قص الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية

أثناء قص الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، يتم تجزئة جزيئات الحمض النووي الطويلة إلى قطع أصغر ، وهي خطوة حاسمة في إعداد العينات لبناء مكتبة تسلسل الجيل التالي (NGS). يستخدم قص الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية قوى التجويف الصوتية لكسر الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي إلى شظايا تتراوح من 100 نقطة أساس إلى 5 كيلو بايت. تتيح هذه الطريقة التحكم الدقيق في حجم الشظية ، مما يسهل التخصيص لطول الحمض النووي المطلوب للحصول على نتائج تسلسل مثالية.

قص الحمض النووي باستخدام الموجات فوق الصوتية

Hielscher الفوق صوتيات يقدم العديد من الحلول القائمة على الموجات فوق الصوتية للحمض النووي، الحمض النووي الريبي والقص الكروماتين. اختر بين الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار (مثل UP100H) للصوتنة المباشرة باستخدام microtip ، أو استخدم VialTweeeter أو cuphorn بالموجات فوق الصوتية لإعداد الحمض النووي غير المباشر لعينات مختلفة في وقت واحد. Hielscher يقدم الجهاز المثالي النظر في الاحتياجات الخاصة بك: سواء كان لديك 1 أو ما يصل إلى 10 عينات، وأحجام من ميكرولتر إلى حجم لتر – سوف Sonicators Hielscher تلبية الاحتياجات الخاصة بك لإعداد الحمض النووي، الحمض النووي الريبي وشظايا الكروماتين في الطول الصحيح. تسمح قابلية التكرار والتشغيل السهل والتحكم الدقيق بمكتبة موثوقة لتسلسل الجيل التالي.
على عكس تجزئة الحمض النووي الأنزيمي ، يطبق القص بالموجات فوق الصوتية قوى قص ميكانيكية نقية دون إضافة أي مواد كيميائية. من خلال الإعداد الدقيق لمعلمات العملية ، ينتج القص بالموجات فوق الصوتية شظايا الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي (الحمض النووي البلازميد والجينوم).
يمكن تضخيم الأحماض النووية المنقاة قبل أو بعد خطوة التجزئة.
يمكن التحكم في معلمات Sonication (الطاقة ، دورة النبض / الرشقات النارية ، الوقت ودرجة الحرارة) بأمان عبر إعدادات البرنامج.

بروتوكولات قص الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية

لمقايسة الترسيب المناعي للكروماتين

باختصار ، تم طلاء الخلايا في أطباق قطرها 60 مم (400000 لكل طبق) ونقلها باستخدام RhoA siRNA (كما هو موضح) ؛ بعد 72 ساعة ، تم تحضينها بالفورمالديهايد (التركيز النهائي ، 1٪) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية لربط البروتينات بالحمض النووي. تم إخماد تفاعل الربط المتقاطع بإضافة حجم عشر 1.25 مول / لتر جليكاين ، مما يعطي 125 مليمول / لتر تركيز نهائي. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني بارد مثلج ، وأعيد تعليقها في محلول مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي [150 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، 1٪ NP40 ، 0.5٪ ديوكسي كولات ، 0.1٪ SDS ، 5 مليمول / لتر EDTA ، 50 مليمول / لتر Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0)] تحتوي على 1 مليمول / لتر فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد ، 1 Ag / mL aprotinin ، و 1 Ag / mL pepstatin A ، وتحفظ على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، تم صوتنة محللات الخلية على الجليد باستخدام هيلشر UP200S الموجات فوق الصوتية الموجات فوق الصوتية (3 × 40 ثانية ، السعة 40 ٪ ، دورة 1 ؛ Hielscher Ultrasonics GmbH) حتى تم قص الكروماتين المتصالبة لإنتاج شظايا الحمض النووي بين 200 و 1000 نقطة أساس. تم استخدام عشر المحللة الكاملة لتحديد كمية الحمض النووي الموجودة في عينات مختلفة واعتبرت “إجمالي مدخلات الحمض النووي”. تم تحضين الطافات مع الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون / بروتين agarose-50٪ الطين للحد من الخلفية غير المحددة. ثم تم إجراء الترسيب المناعي بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع 5 Ag من p65 المضاد NF-nB (شمال الولاية) أو بدون جسم مضاد (تحكم سلبي). تم استكمال هذه المواد الطافية ب 5 مول / لتر كلوريد الصوديوم وتسخينها طوال الليل عند 65 درجة مئوية لإعادة الروابط المتقاطعة بين البروتين والحمض النووي. تمت معالجة المركبات المناعية بشكل أكبر باستخدام البروتين K الخالي من DNase و RNase ، وتم تنقية الحمض النووي عن طريق استخراج الفينول / الكلوروفورم وترسيب الإيثانول. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات محددة تتوافق مع تسلسل داخل منطقة المروج لجين iNOS البشري (p1 التمهيدي: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶ ؛ التمهيدي p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (دوبلييه وآخرون ، 2008)

دراسات تعبير EGFP

بالنسبة لدراسات التعبير ، تمت زراعة السلالة المؤتلفة L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience ، ألمانيا) مع جين EGFP (البروتين الفلوري الأخضر المحسن) ، الكروموسومات ssu المتكاملة ، في وسائط مختلفة كما هو موضح سابقا بالإضافة إلى استكمالها ب 100 مجم ل^-1 نورسيوثريسين (جينا بيوساينس ، ألمانيا). أثناء الزراعة ، تم أخذ عينات 1 مل ، بالطرد المركزي (2000 × جم ، 20 درجة مئوية ، 10 دقائق) وغسلها بمحلول كلوريد الصوديوم 0.9٪. تم إعادة تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت (20 mM HEPES ، 5 mM EDTA ، 2 mM DTT) وتفككت عن طريق الصوتنة مع المعالج بالموجات فوق الصوتية UP400S (تطبيق الطاقة ∼ 400 واط). تمت إزالة بقايا الخلايا عن طريق الطرد المركزي (6000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق) وتحليلها بواسطة كبريتات دوديسيل الصوديوم - الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) تحت ظروف الاختزال وفقا لطريقة Laemmli (1970) مع 12.5٪ من المواد الهلامية متعددة الأكراميد. تم فحص تعبير EGFP في الثقافة المهتاجة. (فريتش وآخرون 2007)

الكروماتين المناعي الترسيب

تم إجراء مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين باستخدام ChIP-IT^{تي إم} اكسبرس (أكتيف موتيف ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع بعض التعديلات. باختصار ، تم ربط الخلايا البشرية المتمايزة مع 1٪ فورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني بارد بالثلج وتم إيقاف تفاعل التثبيت بإضافة 0.125 M من الجلايسين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تم غسل الخلايا مرة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني بارد وكشط من الطبق. تم تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في المخزن المؤقت للتحلل. بعد الطرد المركزي ، تم إعادة تعليق النوى المحببة في مخزن القص ، وتم تحضينها على الجليد لمدة 30 دقيقة وتم قص الكروماتين عن طريق الصوتنة ، على سبيل المثال UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH ، Teltow ، ألمانيا) عند 25٪ من الطاقة 5 نبضات من 20 ثانية لكل منها على الجليد إلى شظايا من حوالي 200-600 bp. ثم تم طرد الكروماتين المنفصم بالطرد المركزي وتم جمع المادة الطافية. بالنسبة للترسبات المناعية ، تم تحضين 60 ميكرولتر من الكروماتين ب 1 ميكروغرام من Sp1 (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، NF-κB p65 (Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) أو NF-κB p50 (Abcam) الأجسام المضادة أو مع الأرانب IgG (مختبرات Zymed) ، كعنصر تحكم سلبي ، بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع دوران لطيف. تم جمع المجمعات المناعية المرتبطة بالخرز المغناطيسي باستخدام حامل مغناطيسي ، وغسلها على نطاق واسع ، وتم عكس الروابط المتقاطعة للبروتين / الحمض النووي واستخلاص الحمض النووي لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. (ريستولا وآخرون 2009)

إعداد الحمض النووي EHEC لتحليل صفيف الرقائق

ترتيب محللات الخلايا والحمض النووي المستخرج
تمت معالجة الكريات البكتيرية المعلقة في برنامج تلفزيوني إلى التركيز النهائي المطلوب باستخدام الموجات فوق الصوتية المعطل UP100H (Hielscher GmbH ، ألمانيا) مجهزة بطرف دقيق MS1 (قطره 1 مم). كان تردد التشغيل 30 كيلو هرتز وطاقة الإخراج الفعالة 100 واط. خلال العملية ، تم تبريد العينات في حمام ماء مثلج ، مختلطة وطرد مركزي. تم استخدام العينات لدراسات قياس التدفق الخلوي ، بينما للمعالجة اللاحقة ، خضعت العينات للمعالجة الحرارية (95 درجة مئوية ، 5 دقائق). تمت معالجة محللات الخلايا الخام بمزيج من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (25:24:1). تمت إضافة حجم متساو من هذا المزيج إلى عينة المحللة ، وكان المحلول دوامة بقوة لمدة 15 ثانية وتم طرده مركزيا عند 15000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT) حوالي 22 درجة مئوية. تم فصل المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض النووي الجينومي بعناية وجمعها في أنبوب إيبندورف معقم جديد.
في وقت لاحق ، تم صوتنة العينات لتجزئة الحمض النووي. تم تحقيق خطوة صوتنة في نفس الظروف كما هو موضح أعلاه. لتقييم آثار التجزئة على الحمض النووي الجينومي ، تم تحليل العينات باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز.
(…) تعرضت العينات التي تم صوتنها سابقا لمدة 2.5 دقيقة لخطوة استخراج بعد المعالجة الحرارية والطرد المركزي. تم استخراج الحمض النووي الذي تم إطلاقه مرتين باستخدام الفينول: الكلوروفورم: مزيج كحول الأيزو أميل ، وبعد ذلك تعرض للصوتنة الثانية لمدة 0 - 15 دقيقة. تم استخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز لتحديد توزيع حجم الحمض النووي المعرض لتجزئة الموجات فوق الصوتية بعد الاستخراج (الشكل في أعلى الجانب الأيمن). كان الحمض النووي المجزأ للغاية واضحا من وجود مسحة الحمض النووي بدلا من نطاقات الوزن الجزيئي العالية التي تم التخلص منها من العينات الصوتية لمدة 2.5 دقيقة أو أكثر. خفضت صوتنة أطول تدريجيا أطوال شظايا إلى ما يقرب من 150 - 600 بيب ، وصوتنة لمدة 15 دقيقة مزيد من تدهور هذه الشظايا ، كما يمكن أن ينظر إليه في الغالب من قبل الجزء العلوي من اللطاخة. وبالتالي ، انخفض متوسط حجم جزء الحمض النووي تدريجيا مع وقت الموجات فوق الصوتية وسمح العلاج لمدة 5 دقائق بالحصول على أحجام شظايا الحمض النووي الأكثر ملاءمة لمقايسات صفيف الرقائق. أخيرا ، تم إنشاء إجراء إعداد تحليل الحمض النووي الذي يشتمل على أول دقيقتين من العلاج بالموجات فوق الصوتية ، واستخراج الحمض النووي (2×) ، وصوتنة 5 دقائق اللاحقة. (باسيليت وآخرون 2008)

الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)

تم استزراع خلايا HEK293 كما هو موضح أعلاه وتم تثبيتها ب 2 mM disuccinimidyl-glutarate لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في وقت لاحق ، تم غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. تم ربط الكروماتين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام 1٪ (v / v) من الفورمالديهايد وغسله مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني بارد مثلج. تم إيقاف تفاعل الربط المتقاطع عن طريق الحضانة مع الجلايسين بتركيز نهائي قدره 0.125 M لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة مع التربسين ، تم كشط الخلايا من طبق ثقافة الخلية وغسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني. تم إعادة تعليق حبيبات الخلية في محلول التحلل (أنابيب 5 mM ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 85 mM KCl ، و 0.5٪ (v / v) Nonidet P-40) ، وتم تحضينها على الجليد لمدة 10 دقائق ، وتم تجانسها باستخدام خالط Dounce. بعد ذلك ، تم تكوير النوى عن طريق الطرد المركزي (3500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية) وإعادة تعليقها في محلول النوى (50 مللي متر Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.1 ، 10 مللي متر EDTA ، و 1٪ (وزن / حجم) SDS). تعطلت النوى عن طريق صوتنة مع ثلاث نبضات 20-s في UP50H صوتي (Hielscher Ultraschall Technologie) في إعداد دورة 0.5 وسعة 30٪ ، مما ينتج عنه شظايا الحمض النووي الجينومي بحجم سائب يتراوح بين 200 و 1000 نقطة أساس. بالنسبة ل ChIP ، تم تخفيف 50 جراما من الحمض النووي 4 أضعاف في محلول الترسيب المناعي (16.7 مللي متر Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.1 ، و 167 مللي متر كلوريد الصوديوم ، و 1.2 مللي متر EDTA ، و 1.1٪ (v / v) Triton X-100 ، و 0.01٪ (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

تحليل تعديل هيستون بواسطة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)

باختصار ، 6 × 10⁶ تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني وربطها على لوحة الاستزراع لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في وجود 0.5٪ فورمالديهايد. تم إيقاف تفاعل الربط المتقاطع بإضافة 0.125 M جليكاين. تم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة عند 48 درجة مئوية. تم تبريد جميع المخازن المؤقتة مسبقا وتحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (Complete Mini ، Roche). تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ثم كشطها. تم إذابة الكريات المجمعة في محلول تحلل 1 مل (1٪ SDS ، 5 mM EDTA ، 50 mM Tris pH 8) وتم صوتنها في حمام إيثانول بارد لمدة 10 دورات بسعة 100٪ باستخدام UP50H صوتي (هيلشر ، تلتو ، ألمانيا). تم تصور تجزئة الكروماتين في 1٪ هلام الأغاروز. كانت الشظايا التي تم الحصول عليها في نطاق 200-500pb. تم الحصول على الكروماتين القابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي للعينات الصوتية عند 14000 جرام لمدة 10 دقائق عند 48 درجة مئوية. تم تخفيف الجزء القابل للذوبان 1/10 في محلول التخفيف (1٪ Triton X-100 ، 2 mM EDTA ، 20 mM Tris pH 8 ، 150 mM NaCl) ثم تم اقتباسه وتخزينه عند 80 درجة مئوية حتى الاستخدام. (رودريغيز وآخرون 2008)