تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية لاختبارات ELISA

تُستخدم اختبارات مثل ELISA على نطاق واسع للتشخيص في المختبر، والكشف عن البروتينات المرتبطة بالأمراض، وضبط الجودة (مثل مراقبة مسببات الحساسية الغذائية). يُعد تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية تقنية سريعة وموثوقة وقابلة للتكرار لتحليل الخلايا وعزل البروتينات داخل الخلايا وDNA وRNA والعضيات. توفر Hielscher Ultrasonics حلولًا متنوعة بالموجات فوق الصوتية لتحضير العينات المفردة والقوارير المتعددة، وكذلك صفائح المعايرة الدقيقة والصفائح ذات 96 بئرًا، بسهولة.

ELISA – اختبار الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم

يرمز ELISA إلى اختبار الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم، وهو تقنية تحليل كيميائي حيوي واسعة الاستخدام تنتمي إلى فئة اختبارات ارتباط الربيطات. في ELISA، تُضاف عينة سائلة إلى طور صلب ثابت ذي خصائص ارتباط خاصة. ويُطبَّق الطور الصلب الثابت عادةً بوصفه طلاءً على صفيحة آبار أو صفيحة ELISA. ثم تُضاف كواشف سائلة مختلفة بالتتابع، وتُجرى خطوات الحضانة والغسل، بحيث يحدث في النهاية تغير بصري (مثل ظهور لون بفعل ناتج تفاعل إنزيمي) في السائل النهائي داخل البئر. يتيح التغير البصري قياس كمية المادة المُحلَّلة بواسطة ما يُسمى «قراءة» كمية. ولإجراء القراءة الكمية، يُستخدم مقياس الطيف الضوئي أو مقياس التألق أو مقياس اللمعان للكشف عن شدة الضوء النافذ وقياسها. تتأثر حساسية الكشف بتضخيم الإشارة أثناء التفاعلات التحليلية. ولأن التفاعلات الإنزيمية مدروسة جيدًا وتُعد عمليات تضخيم موثوقة، تُستخدم الإنزيمات لتوليد الإشارة. ترتبط الإنزيمات بكواشف الكشف بنسب ثابتة لإتاحة التقدير الكمي الدقيق، وهو ما يفسر أيضًا تسمية اختبار الامتصاص المناعي «المرتبط بالإنزيم».
نظرًا إلى أن اختبارات ELISA تُجرى في صفائح المعايرة الدقيقة / الصفائح ذات 96 بئرًا، تُعرف هذه التقنية بأنها تقنية اختبار قائمة على الصفائح، وتُستخدم مثلًا في التشخيص السريري في المختبر والبحث وتطوير الأدوية وغيرها، للكشف عن الأجسام المضادة والببتيدات والبروتينات والهرمونات وتقدير كمياتها.
تُستخدم تقنية ELISA كثيرًا أداةً تشخيصية في الطب والتقنية الحيوية وعلم أمراض النبات، كما تُعد قياسًا مهمًا لضبط الجودة في صناعات متعددة.

تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية قبل ELISA

قبل إجراء اختبار ELISA، تحتاج العينات إلى خطوات تحضير، مثل تحليل الخلايا واستخلاص البروتينات داخل الخلايا وDNA وRNA وغيرها. تتمثل ميزة تحليل الخلايا وعزل البروتينات بالموجات فوق الصوتية في الكفاءة العالية والموثوقية وقابلية التكرار. وتُعد جميع هذه العوامل مهمة للحصول على تشخيصات ونتائج بحثية عالية الجودة

بروتوكول تحليل الخلايا بالموجات فوق الصوتية قبل ELISA

• لمزارع الخلايا: قبل تحليل الخلايا بالموجات فوق الصوتية، أخضع الخلايا للطرد المركزي لمدة 5 mins عند 270 x g في جهاز طرد مركزي دقيق. أزل السائل الفوقاني بالشفط وأعد تعليق الخلايا في 30 – 100 μL من محلول RIPA المنظِّم. ثم احضن راسب الخلايا على الثلج لمدة 30 min.
• أصبحت عينة الخلايا الآن جاهزة للتحليل بالموجات فوق الصوتية:
  استخدم جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار (مثل UP200Ht مع مسبار S26d2) أو جهازًا بالموجات فوق الصوتية لمعالجة عينات متعددة (مثل VialTweeter للمعالجة المتزامنة بالموجات فوق الصوتية لما يصل إلى 10 قوارير، أو UIP400MPT لصفائح المعايرة الدقيقة / الصفائح ذات 96 بئرًا)، بحسب عدد العينات التي تحتاج إلى تحضيرها.
  للمعالجة بالموجات فوق الصوتية لعينة مفردة باستخدام مسبار، ضع الخلايا في أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 mL.
• اضبط مسبقًا مدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، وإجمالي الطاقة المُدخلة، ونمط الدورات و/أو حدود درجة الحرارة في القائمة الرقمية لجهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية. يضمن ذلك معالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الموثوقية وقابلية التكرار.
• أدخل السونوترود وشغِّل جهاز الموجات فوق الصوتية. حرِّك الطرف الدقيق لمسبار الموجات فوق الصوتية برفق داخل العينة لمعالجتها بالموجات فوق الصوتية بصورة متجانسة.
  بالنسبة لمعظم الخلايا، يكتمل التحليل بالموجات فوق الصوتية بعد 2 – 4 دورات من المعالجة بالموجات فوق الصوتية، مدة كل منها 10 sec.
• بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية، أخرج السونوترود من العينة. ينبغي حضانة العينات على الثلج لمدة 5 min. ثم أخضعها للطرد المركزي عند 10,000 x g لمدة 20 min لترسيب الحطام. انقل السوائل الفوقانية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. ضع بطاقات تعريف على المواد المُحلَّلة وخزِّنها عند -20°C.
• يمكن تنظيف سونوترود الموجات فوق الصوتية بمسحه جيدًا بالكحول أو بإجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية داخل كأس مخبرية مملوءة بالكحول، مثل الإيثانول بتركيز 70%. جميع مسابير الموجات فوق الصوتية المصنوعة من التيتانيوم قابلة للتعقيم بالأوتوكلاف.

• اشطف النسيج بمحلول PBS مبرد بالثلج (0.01M, pH=7.4) لإزالة الدم الزائد المنحلّ الكريات إزالةً تامة.
• زِن النسيج (الكلى والقلب والرئة والطحال وغيرها) وفتِّته إلى قطع صغيرة تُجانَس في PBS. يرتبط حجم PBS المطلوب بوزن النسيج. وكقاعدة تقريبية، يتطلب 1g من النسيج نحو 9mL من PBS. يُوصى بإضافة بعض مثبطات البروتياز إلى PBS. (يمكن بدلًا من ذلك استخدام RIPA أو محلول منظِّم للتحليل ناقص التوتر يحتوي على مزيج من مثبطات البروتياز والفوسفاتاز.)
• بحسب حجم النسيج، قد تكون المعالجة القصيرة بالخلاط الدوامي (نحو 1 – 2 min. على دفعات مدة كل منها 15 sec.) مفيدة للمعالجة المسبقة للنسيج.
• ركِّب طرفًا دقيقًا، مثل S26d2، على جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية. ضع أنبوب العينة الذي يحتوي على النسيج في حمام ثلجي.
• عالج العينة بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية، مثل UP200St (بسعة اهتزاز 80%)، لمدة 1 min. في النمط النبضي (15sec تشغيل، 15sec توقف). أبقِ العينة في الحمام الثلجي.
• تُخضع مجانسات الأنسجة بعد ذلك للطرد المركزي للحصول على أجزاء محددة (سيتوسولية أو نووية أو ميتوكوندرية أو ليزوزومية) بغرض إثراء البروتين للتحليل. يُستخلص السائل الفوقاني بإخضاع العينة للطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 5000×g.

تحكم موثوق في درجة الحرارة أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية

تُعد درجة الحرارة عاملًا حاسمًا يؤثر في العملية، وتكتسب أهمية خاصة عند معالجة العينات البيولوجية، مثل منع التحلل الحراري للبروتينات. وكما هو الحال في جميع تقنيات تحضير العينات الميكانيكية، تولِّد المعالجة بالموجات فوق الصوتية حرارة. ومع ذلك، يمكن التحكم جيدًا في درجة حرارة العينات عند استخدام أجهزة Hielscher Ultrasonics. نقدم لك خيارات متنوعة لمراقبة درجة حرارة عيناتك والتحكم فيها أثناء تحضيرها قبل التحليل باستخدام جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار أو VialTweeter.

1. مراقبة درجة حرارة العينة: جميع معالجات الموجات فوق الصوتية الرقمية من Hielscher مزودة ببرنامج ذكي ومستشعر درجة حرارة قابل للتوصيل. وصِّل مستشعر درجة الحرارة بجهاز الموجات فوق الصوتية (مثل UP200Ht, UP200St, VialTweeter, جهاز معالجة الصفائح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP) وأدخل طرف مستشعر درجة الحرارة في أحد أنابيب العينات. يمكنك، عبر شاشة لمس رقمية ملونة، ضبط نطاق محدد لدرجة الحرارة لمعالجة عينتك بالموجات فوق الصوتية في قائمة معالج الموجات فوق الصوتية. سيتوقف جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية تلقائيًا عند بلوغ درجة الحرارة القصوى، ويظل متوقفًا حتى تنخفض درجة حرارة العينة إلى القيمة الدنيا لفارق درجة الحرارة المضبوط ∆. ثم تُستأنف المعالجة بالموجات فوق الصوتية تلقائيًا. تمنع هذه الميزة الذكية التحلل الناجم عن الحرارة.
2. بالنسبة إلى وحدة معالجة العينات المتعددة بالموجات فوق الصوتية VialTweeter، يمكن تبريد كتلة التيتانيوم التي تحمل أنابيب العينات مسبقًا. ضع كتلة VialTweeter (السونوترود فقط دون محوِّل الطاقة!) في الثلاجة أو المجمِّد؛ إذ يساعد التبريد المسبق لكتلة التيتانيوم على تأخير ارتفاع درجة حرارة العينة. ويمكن أيضًا تبريد العينة نفسها مسبقًا إن أمكن.
3. استخدم حمامًا ثلجيًا أو ثلجًا جافًا للتبريد أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية. ضع أنبوب العينة أو أنابيب العينات في حمام ثلجي أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية. وبالنسبة إلى VialTweeter، استخدم صينية قليلة العمق مملوءة بالثلج الجاف، وضع VialTweeter على الثلج الجاف لكي تتبدد الحرارة بسرعة.

يستخدم العملاء في جميع أنحاء العالم أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار من Hielscher، وكذلك وحدات المعالجة بالموجات فوق الصوتية للعينات المتعددة VialTweeter وUIP400MTP، في أعمالهم اليومية لتحضير العينات في المختبرات البيولوجية والكيميائية الحيوية والطبية والسريرية. يتيح البرنامج الذكي والتحكم في درجة الحرارة في معالجات Hielscher التحكم الموثوق في درجة الحرارة وتجنب تحلل العينات الناجم عن الحرارة. يوفر تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية باستخدام حلول Hielscher للموجات فوق الصوتية نتائج عالية الموثوقية وقابلة للتكرار!
اقرأ المزيد عن المعالجة بالموجات فوق الصوتية بمعدل مرتفع لمعالجة العينات باستخدام جهاز معالجة الصفائح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP لإجراء الاختبارات!