بالموجات فوق الصوتية DNA قص

• أثناء قص الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي ، يتم تقسيم جزيئات الحمض النووي إلى قطع أصغر. الحمض النووي / RNA التجزئة هي واحدة من الخطوات الإعدادية عينة هامة المطلوبة لإنشاء مكتبات لتسلسل الجيل القادم (NGS).
• يستخدم الموجات فوق الصوتية DNA القص قوى التجويف الصوتية لكسر DNA أو RNA إلى قطع 100 – 5KB مضت.
• قص بالموجات فوق الصوتية يسمح للتجزئة DNA دقيقة والتأقلم مع طول DNA المطلوب.

القص الحمض النووي باستخدام Ultrasonication

تقدم HIELSCHER الفوق مختلف الحلول المستندة إلى بالموجات فوق الصوتية للDNA، RNA والقص لونين. الاختيار بين تحقيق نوع ultrasonicators (مثل UP100H) لصوتنة المباشر باستخدام microtip، أو استخدام VialTweeeter أو cuphorn بالموجات فوق الصوتية لإعداد DNA غير المباشر لعينات مختلفة في وقت واحد. تقدم HIELSCHER الجهاز المثالي النظر احتياجاتك: الطقس لديك 1 أو ما يصل إلى 10 العينات، كميات من ميكروليتر إلى مجلدات لتر – تتوفر لتلبية الاحتياجات الخاصة بك لإعداد DNA، RNA وشظايا لونين على طول الحق المعالجات بالموجات فوق الصوتية HIELSCHER. استنساخ، عملية سهلة ومراقبة دقيقة تسمح لمكتبة موثوقة للجيل المقبل من التسلسل.
وعلى النقيض من تجزئة DNA الأنزيمية، والقص بالموجات فوق الصوتية ينطبق قوى القص الميكانيكية البحتة دون إضافة أي مواد كيميائية. بواسطة الإعداد الدقيق لمعايير عملية، والقص بالموجات فوق الصوتية تنتج عالية الجزيئية شظايا الوزن الحمض النووي (البلازميد والحمض النووي الجيني).
الأحماض النووية النقاء يمكن تضخيمه قبل أو بعد خطوة التجزئة.
المعلمات صوتنة (السلطة، ودورة نبضة / رشقات نارية والوقت ودرجة الحرارة) يمكن التحكم بأمان عبر إعدادات البرنامج.

بروتوكولات بالموجات فوق الصوتية DNA قص

لونين مناعي الفحص

باختصار ، تم طلاء الخلايا بأطباق ذات قطر 60 مم (400،000 لكل طبق) وتم نقلها باستخدام RhoA siRNA (كما هو موصوف) ؛ بعد 72 ساعة ، تم تحضينها بالفورمالدهيد (التركيز النهائي ، 1 ٪) لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية لبروتينات الارتباط عبر الدنا. تم إخماد التفاعل المتصالب عن طريق إضافة الحجم العاشر من 1.25 مول / غليسرين ، مما يعطي تركيزًا نهائيًا قدره 125 ملي مول / لتر. تم غسل الخلايا مرتين مع PBS الجليد الباردة ، معلق في عازلة مقايسة radiimmunoprecipitation [150 ملي مول / لتر كلوريد الصوديوم ، 1 ٪ NP40 ، 0.5 ٪ deoxycholate ، 0.1 ٪ SDS ، 5 ​​ملمول / لتر EDTA ، 50 ملي مول / لتر Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.0 )] تحتوي على 1 مليمول / لتر phenylmethylsulfonyl فلوريد ، 1 Ag / mL aprotinin ، و 1 Ag / mL pepstatin A ، ويتم الاحتفاظ بها على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم ، كانت sysated خلية lysates على الجليد مع HIELSCHER UP200S تم المنفصمة حتى chromatins عبر ربط لانتاج شظايا الحمض النووي بين 200 و 1000 سنة مضت، الموجات فوق الصوتية sonicator (HIELSCHER الفوق GmbH ل3 × 40 ق، السعة 40٪، دورة 1). تم استخدام عشر المحللة كله ل quantitate كمية DNA الموجودة في عينات مختلفة واعتباره “إجمالي DNA المدخلات”. وحضنت Supernatants مع سمك السلمون الحيوانات المنوية DNA / البروتين الاغاروز 50٪ الطين للحد من خلفية غير محددة. وبعد ذلك يتم مناعي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 5 حج من P65 مكافحة NF-NB (ريف) أو بدون الأجسام المضادة (مراقبة سلبية). وتستكمل هذه supernatants مع 5 مول / لتر كلوريد الصوديوم وساخنة بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية للعودة البروتين DNA عبر الوصلات. تم علاج immunocomplexes مع مزيد من DNase- وخالية من ريبونوكلياز بروتين K، وتنقية الحمض النووي عن طريق الفينول / استخراج الكلوروفورم وهطول الأمطار الايثانول. وقد تم PCR مع الاشعال محددة المقابلة لتسلسل داخل منطقة المروج من الجينات iNOS البشري (P1 التمهيدي: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶، P2 التمهيدي: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier وآخرون، 2008)

دراسات EGFP التعبير عن

لدراسات التعبير، والمؤتلف سلالة L. tarentolae P10 :: F9Begfp1.4dBsat رقم 12 (جينا العلوم البيولوجية، ألمانيا) مع جين EGFP (تعزيز البروتين الفلوري الأخضر)، وسو الكروموسومات المتكاملة، وكان يزرع في وسائل الإعلام المختلفة كما هو موضح سابقا و تستكمل بالإضافة إلى ذلك مع 100 ملغ لتر^-1 Nourseothricin (جينا العلوم البيولوجية، ألمانيا). خلال زراعة، اتخذت 1 مل العينات، طرد (2000 × ز، 20 ° C، 10 دقيقة)، وغسلها مع 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم. وكان معلق بيليه في المخزن (20 ملي HEPES، 5 ملي EDTA، 2 ملي DTT) وتفككت من قبل صوتنة مع المعالج بالموجات فوق الصوتية UP400S (تطبيقات الطاقة ~ 400 WS). تم إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي (6000 × ز، 4 ° C، 5 دقائق) وتحليلها بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل - إس دي إس بايج (SDS-PAGE) في ظل ظروف الحد وفقا لطريقة Laemmli (1970) بنسبة 12.5٪ والمواد الهلامية polyacralamide . تم فحص EGFP التعبير عن الثقافة في هياج. (فريتش وآخرون 2007)

الكروماتين مناعي

تم إجراء فحص مناعي لونين باستخدام رقاقة-IT^Tm تعبير (الحافز نشط، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع بعض التعديلات. باختصار، كانت podocytes الإنسان متباينة عبر ربط مع 1٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وجرفت المياه الخلايا مع الثلج الباردة PBS وأوقف رد فعل التثبيت بإضافة 0.125 M الجلايسين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تم غسلها الخلايا مرة أخرى مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني وكشط من الطبق. تم مكعبات الخلايا بواسطة الطرد المركزي ومعلق في المخزن المؤقت تحلل. بعد الطرد المركزي، ومعلق نوى مكعبات في المخزن المؤقت القص، وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة والمنفصمة لونين صوتنة، على سبيل المثال UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH ، Teltow ، ألمانيا) بنسبة 25٪ من الطاقة 5 نبضات من 20 ثانية لكل منها على الجليد إلى أجزاء من حوالي 200-600 برميل. تم بعد ذلك طرد الكروماتين المنفصل وتم جمع المادة الطافية. من أجل التحصينات المناعية ، تم تحضين 60 ميكرولتر من الكروماتين مع 1 ميكروغرام من Sp1 (Santa Cruz Biotechnology، Santa Cruz، CA، USA)، NF-κB p65 (Abcam، Cambridge، UK) أو NF-κB p50 (Abcam) الأجسام المضادة أو الأرانب IgG (مختبرات Zymed ، جنوب سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، كعنصر تحكم سلبي ، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع دوران لطيف. جمعت مركبات المناعة الموصولة بخرزات مغناطيسية باستخدام حامل مغناطيسي ، وتم غسلها على نطاق واسع ، وتم عكس ارتباطات البروتين / الحمض النووي (DNA) ، وتمت إزالة الحمض النووي (DNA) لتحليل PCR في الوقت الفعلي. (ريستولا وآخرون ، 2009)

إعداد DNA EHEC للتحليل رقاقة مجموعة

ترتيب الخلية لست والسلطات الوطنية المعينة المستخرج
وعولج الكريات البكتيرية معلقة في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي المطلوب مع الموجات فوق الصوتية اختلال UP100H (Hielscher GmbH ، ألمانيا) مجهزة MS1 microtip (1MM في القطر). كان تردد التشغيل 30 كيلو هرتز وكانت قدرة الخرج الفعالة 100 واط. وخلال العملية ، تم تبريد العينات في حمام ماء جليدي مختلط وطرد مركزي. تم استخدام العينات للدراسات قياس التدفق الخلوي ، في حين لمعالجتها في وقت لاحق ، تعرضت العينات إلى المعالجة الحرارية (95 درجة مئوية ، 5 دقائق). تمت معالجة الخلايا غير المحللة للخلية الخام بمزيج من الفينول: كلوروفورم: كحول ايزوأميل (25: 24: 1). تمت إضافة حجم متساوٍ من هذا المزيج إلى عينة المحللة ، تم توطين المحلول بقوة لمدة 15 ثانية وطرده بالطرد المركزي عند 15000 x ج لمدة دقيقتين على درجة حرارة الغرفة (RT) حوالي 22 درجة مئوية. تم فصل المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض النووي الجيني بعناية وجمعها في أنبوب إيبندورف المعقم الجديد.
في وقت لاحق ، كانت sonicated عينات لتفتيت الحمض النووي. تم تحقيق خطوة صوتنة في نفس الظروف كما هو موضح أعلاه. لتقييم آثار التجزؤ على الحمض النووي الجيني ، تم تحليل العينات باستخدام الكهربائي هلام هلام الاغاروز.
(…) تم إخضاع العينات sonicated سابقا لمدة 2.5 دقيقة لخطوة استخراج بعد المعالجة الحرارية والطرد المركزي. تم استخراج الحمض النووي مرتين مع الفينول: كلوروفورم: مزيج الكحول ايزواميلي ، وبعد ذلك تعرض لصوتية ثانية لمدة 0 - 15 دقيقة. تم استخدام Agarose gel electrophoresis لتحديد حجم توزيع الحمض النووي الخاضع للتجزئة فوق الصوتية استخراج ما بعد الاستخراج (الشكل في الجانب الأيمن العلوي). كان الحمض النووي مجزأ للغاية من وجود لطخة الحمض النووي بدلا من أشرطة الوزن الجزيئي عالية التي تم القضاء عليها من عينات sonicated لمدة 2.5 دقيقة أو أكثر. خفضت صوتنة طويلة تدريجياً أطوال الشظايا إلى حوالي 150 - 600 bp ، كما أن الصوتنة لمدة 15 دقيقة أدت إلى المزيد من تدهور هذه الشظايا ، كما يمكن رؤيتها في الجزء العلوي من اللطخة. وهكذا ، انخفض متوسط ​​حجم شظايا الحامض النووي تدريجيا مع وقت ultrasonication وسمح للعلاج 5 دقائق للحصول على أحجام شظايا الحمض النووي الأكثر ملاءمة لفحص صفيف رقاقة. في النهاية ، تم إنشاء إجراء التحضير للحمض النووي DNA يتضمن أول دقيقتين من العلاج بالموجات فوق الصوتية ، واستخراج الحمض النووي (2 ×) ، وما يليه صوتنة 5 دقيقة ، تم تأسيسها. (باسليت وآخرون 2008)

لونين مناعي (رقاقة)

تم زراعة خلايا HEK293 كما هو موضح أعلاه ويتم تثبيتها باستخدام 2 ميكروساميديل-غلوتارات لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في وقت لاحق ، تم غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. تم ربط الكروماتين لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة باستخدام 1٪ (v / v) فورمالدهايد وغسلها مرتين مع PBS الجليد الباردة. تم إيقاف التفاعل المتقاطع عبر الحاضنة مع الجليسين بتركيز نهائي قدره 0.125 م لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة مع التريبسين ، كشطت الخلايا من طبق زراعة الخلايا وغسلت مرتين مع PBS. تم تعليق بيليه الخلية في عازلة تحلل (5 ملم أنابيب ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 85 ملي مول KC ، و 0.5 ٪ (ت / ت) Nonidet P-40) ، وحضنت على الجليد لمدة 10 دقيقة ، ومتجانس مع الخالط Dounce. في وقت لاحق ، تم تكوير النوى بالطرد المركزي (3500 x ج و 5 دقائق و 4 درجات مئوية) وتم تعليقها في المخزن المؤقت للنواة (50 ملي مولار ثلاثي هيدروكلوريد ، درجة حموضة 8.1 ، 10 ملم EDTA ، و 1٪ (w / v) SDS). تم تعطيل Nuclei عن طريق صوتنة مع ثلاث نبضات 20 ثانية في UP50H سونيكاتور (HIELSCHER ULTRASCHALL تكنولوجي) في إعداد دورة 0.5 والسعة 30٪، مما أسفر عن شظايا الحمض النووي الجيني مع حجم الجزء الأكبر من 200-1000 شركة بريتيش بتروليوم. لرقاقة، تم تخفيفه 50g من DNA 4 أضعاف في المخزن مناعي (16.7 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.1 و 167 مم كلوريد الصوديوم، 1.2 ملي EDTA، 1.1٪ (ت / ت) تريتون X-100، و 0.01٪ (وزن / ت) SDS). (Weiske وآخرون، 2006)

تحليل هيستون تعديل من قبل مناعي لونين (رقاقة)

لفترة وجيزة، 6 × 10⁶ وجرفت المياه الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وعبر ربط على لوحة الثقافة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في وجود 0.5٪ الفورمالديهايد. أوقف رد فعل عبر ربط بإضافة 0.125 M الجلايسين. تم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة بها في 48 ° C. وكانت جميع المخازن قبل المبردة والواردة مثبطات الأنزيم البروتيني (كامل صغير، روش). وجرفت المياه الخلايا مرتين مع PBS ثم كشط. تم حل الكريات التي تم جمعها في 1 مل العازلة تحلل (1٪ SDS، 5 ملي EDTA، 50 ملي تريس درجة الحموضة 8)، وكان sonicated في حمام الايثانول البارد لمدة 10 دورات في 100٪ السعة باستخدام UP50H سونيكاتور (HIELSCHER، في Teltow، ألمانيا). وقد تصور تجزئة لونين في 1٪ agarose هلام. وكانت شظايا التي تم الحصول عليها في نطاق 200-500pb. تم الحصول على لونين للذوبان بواسطة الطرد المركزي العينات sonicated في 14،000g لمدة 10 دقيقة في 48 ° C. تم تخفيفه الكسر للذوبان 1/10 العازلة في التخفيف (1٪ تريتون X-100، 2 مم EDTA، 20 ملي تريس درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم) ثم aliquoted وتخزينها في 80 درجة مئوية حتى الاستخدام. (رودريجيز وآخرون 2008)