سير العمل في علم البروتيوميات مع هضم البروتينات بمعدل معالجة مرتفع للعينات

يُعدّ علم البروتيوميات مجالًا أساسيًا لفهم العمليات والنظم البيولوجية، ويشكّل هضم البروتينات خطوة حاسمة في سير العمل فيه. تقليديًا، يُجرى هضم البروتينات في محلول باستخدام إنزيمات محلِّلة للبروتينات مثل التربسين، الذي يحلّل مائيًا الروابط الببتيدية تحديدًا عند بقايا الليسين والأرجينين. تُنتج هذه العملية ببتيدات مناسبة تمامًا للتأين والتجزئة في تطبيقات مطيافية الكتلة (MS). غير أن طرق الهضم التقليدية تتطلب 12–24 ساعة لاكتمالها، مما يخلق اختناقات كبيرة في سير العمل في علم البروتيوميات.
توفّر المعالجة بالموجات فوق الصوتية بديلًا قويًا، إذ تقلّص أزمنة الهضم بدرجة كبيرة من ساعات إلى بضع دقائق فقط. وعند دمجها مع أجهزة معالجة متقدمة بالموجات فوق الصوتية لعينات متعددة، مثل Hielscher CupHorn وVialTweeter وجهاز معالجة الصفائح ذات 96 بئرًا بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP، تتيح المعالجة بالموجات فوق الصوتية تسريع العمل في علم البروتيوميات ورفع معدل معالجة العينات. تُبسّط هذه التقنيات سير العمل، وتقلّل زمن تحضير العينات وتزيد الكفاءة دون المساس بقابلية تكرار النتائج أو جودة البيانات.

دور الطاقة فوق الصوتية في هضم البروتينات

تستخدم المعالجة بالموجات فوق الصوتية موجات فوق صوتية مركّزة لإحداث التجويف – وهو تكوّن فقاعات مجهرية موضعية تنهار لتولّد قوى قص شديدة. تعزّز هذه الظاهرة انتقال الكتلة، وتساعد على مزج الإنزيمات بالركائز، وتفرد البنى البروتينية، مما يكشف مواقع الشطر للإنزيمات المحلِّلة للبروتينات مثل التربسين.
ما النتيجة؟ انخفاض كبير في زمن الهضم دون المساس بالكفاءة أو قابلية تكرار النتائج.

الهضم البروتيني المعزَّز بالموجات فوق الصوتية: المنهجية والنتائج

بروتوكول الهضم المسرَّع

يجمع الهضم بمساعدة الموجات فوق الصوتية بين الإنزيمات المحلِّلة للبروتينات والطاقة فوق الصوتية لتسريع سير العمل. على سبيل المثال، عند استخدام Hielscher UP200St-CupHorn ‏(200 W, 26 kHz)، يسير عمل الهضم على النحو التالي:

1. الاختزال: تُعالَج عينات البروتين (0.5 mg/mL, 20 µL) باستخدام DTT ‏(2 µL, 110 mM) في محلول منظِّم من بيكربونات الأمونيوم (12.5 mM). تُطبَّق المعالجة بالموجات فوق الصوتية بسعة 50% لمدة 5 دقائق.
2. الألكلة: بعد إضافة IAA ‏(2 µL, 400 mM)، تُكرَّر المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الظروف نفسها.
3. الهضم: تُخفَّف العينات وتُحضَن مع جسيمات نانوية تحمل تربسينًا مثبَّتًا. تُكمل جولة أخيرة من المعالجة بالموجات فوق الصوتية (5 دقائق) عملية الهضم. تُفصل الببتيدات وتُجفَّف وتُخزَّن لتحليلها باستخدام MS.

تقلّل هذه الطريقة بالموجات فوق الصوتية الزمن الإجمالي للتحضير من 12 ساعة إلى أقل من 30 دقيقة. وعلى الرغم من تسريع العملية، تظل حصيلة الببتيدات وجودتها متوافقتين مع الطرق التقليدية التي تستغرق ليلة كاملة.

كفاءة هضم البروتينات بالموجات فوق الصوتية

في دراسات مقارنة باستخدام بروتيومات E. coli:

• تحديد هوية البروتينات: أتاح تحليل العينات المهضومة بالموجات فوق الصوتية تحديد هوية 777 بروتينًا خلال 5 دقائق، مقارنةً بـ817 خلال 12 ساعة. وتجاوزت نسبة البروتينات التي حُدّدت هويتها بالطريقتين 70%.
• قابلية تكرار النتائج: أظهرت التحليلات المكرَّرة قيم ارتباط تتجاوز 98% ضمن كل طريقة، مما يدل على الموثوقية.
• الانتقائية: هُضمت بروتينات معينة بصورة تفضيلية بكل طريقة، إذ فضّل الهضم بالموجات فوق الصوتية 65 بروتينًا، بينما فضّل الهضم طوال الليل 54 بروتينًا. وتُبرز هذه الفروق الدقيقة الإمكانات الفريدة للمعالجة بالموجات فوق الصوتية في تطبيقات محددة.

نتائج القياس الكمي للبروتينات دون وسم لسبعة بروتينات أُضيفت إلى عينة من E. coli
. أُضيفت البروتينات التالية بمستويين مختلفين كما هو مبيَّن في العمود
المسمّى “Theo Ratio”. وتمثّل Theo Ratio النسبة النظرية بين المستويين المستخدمين في هذه
التجربة. ألبومين مصل الأبقار (ALBU)، وβ-لاكتوغلوبولين (LACB)، وكازين α-S1 ‏(CASA1)،
وكازين α-S2 ‏(CASA2)، وسيتوكروم c ‏(CYC)، وألبومين البيض (OVAL)، والأنهيدراز الكربوني 2
(CAH2). حُسبت النسب باستخدام شدّات إشارات البروتينات في القياس الكمي دون وسم LFQ، المستخلصة من تحليل MaxQuant
. طُبّق اختبار t لستيودنت لمقارنة القيم التي تم الحصول عليها بكل طريقة (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
الدراسة والرسم البياني: © Martins et al., 2019)

التربسين المثبَّت على جسيمات نانوية

يُحسّن دمج الجسيمات النانوية التي تحمل تربسينًا مثبَّتًا (مثل T-FMNPs) مع المعالجة بالموجات فوق الصوتية سير العمل في علم البروتيوميات بدرجة أكبر. توفّر هذه الجسيمات النانوية مساحة سطح كبيرة لتفاعلات الإنزيمات مع الركائز، مما يزيد الكفاءة. وعند تطبيق الطريقة المدمجة على بروتيومات معقدة، مثل بروتيوم E. coli، فإنها تحقق:

• السرعة: هضمٌ كاملٌ خلال 5 دقائق.
• الدقة: قياسٌ كميٌّ للبروتينات قابلٌ للمقارنة مع الطرق التقليدية (p > 0.01, n=3).
• قابلية التوسّع: يتيح تكييف الطريقة مع منصات متعددة الآبار مثل UIP400MTP معالجة العينات بمعدل مرتفع.

انقر هنا للاطلاع على البروتوكول المفصّل مع تعليمات خطوة بخطوة!
(راجع Martins et al., 2019)

هضم بروتيني بسرعة عالية ومعدل معالجة مرتفع للعينات باستخدام أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية

أفضل طرازات أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية لعلم البروتيوميات

تقدّم Hielscher Ultrasonics طرازات متنوعة من أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية لتحضير عينات متعددة في وقت واحد، مما يسهّل سير العمل بمعدل معالجة مرتفع للعينات. سواء كنت تعمل باستخدام قوارير أو أنابيب اختبار أو صفائح متعددة الآبار (مثل صفائح ذات 6 أو 24 أو 96 بئرًا) أو أطباق بتري – فإننا نقدّم لك أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية المثالية لتجاربك.

جهاز معالجة الصفائح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP

لتحقيق أعلى معدل لمعالجة العينات، يوفّر UIP400MTP إمكانية معالجة الصفائح ذات 96 بئرًا بالموجات فوق الصوتية. ويتوافق UIP400MTP مع أي صفيحة دقيقة قياسية، ولا يتطلب مستلزمات استهلاكية باهظة الثمن خاصة بالشركة المصنّعة، ويمنحك حرية اختيار أفضل صفيحة متعددة الآبار لأبحاثك. ومن خلال توزيع الطاقة بصورة متجانسة على الصفيحة، يتيح اختزال وألكلة وهضم ما يصل إلى 200 بروتيوم معقد بسرعة خلال 1 ساعة فقط. ويُعدّ هذا المستوى من الأتمتة والكفاءة ضروريًا لعلم البروتيوميات ذي معدل المعالجة المرتفع للعينات وللتطبيقات السريرية. تعرّف على المزيد عن جهاز معالجة الصفائح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية!

VialTweeter

صُمّم VialTweeter للمختبرات التي تتطلب المعالجة المتزامنة بالموجات فوق الصوتية لما يصل إلى 10 قوارير أو أنابيب اختبار. ويزيل نهجه غير التداخلي مخاطر التلوث المتبادل مع ضمان هضم البروتينات بصورة قابلة للتكرار. ويُعدّ هذا الجهاز مثاليًا للباحثين الذين يعملون بأحجام محدودة من العينات أو بأنواع متنوعة منها.
تعرّف على المزيد عن جهاز معالجة أنابيب متعددة بالموجات فوق الصوتية VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية CupHorn هو جهاز قوي مصمَّم لمعالجة عينات متعددة في وقت واحد داخل حاويات محكمة الإغلاق. ويضمن توزيعًا متجانسًا للطاقة فوق الصوتية وتحكمًا دقيقًا في درجة الحرارة. وتجعل قدرته على معالجة ما يصل إلى خمس عينات في وقت واحد، إلى جانب توافقه مع سير العمل الذي يشمل الاختزال والألكلة والهضم، من CupHorn أداة موثوقة لعلم البروتيوميات القائم على MS.
تعرّف على المزيد عن CupHorn SonoReactor!

بروتوكول خطوة بخطوة للهضم البروتيني بمساعدة الموجات فوق الصوتية باستخدام التربسين المثبَّت على جسيمات نانوية

حُسّن هذا البروتوكول الذي وضعه Martins et al. (2019) لهضم البروتينات بسرعة باستخدام الطاقة فوق الصوتية والتربسين المثبَّت على جسيمات نانوية (T-FMNPs). وتضمن الخطوات الموضَّحة اختزالًا وألكلة وتحلّلًا بروتينيًا بكفاءة تناسب تطبيقات مطيافية الكتلة (MS).
خطوات البروتوكول

1. اختزال روابط ثنائي الكبريتيد
   • أضف 2 µL من محلول DTT ‏(110 mM) إلى عينة البروتين البالغ حجمها 20 µL وتركيزها (0.5 mg/mL) في المحلول المنظِّم AmBic.
   • ضع أنبوب العينة في المفاعل الصوتي UP200St-CupHorn.
   • عالِج العينة بالموجات فوق الصوتية لمدة 2.5 دقيقة بسعة 50% ‏(200 W, 26 kHz).
   • توقّف لفترة قصيرة للسماح بالتبريد، ثم عالِج بالموجات فوق الصوتية لمدة 2.5 دقيقة أخرى في الظروف نفسها.
2. ألكلة بقايا السيستئين المختزَلة
   • أضف 2 µL من محلول IAA ‏(400 mM) إلى عينة البروتين المختزَلة.
   • عالِج بالموجات فوق الصوتية لمدة 2.5 دقيقة بسعة 50% لتسهيل الألكلة.
   • توقّف للسماح بالتبريد، ثم عالِج بالموجات فوق الصوتية لمدة 2.5 دقيقة إضافية.

   ملاحظة: قلّل تعرّض العينة المؤلكَلة للضوء إلى أدنى حد لمنع تحلّل IAA.

3. تخفيف العينة
   • خفّف عينة البروتين المؤلكَلة إلى حجم نهائي قدره 100 µL باستخدام المحلول المنظِّم AmBic بتركيز 25 mM، المحتوي على 4% أسيتونتريل (v/v).
   • امزج جيدًا بالسحب والدفع برفق باستخدام الماصّة.
4. الهضم البروتيني باستخدام التربسين المثبَّت على جسيمات نانوية
   • أضف 20 µL من محلول T-FMNP ‏(3 mg/mL) إلى عينة البروتين المخفَّفة.
   • عالِج المزيج بالموجات فوق الصوتية في المفاعل الصوتي لمدة 2.5 دقيقة بسعة 50%.
   • توقّف للسماح بالتبريد، ثم عالِج بالموجات فوق الصوتية لمدة 2.5 دقيقة أخرى في الظروف نفسها.
5. فصل الجسيمات النانوية الحاملة للتربسين
   • استخدم مغناطيسًا لفصل T-FMNPs عن السائل الطافي المحتوي على الببتيدات الناتجة عن الهضم.
   • انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
6. تحضير الببتيدات لتحليل MS
   • جفّف السائل الطافي المحتوي على الببتيدات في جهاز طرد مركزي تحت التفريغ.
   • خزّن الببتيدات المجفَّفة عند -20°C إلى حين إجراء مزيد من التحليل بمطيافية الكتلة.