كل مرة، متبوعة دائماً بالتبريد الكامل.
9. توقف بمجرد أن تصبح المادة المحللة أكثر اتساقًا وأقل لزوجة/لزوجة.
   تكون نقطة النهاية عبارة عن محلول أكثر شفافية يشكل قطرات بدلاً من التدفق اللزج المستمر.
10. الطرد المركزي عند حوالي 16,000 جم لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
11. نقل المادة الطافية المصفاة إلى أنبوب جديد وقياس تركيز البروتين.

مقارنة بين البروتيوميات العالمية والبروتيوميات الفوسفورية بين العينات الصوتية وغير الصوتية.
a. عدد البروتينات المحددة (البروتيوميات العالمية) في جميع أنسجة ورم PDX مع أو بدون صوتنة. ب. عدد الفوسفوبيبتيدات الفوسفورية المحددة (تخصيب IMAC) في جميع أنسجة ورم PDX مع أو بدون صوتنة. تم احتساب البروتينات والفوسفوببتيدات الفوسفورية فقط مع نسبة وفرة أكبر من أو تساوي النسبة المئوية الخامسة والعشرين. تم حساب نسبة الوفرة بين نفس أنواع العينات.
دراسة ورسوم بيانية: ©لي وآخرون، 2025

الهضم والتحليل النهائي

بعد إجراء الصوتيات والتوضيح، تابع العمل كما هو موضح في سير العمل الأصلي على غرار CPTAC:

1. تمييع المحلّل بنسبة 1:3 (v/v) مع 50 ملي مولار ملي موليتر من تريس-كلوريد الهيدروجين 8.0 لتقليل اليوريا إلى <2 M.
2. يُضاف LysC بمعدل 1 مللي أمبير لكل 50 ميكروغرام من البروتين ويُحضن لمدة ساعتين عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
3. يُضاف التربسين بنسبة 1:49 إنزيم:49 (إنزيم/وزن/ثانية) ويُهضم طوال الليل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
4. إخماد بحمض الفورميك حتى 1% نهائي.
5. الاستمرار في إزالة التحلية، ووضع علامات TMT، والتجزئة، وإثراء الفوسفوببتيد، و LC-MS/MS حسب الحاجة.

التعبير التفاضلي للفسفوببتيدات الفسفورية من التصلب المتعدد الموسوم بـ TMT.
a. النمط الفرعي القاعدي، مع تسليط الضوء على بعض بروتينات الفوسفوبيبتيدات البشرية (بداية ونهاية تسلسل البروتين) التي تم تنظيمها في العينات المصوتة مقارنة بالعينات غير المصوتة. ب. النمط الفرعي اللمبي، مع تسليط الضوء على بعض بروتينات الفوسفوبيبتيدات البشرية (بداية ونهاية تسلسل البروتين) التي تم تنظيمها في العينات المصوتة مقارنة بالعينات غير المصوتة. ج. مسارات KEGG الغنية استنادًا إلى بروتينات الفوسفوببتيدات الفوسفورية المنظمة في النوع الفرعي القاعدي للأورام المعالجة بالموجات الصوتية. د. مسارات KEGG الغنية استنادًا إلى بروتينات الفوسفوببتيدات الفوسفورية المنظمة في النوع الفرعي اللمعي للأورام المعالجة بالموجات الصوتية.
دراسة ورسوم بيانية: ©لي وآخرون، 2025

التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صنع في ألمانيا

Hielscher الموجات فوق الصوتية معروفة جيدا لأعلى معايير الجودة والتصميم. المتانة والتشغيل السهل تسمح بالتكامل السلس للموجات فوق الصوتية لدينا في المنشآت الصناعية. يتم التعامل بسهولة مع الظروف القاسية والبيئات الصعبة بواسطة الموجات فوق الصوتية Hielscher.

Hielscher Ultrasonics هي شركة حاصلة على شهادة الأيزو وتركز بشكل خاص على الموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. بطبيعة الحال، الموجات فوق الصوتية Hielscher هي CE المتوافقة وتلبية متطلبات UL، وكالة الفضاء الكندية وبنفايات.

الأدب / المراجع