فوق الصوتية عينة الإعدادية لSISA Assays
وتستخدم على نطاق واسع في التشخيصات المختبرية، والكشف عن البروتينات المرتبطة بالأمراض ومراقبة الجودة (مثل مراقبة المواد المسببة للحساسية الغذائية). إعداد عينة بالموجات فوق الصوتية هو تقنية سريعة وموثوقة وقابلة للتكرار لخلايا الخلية وعزل البروتينات داخل الخلايا والحمض النووي والحمض النووي والعضيات. Hielscher الفوق صوتيات يقدم حلول بالموجات فوق الصوتية المختلفة لإعداد مريحة من عينات واحدة، قارورة متعددة وكذلك للوحات microtiter ولوحات 96-جيدا.
اليسا – المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيمات
ELISA لتقف على الانزيم المرتبطة المناعة المقايسة وهو تقنية التحليل البيوكيميائية المستخدمة على نطاق واسع من فئة من اليغاند ملزمة المقايسات. في ELISA، يتم إضافة عينة سائلة إلى مرحلة ثابتة صلبة ذات خصائص ربط خاصة. عادة، يتم تطبيق المرحلة الصلبة الثابتة كطلاء على لوحة بئر أو لوحة ELISA. ثم، يتم إضافة الكواشف السائلة المختلفة بالتتابع، المحتضنة، وغسلها، بحيث يحدث في النهاية تغير بصري (مثل تطوير الألوان بواسطة منتج تفاعل انزيمي) في السائل النهائي في البئر. يسمح التغير البصري بقياس كمية التحليلات بما يسمى الكمية “القراءة". في القراءة الكمية، يتم استخدام مقياس طيفي أو فلوروميتر أو مقياس مضيئة للكشف عن شدة الضوء المنقول وقياسه. تتأثر حساسية الكشف عن التضخيم للإشارة أثناء التفاعلات التحليلية. منذ ردود فعل انزيم هي التحقيق بشكل جيد وعمليات التضخيم موثوق بها، وتستخدم الإنزيمات لإنشاء إشارة. وترتبط الانزيمات للكشف عن الكواشف بنسب ثابتة للسماح بالتدميم الدقيق ، وهو ما يفسر أيضا اسم "مرتبط الانزيم" مقايسة المناعة.
كما يتم تنفيذ الاختبارات ELISA في لوحات microtiter / 96-جيدا لوحات, ومن المعروف باسم تقنية قياس لوحة القائمة على ويستخدم على سبيل المثال في التشخيص السريري في المختبر, البحوث, تطوير المخدرات الخ للكشف عن وتحديد كمي الأجسام المضادة, الببتيدات, البروتينات, والهرمونات.
وكثيرا ما تستخدم تقنية ELISA كأداة تشخيص في الطب والتكنولوجيا الحيوية وعلم الأمراض النباتية، كما أن قياس مراقبة الجودة الهامة في صناعات متعددة.
وحدة الإعدادية عينة بالموجات فوق الصوتية VialTweeter يستخدم لتحلل الخلية واستخراج البروتين قبل ELISA
الإعدادية عينة بالموجات فوق الصوتية قبل ELISA
قبل أن يمكن إجراء اختبار ELISA ، تتطلب العينات خطوات من إعداد مثل تحلل الخلايا واستخراج البروتينات داخل الخلايا ، والحمض النووي ، والحمض النووي الريبي الخ. ميزة الخلايا بالموجات فوق الصوتية وعزلة البروتين هو كفاءتها العالية، والموثوقية والتكرار. كل هذه العوامل مهمة من أجل الحصول على نتائج عالية الجودة في مجال التشخيص والبحث العلمي
- علاج العينة المتجانسة
- تحلل كامل
- استخراج البروتين الكامل (مثل الأجسام المضادة والحمض النووي)
- التكيف الأمثل مع نوع الخلية
- لأي حجم العينة
- قابلة للتكرار
- التحكم في درجة الحرارة
- بروتوكول البيانات التلقائي على بطاقة SD
بروتوكول لـ ما قبل ELISA خلية بالموجات فوق الصوتية Lysis
- لثقافات الخلية: قبل تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية، وخلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 270 × ز في microcentrifuge. إزالة فائقة من قبل طموح والخلايا resuspend في 30 - 100 μL من العازلة RIPA. ثم، احتضان بيليه الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- الآن، عينة الخلية جاهزة للتحلل بالموجات فوق الصوتية:
استخدام مسبار من نوع أوفوق بالموجات فوق الصوتية (على سبيل المثال. Uf200 ः ر مع S26d2 مسبار) أو جهاز متعدد العينات بالموجات فوق الصوتية (على سبيل المثال VialTweeter ل sonication في وقت واحد من 10 قوارير أو UIP400MPT للوحات microtiter / 96-جيدا لوحات) اعتمادا على كمية العينات التي تحتاج إلى إعداد.
ل sonication من نوع التحقيق من عينة واحدة، ووضع الخلايا في أنابيب microcentuge 1.5 مل. - تعيين مسبقا المدة بالموجات فوق الصوتية الخاص بك، إجمالي مدخلات الطاقة، وضع دورة و / أو حدود درجة الحرارة في القائمة الرقمية من ultrasonicator. وهذا يضمن سونيكيشن موثوق بها للغاية وتكرار.
- Inset سونوترودي والتبديل على الجهاز بالموجات فوق الصوتية. نقل بلطف تلميح الصغرى من التحقيق بالموجات فوق الصوتية من خلال العينة ل sonicate العينة بشكل موحد.
بالنسبة لمعظم الخلايا، سيتم الانتهاء من التحلل بالموجات فوق الصوتية بعد 2 -4 دورات من 10 ثانية sonication. - بعد سونيكيشن، وإزالة سونوترودي من العينة. يجب أن تكون العينات المحتضنة على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم، الطرد المركزي في 10،000 س ز لمدة 20 دقيقة ل بيليه الحطام. نقل supernatants إلى أنبوب جديد microcentuge. تسمية التحليلات وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- ويمكن تنظيف سونوترودي بالموجات فوق الصوتية عن طريق مسحه بشكل صحيح مع الكحول أو سونيكات في الكأس مليئة بالكحول، على سبيل المثال 70٪ الإيثانول. جميع المسابير بالموجات فوق الصوتية المصنوعة من التيتانيوم هي autoclavable.
لتجانس الأنسجة:
- شطف الأنسجة مع الجليد البارد PBS (0.01M، pH = 7.4) لإزالة الدم الانحلالي الزائد جيدا.
- وزن الأنسجة (الكلى والقلب والرئة والطحال الخ) وmacerate في قطع صغيرة، والتي هي متجانسة في برنامج تلفزيوني. حجم برنامج تلفزيوني مطلوب يرتبط بوزن الأنسجة. كقاعدة عامة، يتطلب 1g من الأنسجة تقريبا. 9mL PBS. من المستحسن إضافة بعض مثبطات البروتياز إلى برنامج تلفزيوني. (RIPA أو تحلل تحلل عازلة تحت ضغط الدم التي تحتوي على البروتياز والفوسفاتاز المانع كوكتيل يمكن استخدامها بدلا من ذلك.)
- اعتمادا على حجم الأنسجة، يمكن أن يكون علاج دوامة قصيرة (حوالي 1-2 دقيقة في 15 ثانية. البقول) مفيدة لعلاج ما قبل الأنسجة.
- جبل تلميح صغير، على سبيل المثال S26d2، إلى الموجات فوق الصوتية الخاص بك. ضع أنبوب العينة مع الأنسجة في حمام جليدي.
- سونيكات العينة مع أوفوق الصوتيات الخاص بك، على سبيل المثال UP200St (80٪ السعة) لمدة 1 دقيقة في وضع النبض (15sec على، وقفة 15sec). إبقاء العينة في حمام الجليد.
- ثم يتم طرد المتجانس للحصول على برك محددة (cytosolic، النووية، الميتوكوندريا أو الليسوسوم) من أجل إثراء البروتين للتحليل. عن طريق الطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق في 5000×g، يتم استرداد supernatant.
سونوترودي MTP-24-8-96 لديه ثمانية مسابير بالموجات فوق الصوتية ل sonication من آبار لوحات microtiter.
موثوق التحكم في درجة الحرارة خلال سونيكيشن
درجة الحرارة عامل حاسم مؤثر على العمليات، وهو مهم بشكل خاص لمعالجة العينات البيولوجية، على سبيل المثال، لمنع التدهور الحراري للبروتينات. كما كل تقنيات إعداد العينة الميكانيكية، سونيكيشن يخلق الحرارة. ومع ذلك، يمكن التحكم في درجة حرارة العينات جيدا عند استخدام أجهزة Hielscher الفوق صوتيات. نقدم لك خيارات مختلفة لرصد والتحكم في درجة حرارة العينات الخاصة بك أثناء إعدادها مع أوفوقاتوراتور من نوع المسبار أو فيالتويتر قبل التحليل.
- مراقبة درجة حرارة العينة: جميع معالجات Hielscher الرقمية بالموجات فوق الصوتية مجهزة ببرنامج ذكي ومستشعر درجة حرارة قابل للتوصيل. توصيل جهاز استشعار درجة الحرارة في جهاز الموجات فوق الصوتية (على سبيل المثال، Uf200 ः ر، UP200St، VialTweeter، UIP400MTP) وإدراج غيض من استشعار درجة الحرارة في واحدة من أنابيب العينة. عبر الرقمية الملونة لمس عرض، يمكنك تعيين في القائمة من المعالج بالموجات فوق الصوتية مجموعة درجة حرارة محددة ل sonication عينة الخاص بك. سوف يتوقف أوب أوبساتاتوراتور تلقائيا عندما يتم التوصل إلى درجة الحرارة القصوى ووقفة حتى درجة حرارة العينة وصولا الى القيمة المنخفضة لدرجة الحرارة المحددة ∆. ثم يبدأ صوتنة تلقائيا مرة أخرى. هذه الميزة الذكية تمنع التحلل الناجم عن الحرارة.
- فيما يتعلق بالموجات فوق الصوتية متعددة العينة وحدة VialTweeter، كتلة التيتانيوم، التي تحمل أنابيب العينة، يمكن أن تكون قبل تبريد. وضع كتلة VialTweeter (فقط سونوترودي دون محول!) في الثلاجة أو الفريزر لتبريد ما قبل كتلة التيتانيوم يساعد على تأجيل ارتفاع درجة الحرارة في العينة. إذا كان ذلك ممكنا، يمكن أن تكون العينة نفسها قبل تبريد جدا.
- استخدام حمام الثلج أو الثلج الجاف لتبرد أثناء sonication. ضع عينتك أنبوب (ق) أثناء سونيكيشن في حمام جليدي. فيلتويتر، استخدم صينية ضحلة مليئة بالجليد الجاف ووضع VialTweeter على الجليد الجاف بحيث يمكن أن تتبدد الحرارة بسرعة.
العملاء في جميع أنحاء العالم استخدام Hielscher التحقيق-ultrasonicators فضلا عن وحدات sonication متعددة العينة VialTweeter و UIP400MTP لعملهم إعداد عينة يومية في المختبرات البيولوجية، البيوكيميائية والطبية والسريرية. البرنامج الذكي والتحكم في درجة الحرارة من معالجات Hielscher، يتم التحكم في درجة الحرارة بشكل موثوق وتجنب تدهور العينة الناجم عن الحرارة. إعداد عينة بالموجات فوق الصوتية مع حلول الموجات فوق الصوتية Hielscher يسلم نتائج موثوق بها للغاية وقابلة للتكرار!
اتصل بنا! / اسألنا!
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع عالية الأداء المجانسة بالموجات فوق الصوتية لخلط التطبيقات، تشتت، استحلاب واستخراج على المختبر، والطيارية ومقياس الصناعية.
الأدب / المراجع
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
حقائق تستحق العلم
أنواع ELISA
هناك عدة أنواع من ELISA، والتي تتميز بمبدأ عملها. وهي تعرف باسم ELISA مباشرة، ELISA غير المباشرة، ساندويتش ELISA، وISA تنافسية، وعكس ELISA. نقدم لك أدناه لمحة عامة عن أنواع ELISA المختلفة وخصائصها الرئيسية واختلافاتها.
يمكن تشغيل ELISA في شكل نوعي أو كمي. النتائج النوعية توفر نتيجة بسيطة إيجابية أو سلبية، في حين في ELISA الكمية مقارنة الكثافة البصرية (OD) للعينة إلى منحنى قياسي، والذي هو عادة تخفيف المسلسل من محلول تركيز المعروفة من الجزيء الهدف.
إليسا مباشرة
ELISA المباشر هو الشكل الأكثر بساطة من إليسا، حيث يتم استخدام الأجسام المضادة الأولية التي تحمل عنوان انزيم فقط والأجسام المضادة الثانوية ليست مطلوبة. يرتبط الجسم المضاد الرئيسي المسمى بالانزيم مباشرة بالهدف، أي المستضد. يتم إضافة محلول المستضد المخزن إلى كل بئر من لوحة microtiter (عادة 96-ألواح بئر، لوحات ELISA)، حيث يلتصق السطح البلاستيكي من خلال تفاعلات الشحن. عندما يتفاعل الإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الأساسي مع ركيزته ، فإنه ينتج إشارة مرئية يمكن قياسها عبر مقياس الطيف أو مقياس الفلور أو المضيء.
ELISA غير المباشرة
بالنسبة لاختبار ELISA غير المباشر، يلزم وجود جسم مضاد أساسي والأجسام المضادة الثانوية. ومع ذلك ، على عكس ELISA المباشر ، وليس الجسم المضاد الأساسي ، ولكن الجسم المضاد الثانوي يسمى إنزيم. يتم تثبيت المستضد إلى لوحة البئر ومقيدة بالجسم المضاد الأساسي. في وقت لاحق، يرتبط الجسم المضاد الثانوي المسمى الانزيم بالجسم المضاد الأساسي. وأخيراً، يتفاعل الإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الثانوي مع ركيزته لإنتاج إشارة مرئية يمكن اكتشافها.
ساندويتش إليسا
بينما في اختبارات ELISA المباشرة وغير المباشرة ، يتم شل المستضد ومغلفة على سطح لوحة البئر ، في الساندويتش ELISA الجسم المضاد هو شل إلى السطح البلاستيكي لصفيح ELISA. الأجسام المضادة غير المُشلَّة في ساندويتش ELISA تُعرف باسم الأجسام المضادة لالتقاط الصور. بالإضافة إلى ذلك إلى الأجسام المضادة القبض، في ساندويتش ELISA أيضا ما يسمى الأجسام المضادة للكشف مطلوبة. تشمل الأجسام المضادة للكشف عن الأجسام المضادة الكشف غير المسمى والأجسام المضادة الكشف الثانوية التي تحمل عنوان انزيم.
خطوة، وينادي من مصلحة ربط إلى القبض الأجسام المضادة شلت إلى لوحة. ثم، يرتبط الجسم المضاد للكشف الأساسي إلى المستضد. بعد ذلك، يرتبط الجسم المضاد للكشف الثانوي بالأجسام المضادة للكشف الأولية. في خطوة التفاعل النهائي ، يتفاعل الإنزيم مع الركيزة لإنتاج إشارة مرئية يمكن اكتشافها بصريًا.
ELISA التنافسية
ELISA التنافسية، والمعروفة أيضا باسم تثبيط ELISA، هو نوع ELISA الأكثر تعقيدا لأنه ينطوي على استخدام مستضد مثبط. كل من الأشكال الثلاثة، المباشرة، غير المباشرة، وساندويتش ELISA، يمكن تكييفها مع تنسيق ELISA التنافسي. في ELISA تنافسية، مستضد المانع ومستضد الفائدة تتنافس على ربط للأجسام المضادة الأولية.
بالنسبة لـ ELISA التنافسية ، يتم احتضان الأجسام المضادة غير الموسّعة في وجود مستضدها ، أي العينة. ثم تضاف هذه المجمعات المضادة / المضادة ملزمة إلى مستضد المغلفة جيدا.
يتم غسلها لوحة، بحيث تتم إزالة الأجسام المضادة غير منضم. ولهذا الاسم ELISA التنافسية اسمها يرجع ذلك إلى حقيقة أن أكثر مستضد في العينة، يتم تشكيل أكثر مجمعات الأجسام المضادة المضادة المضادة. وهذا يعني، هناك أجسام مضادة أقل غير منضمة المتاحة لربط المستضد في البئر ويجب أن تتنافس المستضدات على الأجسام المضادة المتاحة. يتم إضافة جسم مضاد ثانوي، مطابق للجسم المضاد الأساسي. هذا الجسم المضاد الثاني مرتبط بالانزيم. عندما يضاف الركيزة، تنتج الإنزيمات المتبقية إشارة خروموجينية أو فلورسنت.
عند هذه النقطة، يتم إيقاف التفاعل لتجنب التشبع في نهاية المطاف من الإشارة.
وتشمل بعض مجموعات ELISA التنافسية مستضد مرتبط بالانزيم بدلاً من جسم مضاد مرتبط بالانزيم. وينافس المستضد المسمى لمواقع ربط الأجسام المضادة الأساسية مع مستضد العينة (غير المسمى). كلما قل المستضد في العينة، يتم الاحتفاظ بالمستضد الأكثر تسمية في البئر وأقوى الإشارة.
عكس ELISA
عكس ELISA لا تستخدم لوحات جيدا، ولكن يترك المستضدات معلقة في السائل الاختبار. يقيس اختبار ELISA العكسي كمية الأجسام المضادة المربوطة عبر المستضد. وقد تم تطويره خصيصا للكشف عن فيروس غرب النيل و الكشف عن بروتين المغلف وكيف أنها قادرة على العثور على الأجسام المضادة خاصة بالفيروس.
علامة الإنزيمية المستخدمة في ELISA
تعطي القائمة أدناه العلامات الأنزيمية الأكثر شيوعًا المستخدمة في مقايسات ELISA ، والتي تسمح بقياس نتائج الفحص عند الانتهاء.
- وتتحول OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) إلى الكهرمان للكشف عن هـذا الـ HRP (Horseradish Peroxidase)، الذي غالباً ما يُستخدم كبروتين مترافق.
- TMB (3،3′,5,5′-tetramethylbenzidine) يتحول إلى اللون الأزرق عند الكشف عن هرفروب ويتحول إلى اللون الأصفر بعد إضافة حامض الكبريتيك أو الفوسفوريك.
- ABTS (2،2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-حمض السلفونيك]-ديامونيوم الملح) يتحول الأخضر عند الكشف عن HRP.
- PNPP (ف-النيتروفينيل الفوسفات، ملح الصوديوم) يتحول الأصفر عند الكشف عن فوسفاتاز القلوية.