قص DNA بالموجات فوق الصوتية

أثناء قص DNA وRNA، تُجزَّأ جزيئات DNA الطويلة إلى قطع أصغر، وهي خطوة أساسية في تحضير العينات لإنشاء مكتبات تسلسل الجيل التالي (NGS). يستخدم قص DNA بالموجات فوق الصوتية قوى التجويف الصوتي لتفتيت DNA أو RNA إلى شظايا تتراوح من 100 bp إلى 5 kb. تتيح هذه الطريقة التحكم الدقيق في حجم الشظايا، مما يسهل ضبطها وفق طول DNA المطلوب للحصول على نتائج تسلسل مثلى.

قص DNA باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية

تقدم Hielscher Ultrasonics حلولًا متنوعة قائمة على الموجات فوق الصوتية لقص DNA وRNA والكروماتين. اختر جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار (مثل UP100H) للمعالجة المباشرة بالموجات فوق الصوتية باستخدام طرف دقيق، أو استخدم VialTweeeter أو cuphorn بالموجات فوق الصوتية لتحضير DNA بطريقة غير مباشرة في عينات متنوعة بالتزامن. تقدم Hielscher الجهاز المثالي الذي يلبي احتياجاتك: سواء كانت لديك 1 عينة أو ما يصل إلى 10 عينات، وبأحجام تتراوح من الميكرولتر إلى اللتر – ستلبي أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher متطلباتك لتحضير شظايا DNA وRNA والكروماتين بالطول المناسب. تتيح قابلية تكرار النتائج وسهولة التشغيل والتحكم الدقيق إنشاء مكتبة موثوقة لتسلسل الجيل التالي.
بخلاف التجزئة الإنزيمية لـDNA، يستخدم القص بالموجات فوق الصوتية قوى قص ميكانيكية خالصة دون إضافة أي مواد كيميائية. ومن خلال الضبط الدقيق لمعاملات العملية، ينتج القص بالموجات فوق الصوتية شظايا DNA ذات وزن جزيئي مرتفع (DNA البلازميدي والجينومي).
يمكن تضخيم الأحماض النووية المنقاة قبل خطوة التجزئة أو بعدها.
يمكن التحكم بأمان في معاملات المعالجة بالموجات فوق الصوتية (القدرة، دورة النبض / دفعات النبضات، الوقت ودرجة الحرارة) عبر إعدادات البرنامج.

بروتوكولات قص DNA بالموجات فوق الصوتية

لاختبار الترسيب المناعي للكروماتين

باختصار، زُرعت الخلايا في أطباق بقطر 60mm (400,000 خلية لكل طبق)، وأُدخل إليها RhoA siRNA بالنقل الجيني (كما وُصف)؛ وبعد 72 h، حُضنت مع الفورمالدهيد (بتركيز نهائي قدره 1%) لمدة 10 min عند 37°C لتكوين روابط متصالبة بين البروتينات وDNA. أُوقف تفاعل التشابك بإضافة حجم يعادل عُشر الحجم من الغليسين بتركيز 1.25 mol/L، ليصبح التركيز النهائي 125 mmol/L. غُسلت الخلايا مرتين بمحلول PBS المبرد بالثلج، وأُعيد تعليقها في محلول منظم لاختبار الترسيب المناعي الإشعاعي [150 mmol/L NaCl، و1% NP40، و0.5% ديوكسي كولات، و0.1% SDS، و5 mmol/L EDTA، و50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] يحتوي على 1 mmol/L فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل، و1 Ag/mL أبروتينين، و1 Ag/mL بيبستاتين A، وأُبقيت على الثلج لمدة 30 min. ثم عُولجت المحللات الخلوية بالموجات فوق الصوتية على الثلج باستخدام Hielscher UP200S ، وهو جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية (3 x 40 s، سعة 40%، دورة 1؛ Hielscher Ultrasonics GmbH)، حتى قُص الكروماتين المتشابك لإنتاج شظايا DNA يتراوح طولها بين 200 و1,000 bp. استُخدم عُشر المحلل الكامل لقياس كمية DNA الموجودة في العينات المختلفة، واعتُبر «إجمالي DNA المُدخل». حُضنت السوائل الطافية مع معلق بنسبة 50% من DNA الحيوانات المنوية للسلمون/أغاروز البروتين لتقليل الخلفية غير النوعية. ثم أُجري الترسيب المناعي طوال الليل عند 4°C باستخدام 5 Ag من anti-NF-nB p65 (Upstate)، أو دون جسم مضاد (ضابط سلبي). أُضيف إلى هذه السوائل الطافية NaCl بتركيز 5 mol/L، وسُخنت طوال الليل عند 65°C لفك الروابط المتصالبة بين البروتين وDNA. عُولجت المعقدات المناعية بعد ذلك ببروتيناز K الخالي من DNase وRNase، ونُقّي DNA بالاستخلاص بالفينول/الكلوروفورم والترسيب بالإيثانول. أُجري PCR باستخدام بادئات نوعية تقابل تسلسلًا ضمن منطقة المحفز لجين iNOS البشري (البادئة p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶؛ البادئة p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

دراسات التعبير عن EGFP

لدراسات التعبير، زُرعت السلالة المؤتلفة L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience، ألمانيا)، التي تحمل جين EGFP (البروتين الفلوري الأخضر المعزز) المدمج في الموضع الكروموسومي ssu، في أوساط متنوعة كما وُصف سابقًا، مع إضافة نورسيوثريسين بتركيز 100 mg l^-1 (Nourseothricin؛ Jena Bioscience، ألمانيا). أثناء الزراعة، أُخذت عينات بحجم 1 ml، وخضعت للطرد المركزي (2000 × g، و20°C، و10 min)، وغُسلت بمحلول NaCl بتركيز 0.9%. أُعيد تعليق الراسب في محلول منظم (20 mM HEPES، و5 mM EDTA، و2 mM DTT)، وفُكك بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام المعالج بالموجات فوق الصوتية UP400S (بتطبيق طاقة ∼ 400 Ws). أُزيلت بقايا الخلايا بالطرد المركزي (6000 × g، و4°C، و5 min)، وحُللت بالرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد بوجود دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE) في ظروف اختزالية وفق طريقة Laemmli (1970)، باستخدام هلام بولي أكريلاميد بتركيز 12.5%. فُحص التعبير عن EGFP في مزرعة خاضعة للتحريك. (Fritsche et al. 2007)

الترسيب المناعي للكروماتين

أُجري اختبار الترسيب المناعي للكروماتين باستخدام ChIP-IT^TM Express (Active Motif، Carlsbad، CA، الولايات المتحدة الأمريكية) وفق تعليمات الشركة المصنعة مع بعض التعديلات. باختصار، أُجري التشابك في الخلايا القدمية البشرية المتمايزة باستخدام الفورمالدهيد بتركيز 1% لمدة 10 min عند درجة حرارة الغرفة. غُسلت الخلايا بمحلول PBS المبرد بالثلج، وأُوقف تفاعل التثبيت بإضافة الغليسين بتركيز 0.125 M لمدة 5 min عند درجة حرارة الغرفة. غُسلت الخلايا مرة أخرى بمحلول PBS المبرد بالثلج، وكُشطت من الطبق. رُسبت الخلايا بالطرد المركزي وأُعيد تعليقها في المحلول المنظم للتحلل. بعد الطرد المركزي، أُعيد تعليق النوى المترسبة في المحلول المنظم للقص، وحُضنت على الثلج لمدة 30 min، وقُص الكروماتين بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية، مثلًا باستخدام UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH، Teltow، ألمانيا) بقدرة 25%، عبر 5 نبضات مدة كل منها 20 sec على الثلج، إلى شظايا بطول نحو 200–600 bp. ثم خضع الكروماتين المقصوص للطرد المركزي وجُمع السائل الطافي. لإجراء الترسيب المناعي، حُضن 60 μl من الكروماتين مع 1 μg من الأجسام المضادة لـSp1 (Santa Cruz Biotechnology، Santa Cruz، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)، أو NF-κB p65 (Abcam، Cambridge، المملكة المتحدة)، أو NF-κB p50 (Abcam)، أو مع IgG الأرنب (Zymed Laboratories) بوصفه ضابطًا سلبيًا، طوال الليل عند 4°C مع تدوير لطيف. جُمعت المعقدات المناعية المرتبطة بالخرز المغناطيسي باستخدام حامل مغناطيسي، وغُسلت جيدًا، وفُكت الروابط المتصالبة بين البروتين وDNA، وأُزيح DNA لتحليله بواسطة PCR في الزمن الحقيقي. (Ristola et al. 2009)

تحضير DNA لبكتيريا EHEC لتحليل مصفوفات الرقائق

إعداد المحللات الخلوية وDNA المستخلص
عُولجت الرواسب البكتيرية المعلقة في PBS بالتركيز النهائي المطلوب باستخدام جهاز التفكيك بالموجات فوق الصوتية UP100H (Hielscher GmbH، ألمانيا) المزود بطرف دقيق MS1 (بقطر 1mm). بلغ تردد التشغيل 30 kHz، وقدرة الخرج الفعلية 100 W. أثناء التشغيل، بُردت العينات في حمام من الماء والثلج، ومُزجت وخضعت للطرد المركزي. استُخدمت العينات لدراسات قياس التدفق الخلوي، بينما خضعت العينات المخصصة للمعالجة اللاحقة لمعالجة حرارية (95°C، و5 min). عُولجت المحللات الخلوية الخام بمزيج من الفينول:الكلوروفورم:كحول الأيزوأميل (25:24:1). أُضيف حجم مساوٍ من هذا المزيج إلى عينة المحلل، ومُزج المحلول بقوة باستخدام خلاط دوامي لمدة 15 s، ثم خضع للطرد المركزي عند 15,000 x g لمدة 2 min عند درجة حرارة الغرفة (RT)، أي نحو 22°C. فُصل الطور المائي العلوي المحتوي على DNA الجينومي بعناية، وجُمع في أنبوب Eppendorf جديد ومعقم.
بعد ذلك، عُولجت العينات بالموجات فوق الصوتية لتجزئة DNA. نُفذت خطوة المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الظروف نفسها الموضحة أعلاه. ولتقييم تأثيرات التجزئة في DNA الجينومي، حُللت العينات باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز.
(…) خضعت العينات التي سبق أن عُولجت بالموجات فوق الصوتية لمدة 2.5 min لخطوة استخلاص بعد المعالجة الحرارية والطرد المركزي. استُخلص DNA المتحرر مرتين بمزيج من الفينول:الكلوروفورم:كحول الأيزوأميل، ثم خضع لمعالجة ثانية بالموجات فوق الصوتية لمدة 0 – 15 min. استُخدم الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز لتحديد توزيع أحجام DNA الذي خضع للتجزئة بالموجات فوق الصوتية بعد الاستخلاص (الشكل في أعلى اليمين). ظهرت التجزئة الشديدة لـDNA من خلال وجود لطخة DNA بدلًا من حزم ذات وزن جزيئي مرتفع، والتي اختفت من العينات المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 2.5 min أو أكثر. أدت المعالجة الأطول بالموجات فوق الصوتية إلى تقليل أطوال الشظايا تدريجيًا إلى نحو 150 – 600 bp، وأدت المعالجة لمدة 15 min إلى مزيد من تفكك هذه الشظايا، كما يتضح أساسًا من الجزء العلوي من اللطخة. وهكذا، انخفض متوسط حجم شظايا DNA تدريجيًا مع مدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، وأتاحت المعالجة لمدة 5 min الحصول على أحجام شظايا DNA الأكثر ملاءمة لاختبارات مصفوفات الرقائق. وفي النهاية، اعتُمد إجراء لتحضير DNA المراد تحليله، يتضمن أولًا المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 2 min، ثم استخلاص DNA (2×)، ثم المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 min. (Basselet et al. 2008)

الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)

زُرعت خلايا HEK293 كما وُصف أعلاه، وثُبتت باستخدام غلوتارات ثنائي السكسينيميديل بتركيز 2 mM لمدة 45 min عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، غُسلت الخلايا مرتين بمحلول PBS. أُجري التشابك في الكروماتين لمدة 10 min عند درجة حرارة الغرفة باستخدام الفورمالدهيد بتركيز 1% (v/v)، ثم غُسل مرتين بمحلول PBS المبرد بالثلج. أُوقف تفاعل التشابك بالحضانة مع الغليسين بتركيز نهائي قدره 0.125 M لمدة 5 min عند درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة مع التربسين، كُشطت الخلايا من طبق زراعة الخلايا، وغُسلت مرتين بمحلول PBS. أُعيد تعليق الراسب الخلوي في المحلول المنظم للتحلل (5 mM Pipes، وpH 8.0، و85 mM KCl، و0.5% (v/v) Nonidet P-40)، وحُضن على الثلج لمدة 10 min، وجُونس باستخدام مجانس Dounce. بعد ذلك، رُسبت النوى بالطرد المركزي (3500 x g، و5 min، و4 °C)، وأُعيد تعليقها في المحلول المنظم للنوى (50 mM Tris-HCl، وpH 8.1، و10 mM EDTA، و1% (w/v) SDS). فُككت النوى بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية بثلاث نبضات مدة كل منها 20 s باستخدام جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) بإعداد دورة 0.5 وسعة 30%، مما أنتج شظايا DNA جينومي يتراوح حجم معظمها بين 200 – 1000 bp. لإجراء ChIP، خُفف 50g من DNA بمقدار 4 أضعاف في المحلول المنظم للترسيب المناعي (16.7 mM Tris-HCl، وpH 8.1، و167 mM NaCl، و1.2 mM EDTA، و1.1% (v/v) Triton X-100، و0.01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

تحليل تعديلات الهستون بواسطة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)

باختصار، غُسلت 6 x 10⁶ خلية مرتين بمحلول PBS، وأُجري التشابك فيها على صفيحة الزراعة لمدة 15 min عند درجة حرارة الغرفة بوجود الفورمالدهيد بتركيز 0.5%. أُوقف تفاعل التشابك بإضافة الغليسين بتركيز 0.125 M. نُفذت جميع الخطوات اللاحقة عند 48°C. بُردت جميع المحاليل المنظمة مسبقًا، واحتوت على مثبطات البروتياز (Complete Mini، Roche). غُسلت الخلايا مرتين بمحلول PBS ثم كُشطت. أُذيبت الرواسب المجمعة في 1 ml من المحلول المنظم للتحلل (1% SDS، و5 mM EDTA، و50 mM Tris pH 8)، وعُولجت بالموجات فوق الصوتية في حمام إيثانول بارد لمدة 10 دورات بسعة 100% باستخدام جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية UP50H (Hielscher، Teltow، ألمانيا). أُظهرت تجزئة الكروماتين في هلام أغاروز بتركيز 1%. تراوحت الشظايا الناتجة ضمن المجال 200–500pb. حُصل على الكروماتين الذائب بالطرد المركزي للعينات المعالجة بالموجات فوق الصوتية عند 14,000g لمدة 10 min عند 48°C. خُفف الجزء الذائب بنسبة 1/10 في المحلول المنظم للتخفيف (1% Triton X-100، و2 mM EDTA، و20 mM Tris pH 8، و150 mM NaCl)، ثم وُزع على أجزاء صغيرة وحُفظ عند 80°C حتى الاستخدام. (Rodriguez et al. 2008)