سير عمل البروتينات مع هضم البروتين عالي الإنتاجية

تعد البروتينات مجالا أساسيا لفهم العمليات والأنظمة البيولوجية ، حيث يشكل هضم البروتين خطوة حاسمة في سير عمله. تقليديا ، يتم هضم البروتين في محلول باستخدام إنزيمات تحلل البروتين مثل التربسين ، والتي تحلل روابط الببتيد على وجه التحديد في بقايا اللايسين والأرجينين. تولد هذه العملية ببتيدات مناسبة تماما للتأين والتجزئة في تطبيقات قياس الطيف الكتلي (MS). ومع ذلك ، تتطلب طرق الهضم التقليدية من 12 إلى 24 ساعة لتحقيق الاكتمال ، مما يخلق اختناقات كبيرة في سير العمل البروتيني.
يوفر الموجات فوق الصوتية بديلا قويا ، حيث يقلل بشكل كبير من أوقات الهضم من ساعات إلى بضع دقائق فقط. عند دمجها مع أجهزة الصوتنة متعددة العينات المتقدمة مثل Hielscher CupHorn و VialTweeter و 96 بئر لوحة سونيكاتور UIP400MTP ، تتيح الموجات فوق الصوتية البروتينات المتسارعة وعالية الإنتاجية. تعمل هذه التقنيات على تبسيط سير العمل، مما يقلل من وقت تحضير العينة ويزيد من الكفاءة دون المساس بقابلية التكرار أو جودة البيانات.

دور الطاقة بالموجات فوق الصوتية في هضم البروتين

تستخدم الموجات فوق الصوتية الموجات فوق الصوتية المركزة لإنشاء التجويف - فقاعات دقيقة موضعية تنهار لتوليد قوى قص مكثفة. تعزز هذه الظاهرة نقل الكتلة ، وتعزز خلط الإنزيمات مع الركائز ، وتكشف عن هياكل البروتين ، وتعريض مواقع الانقسام للإنزيمات المحللة للبروتين مثل التربسين.
النتيجة؟ تقليل كبير في وقت الهضم دون المساس بالكفاءة أو التكاثر.

الهضم المحلل للبروتين المعزز بالموجات فوق الصوتية: المنهجية والنتائج

بروتوكول الهضم المعجل

يجمع الهضم بمساعدة الموجات فوق الصوتية بين الإنزيمات المحللة للبروتين والطاقة فوق الصوتية لتسريع سير العمل. على سبيل المثال ، باستخدام Hielscher UP200St-CupHorn (200 واط ، 26 كيلو هرتز) ، يستمر سير عمل الهضم على النحو التالي:

1. التخفيض: يتم معالجة عينات البروتين (0.5 مجم / مل ، 20 ميكرولتر) ب DTT (2 ميكرولتر ، 110 ملليمتر) في مخزن بيكربونات الأمونيوم (12.5 ملليمتر). يتم تطبيق صوتنة بسعة 50٪ لمدة 5 دقائق.
2. الألكلة: بعد إضافة IAA (2 ميكرولتر ، 400 ملليمتر) ، يتم تكرار الصوتنة في نفس الظروف.
3. الهضم: يتم تخفيف العينات وتحضينها بجسيمات التربسين النانوية المجمدة. جولة أخيرة من الصوتنة (5 دقائق) تكمل عملية الهضم. يتم فصل الببتيدات وتجفيفها وتخزينها لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد.

تقلل طريقة الموجات فوق الصوتية هذه من إجمالي وقت التحضير من 12 ساعة إلى أقل من 30 دقيقة. على الرغم من العملية المتسارعة ، يظل محصول الببتيد وجودته متسقا مع الطرق التقليدية بين عشية وضحاها.

كفاءة هضم البروتين بالموجات فوق الصوتية

في الدراسات المقارنة باستخدام بكتريا قولونية البروتينات:

• تحديد البروتين: حددت العينات المهضومة بالموجات فوق الصوتية 777 بروتينا في 5 دقائق ، مقارنة ب 817 في 12 ساعة. تجاوزت تحديدات البروتين المشتركة 70٪.
• التكاثر: أظهرت التحليلات المكررة قيم ارتباط أعلى من 98٪ داخل كل طريقة ، مما يدل على الموثوقية.
• الانتقائيه: تم هضم بعض البروتينات بشكل تفضيلي بكل طريقة ، مع الهضم بالموجات فوق الصوتية لصالح 65 بروتينا والهضم بين عشية وضحاها 54 بروتينا. تؤكد هذه الاختلافات الدقيقة على الإمكانات الفريدة للموجات فوق الصوتية لتطبيقات محددة.

نتائج قياس البروتين الخالي من الملصقات لسبعة بروتينات مسننة في بكتريا قولونية
عينة. تمت إضافة البروتينات التالية على مستويين مختلفين كما هو مذكور في العمود
اسمه باسم "ثيو ريسب". Theo Ratio هي النسبة النظرية بين المستويين المستخدمين في هذا
التجربه. ألبومين مصل الأبقار (ALBU) ، β-لاكتوغلوبولين (LACB) ، α-S1 كازين (CASA1) ،
α-S2 الكازين (CASA2) والسيتوكروم ج (CYC) والأبويضالبومين (البيضاوي) وأنهيدراز الكربونيك 2
(CAH2). تم حساب النسب باستخدام شدة بروتين LFQ التي تم الحصول عليها من MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
الدراسة والرسم البياني: © Martins et al. ، 2019)

التربسين الثابت بالجسيمات النانوية

إن دمج جسيمات التربسين النانوية المجمدة (على سبيل المثال ، T-FMNPs) مع الموجات فوق الصوتية يعزز سير عمل البروتينات. توفر هذه الجسيمات النانوية مساحة سطح عالية لتفاعلات الإنزيم والركيزة ، مما يزيد من الكفاءة. عند تطبيقها على البروتينات المعقدة ، مثل الإشريكية القولونية ، تحقق الطريقة المدمجة:

• سرعة: الهضم الكامل في غضون 5 دقائق.
• دقة: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• قابلية التوسع: يتيح التكيف مع الأنظمة الأساسية متعددة الآبار مثل UIP400MTP معالجة عالية الإنتاجية.

انقر هنا للحصول على البروتوكول التفصيلي مع الإرشادات خطوة بخطوة!
(راجع مارتينز وآخرون ، 2019)

الهضم المحلل للبروتين بسرعة عالية وإنتاجية عالية مع أجهزة صوتنة Hielscher

أفضل موديلات Sonicator للبروتينات

تقدم Hielscher Ultrasonics نماذج صوتية مختلفة لإعداد عينات متعددة في وقت واحد مما يسهل سير العمل عالي الإنتاجية. سواء كنت تعمل مع قوارير أو أنابيب اختبار أو ألواح متعددة الآبار (على سبيل المثال أطباق 6 أو 24 أو 96 بئر) أو أطباق بتري – نحن نقدم لك أجهزة الصوتنة المثالية لتجاربك.

UIP400MTP سونيكاتير لوحة متعددة الآبار

للحصول على الإنتاجية القصوى ، يوفر UIP400MTP القدرة على معالجة 96 بئر من الألواح بالموجات فوق الصوتية. متوافق مع أي صفيحة دقيقة قياسية ، لا يتطلب UIP400MTP مستهلكات باهظة الثمن ويمنحك حرية اختيار أفضل لوحة متعددة الآبار لبحثك. من خلال توفير طاقة موحدة عبر اللوحة ، فإنه يتيح التقليل السريع ، والألكلة ، وهضم ما يصل إلى 200 بروتين معقد في ساعة واحدة فقط. يعد هذا المستوى من الأتمتة والكفاءة أمرا بالغ الأهمية للبروتينات عالية الإنتاجية والتطبيقات السريرية. تعرف على المزيد حول جهاز صوتي متعدد الآبار!

VialTweeter

تم تصميم VialTweeter للمختبرات التي تتطلب صوتنة متزامنة لما يصل إلى 10 قوارير أو أنابيب اختبار. نهجها غير الجراحي يزيل مخاطر التلوث المتبادل مع ضمان هضم البروتين القابل للتكرار. هذا الجهاز مثالي للباحثين الذين يعملون بأحجام عينات محدودة أو أنواع عينات متنوعة.
تعرف على المزيد حول جهاز الصوتنة متعدد الأنابيب VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

جهاز الصوتنة CupHorn هو جهاز قوي مصمم للمعالجة المتزامنة لعينات متعددة في حاويات محكمة الغلق. إنه يضمن توزيعا موحدا للطاقة بالموجات فوق الصوتية والتحكم الدقيق في درجة الحرارة. إن القدرة على معالجة ما يصل إلى خمس عينات في وقت واحد ، إلى جانب توافقها مع مهام سير العمل المخفضة والمؤلكلة والهضومة ، تجعل CupHorn أداة موثوقة للبروتينات القائمة على MS.
تعرف على المزيد حول CupHorn SonoReactor!

بروتوكول خطوة بخطوة للهضم المحلل للبروتين بمساعدة الموجات فوق الصوتية باستخدام التربسين الثابت بالجسيمات النانوية

تم تحسين هذا البروتوكول بواسطة Martins et al. (2019) للهضم السريع للبروتين باستخدام الطاقة فوق الصوتية والتربسين الثابت بالجسيمات النانوية (T-FMNPs). تضمن الخطوات الموضحة التخفيض الفعال والألكلة والتحلل البروتيني المناسب لتطبيقات قياس الطيف الكتلي (MS).
خطوات البروتوكول

1. الحد من روابط ثاني كبريتيد
   • أضف 2 ميكرولتر من محلول DTT (110 ملليمتر) إلى عينة البروتين 20 ميكرولتر (0.5 مجم / مل) في المخزن المؤقت AmBic.
   • ضع أنبوب العينة في مفاعل السونر UP200St-CupHorn.
   • قم بتقطيع العينة لمدة 2.5 دقيقة بسعة 50٪ (200 واط ، 26 كيلو هرتز).
   • توقف مؤقتا لفترة وجيزة للسماح بالتبريد ، ثم صوتنة لمدة 2.5 دقيقة أخرى في نفس الظروف.
2. ألكلة بقايا السيستين المخفضة
   • أضف 2 ميكرولتر من محلول IAA (400 ملم) إلى عينة البروتين المختزلة.
   • سونيكات لمدة 2.5 دقيقة بسعة 50٪ لتسهيل الألكلة.
   • توقف مؤقتا للتبريد ، ثم صوتنة لمدة 2.5 دقيقة إضافية.

   ملاحظة: تقليل تعرض العينة المؤلكلة للضوء لمنع تدهور IAA.

3. تخفيف العينة
   • قم بتخفيف عينة البروتين المؤلكل إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر باستخدام 25 ملي مولار AmBic يحتوي على 4٪ أسيتونيتريل (v / v).
   • تخلط جيدا عن طريق سحب العينة اللطيف.
4. الهضم المحلل للبروتين مع التربسين الثابت بالجسيمات النانوية
   • أضف 20 ميكرولتر من محلول T-FMNP (3 مجم / مل) إلى عينة البروتين المخفف.
   • قم بصوت الخليط في مفاعل الصوت لمدة 2.5 دقيقة بسعة 50٪.
   • توقف مؤقتا للتبريد ، ثم صوتنة لمدة 2.5 دقيقة أخرى في نفس الظروف.
5. فصل جسيمات التربسين النانوية
   • استخدم مغناطيسا لفصل T-FMNPs عن المادة الطافية التي تحتوي على الببتيدات المهضومة.
   • انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
6. تحضير الببتيد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد
   • جفف المادة الطافية المحتوية على الببتيدات في جهاز طرد مركزي مفرغ.
   • قم بتخزين الببتيدات المجففة عند -20 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل بواسطة قياس الطيف الكتلي.