إعداد عينة بالموجات فوق الصوتية لمقايسات ELISA
تستخدم المقايسات مثل ELISA على نطاق واسع للتشخيص في المختبر ، والكشف عن البروتين المرتبط بالأمراض ومراقبة الجودة (مثل مراقبة مسببات الحساسية الغذائية). يعد تحضير العينة بالموجات فوق الصوتية تقنية سريعة وموثوقة وقابلة للتكرار لتحلل الخلايا وعزل البروتينات داخل الخلايا والحمض النووي والحمض النووي الريبي والعضيات. Hielscher Ultrasonics يقدم العديد من الحلول بالموجات فوق الصوتية لإعداد مريحة من عينات واحدة، قوارير متعددة وكذلك للوحات microtiter ولوحات 96 جيدا.
اليسا – مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم
ELISA تعني مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم وهي تقنية تحليل كيميائية حيوية مستخدمة على نطاق واسع لفئة مقايسات ربط الليجند. في ELISA ، تضاف عينة سائلة إلى طور صلب ثابت بخصائص ربط خاصة. عادة ، يتم تطبيق المرحلة الصلبة الثابتة كطلاء على لوحة البئر أو لوحة ELISA. بعد ذلك ، يتم إضافة العديد من الكواشف السائلة بالتتابع ، وحضنها ، وغسلها ، بحيث يحدث أخيرا تغيير بصري (على سبيل المثال ، تطور اللون بواسطة منتج تفاعل إنزيمي) في السائل النهائي في البئر. يسمح التغيير البصري بقياس كمية المادة المراد تحليلها بواسطة ما يسمى بالكمية “القراءة". للقراءة الكمية ، يتم استخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس الفلور أو مقياس الإضاءة لاكتشاف وقياس شدة الضوء المرسل. تتأثر حساسية الكشف بتضخيم الإشارة أثناء التفاعلات التحليلية. نظرا لأن تفاعلات الإنزيم يتم فحصها جيدا وعمليات تضخيم موثوقة ، يتم استخدام الإنزيمات لإنشاء الإشارة. ترتبط الإنزيمات بكواشف الكشف بنسب ثابتة للسماح بالقياس الكمي الدقيق ، وهو ما يفسر أيضا اسم مقايسة الممتز المناعي "المرتبط بالإنزيم".
نظرا لأن فحوصات ELISA يتم إجراؤها في ألواح العيار الدقيق / لوحات 96 بئرا ، فإنها تعرف باسم تقنية الفحص القائمة على الألواح وتستخدم على سبيل المثال في التشخيص السريري في المختبر والبحث وتطوير الأدوية وما إلى ذلك للكشف عن الأجسام المضادة والببتيدات والبروتينات والهرمونات وقياسها.
كثيرا ما تستخدم تقنية ELISA كأداة تشخيصية في الطب والتكنولوجيا الحيوية وأمراض النبات وهي أيضا مقياس مهم لمراقبة الجودة في العديد من الصناعات.
وحدة تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية VialTweeter يستخدم لتحلل الخلايا واستخراج البروتين قبل مقايسات ELISA
إعداد عينة بالموجات فوق الصوتية قبل ELISA
قبل إجراء اختبار ELISA ، تتطلب العينات خطوات تحضير مثل تحلل الخلايا واستخراج البروتينات داخل الخلايا والحمض النووي والحمض النووي الريبي وما إلى ذلك. ميزة تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية وعزل البروتين هي كفاءتها العالية وموثوقيتها وقابليتها للتكاثر. كل هذه العوامل مهمة من أجل الحصول على تشخيصات عالية الجودة ونتائج بحثية
- معالجة عينة متجانسة
- التحلل الكامل
- استخراج البروتين الكامل (مثل الأجسام المضادة والحمض النووي)
- التكيف الأمثل مع نوع الخلية
- لأي حجم عينة
- استنساخه
- التحكم في درجة الحرارة
- بروتوكول البيانات التلقائي على بطاقة SD
بروتوكول تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية قبل ELISA
- لمزارع الخلايا: قبل تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية ، خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 270 × جم في جهاز طرد مركزي دقيق. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط وأعد تعليق الخلايا في 30-100 ميكرولتر من المخزن المؤقت REA. ثم احتضان بيليه الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- الآن ، عينة الخلية جاهزة للتحلل بالموجات فوق الصوتية:
استخدام الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار (على سبيل المثال UP200Ht مع مسبار S26d2) أو جهاز متعدد العينات بالموجات فوق الصوتية (مثل VialTweeter للصوتنة المتزامنة لما يصل إلى 10 قوارير أو UIP400MPT لألواح العيار الدقيق / 96 لوحة بئر) اعتمادا على كمية العينات التي تحتاج إلى تحضيرها.
للحصول على صوتنة من نوع المسبار لعينة واحدة ، ضع الخلايا في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. - قبل ضبط مدة الموجات فوق الصوتية الخاصة بك، ومدخلات الطاقة الإجمالية، ووضع دورة و / أو حدود درجة الحرارة في القائمة الرقمية للفوق صوتي. هذا يضمن صوتنة موثوقة للغاية والتكرار.
- أقحم sonotrode وتشغيل جهاز الموجات فوق الصوتية. حرك الطرف الصغير للمسبار بالموجات فوق الصوتية برفق عبر العينة لصوتنة العينة بشكل موحد.
بالنسبة لمعظم الخلايا ، سيتم الانتهاء من التحلل بالموجات فوق الصوتية بعد 2-4 دورات من صوتنة 10 ثانية. - بعد صوتنة ، وإزالة sonotrode من العينة. يجب تحضين العينات على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم ، أجهزة الطرد المركزي في 10000 × غرام لمدة 20 دقيقة لتكوير الحطام. نقل المواد الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. قم بتسمية المواد المراد تحليلها وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- يمكن تنظيف سونوترودي بالموجات فوق الصوتية عن طريق مسحه بشكل صحيح مع الكحول أو سونيكات في دورق مملوء بالكحول ، على سبيل المثال 70٪ إيثانول. جميع مجسات الموجات فوق الصوتية المصنوعة من التيتانيوم قابلة للتعقيم.
استخراج البروتين من خلايا الإشريكية القولونية مع مسبار بالموجات فوق الصوتية UP200St
- شطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني بارد مثلج (0.01M ، درجة الحموضة = 7.4) لإزالة الدم انحلال الدم الزائد جيدا.
- وزن الأنسجة (الكلى والقلب والرئة والطحال وما إلى ذلك) ونقعها إلى قطع صغيرة ، والتي يتم تجانسها في برنامج تلفزيوني. يرتبط حجم PBS المطلوب بوزن الأنسجة. كقاعدة عامة ، يتطلب 1 جرام من الأنسجة حوالي 9 مل من برنامج تلفزيوني. يوصى بإضافة بعض مثبطات الأنزيم البروتيني إلى برنامج تلفزيوني. (يمكن استخدام RIPA أو محلول تحلل منخفض التوتر يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز بدلا من ذلك.)
- اعتمادا على حجم الأنسجة ، يمكن أن يكون علاج الدوامة القصير (حوالي 1-2 دقيقة في 15 ثانية من النبضات) مفيدا في المعالجة المسبقة للأنسجة.
- قم بتركيب طرف صغير ، على سبيل المثال S26d2 ، إلى جهاز الموجات فوق الصوتية الخاص بك. ضع أنبوب العينة مع المنديل في حمام جليدي.
- قم بتنشيط العينة باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية الخاص بك ، على سبيل المثال UP200St (سعة 80٪) لمدة 1 دقيقة في وضع النبض (15 ثانية تشغيل ، 15 ثانية وقفة). احتفظ بالعينة في حمام جليدي.
- ثم يتم طرد المجانسات بالطرد المركزي للحصول على برك محددة (خلوي أو نووي أو ميتوكوندريا أو ليزوزوم) من أجل إثراء البروتين للتحليل. عن طريق الطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق عند 5000× جم ، يتم استرداد المادة الطافية.
يحتوي sonotrode MTP-24-8-96 على ثمانية تحقيقات بالموجات فوق الصوتية لصوتنة آبار لوحات microtiter.
تحكم موثوق في درجة الحرارة أثناء الصوتنة
درجة الحرارة هي عامل حاسم يؤثر على العملية وله أهمية خاصة لمعالجة العينات البيولوجية ، على سبيل المثال لمنع التدهور الحراري للبروتينات. مثل جميع تقنيات تحضير العينات الميكانيكية ، فإن صوتنة يخلق الحرارة. ومع ذلك، يمكن التحكم في درجة حرارة العينات بشكل جيد عند استخدام أجهزة الموجات فوق الصوتية Hielscher. نقدم لك خيارات مختلفة لمراقبة درجة حرارة عيناتك والتحكم فيها أثناء إعدادها باستخدام الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار أو VialTweeter قبل التحليل.
- مراقبة درجة حرارة العينة: تم تجهيز جميع المعالجات بالموجات فوق الصوتية الرقمية Hielscher مع برنامج ذكي وجهاز استشعار درجة الحرارة للتوصيل. قم بتوصيل مستشعر درجة الحرارة بجهاز الموجات فوق الصوتية (على سبيل المثال ، UP200Ht, UP200St, VialTweeter, صوتنة لوحة متعددة الآبار UIP400MTP) وأدخل طرف مستشعر درجة الحرارة في أحد أنابيب العينة. عبر شاشة رقمية ملونة تعمل باللمس ، يمكنك ضبط في قائمة المعالج بالموجات فوق الصوتية على نطاق درجة حرارة محدد لصوتنة عينتك. سيتوقف جهاز الموجات فوق الصوتية تلقائيا عند الوصول إلى درجة الحرارة القصوى ويتوقف مؤقتا حتى تنخفض درجة حرارة العينة إلى القيمة الأقل ل ∆ درجة الحرارة المحددة. ثم يبدأ صوتنة تلقائيا مرة أخرى. تمنع هذه الميزة الذكية التدهور الناجم عن الحرارة.
- فيما يتعلق بوحدة الموجات فوق الصوتية متعددة العينات VialTweeter ، يمكن تبريد كتلة التيتانيوم ، التي تحمل أنابيب العينة ، مسبقا. ضع كتلة VialTweeter (فقط sonotrode بدون محول الطاقة!) في الثلاجة أو الفريزر لتبريد كتلة التيتانيوم مسبقا يساعد على تأجيل ارتفاع درجة الحرارة في العينة. إذا أمكن ، يمكن تبريد العينة نفسها مسبقا أيضا.
- استخدم حمام جليدي أو ثلج جاف ليبرد أثناء الصوتنة. ضع أنبوب (أنابيب) العينة أثناء الصوتنة في حمام جليدي. بالنسبة ل VialTweeter ، استخدم صينية ضحلة مملوءة بالثلج الجاف وضع VialTweeter على الثلج الجاف حتى تتبدد الحرارة بسرعة.
العملاء في جميع أنحاء العالم استخدام الموجات فوق الصوتية من نوع مسبار Hielscher وكذلك وحدات صوتنة متعددة العينات VialTweeter و UIP400MTP لعملهم اليومي لإعداد العينات في المختبرات البيولوجية والكيميائية الحيوية والطبية والسريرية. البرمجيات الذكية والتحكم في درجة الحرارة من المعالجات Hielscher، يتم التحكم في درجة الحرارة بشكل موثوق وتجنب تدهور العينة الناجمة عن الحرارة. إعداد عينة بالموجات فوق الصوتية مع حلول الموجات فوق الصوتية Hielscher يسلم نتائج موثوقة للغاية وقابلة للتكرار!
اقرأ المزيد عن صوتنة عالية الإنتاجية باستخدام صوتنة لوحة متعددة الآبار UIP400MTP للمقايسات!
اتصل بنا! / اسألنا!
Hielscher Ultrasonics بتصنيع المجانسات بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء لخلط التطبيقات، والتشتت، والاستحلاب والاستخراج على المختبر، التجريبية والصناعية النطاق.
الأدب / المراجع
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
حقائق تستحق المعرفة
ما هي أنواع ELISA الموجودة؟
هناك عدة أنواع من ELISA ، والتي تتميز بمبدأ عملها. وهي معروفة باسم ELISA المباشر ، و ELISA غير المباشر ، و ELISA ساندويتش ، و ELISA التنافسي ، و ELISA العكسي. أدناه ، نقدم لك نظرة عامة على أنواع ELISA المختلفة وخصائصها واختلافاتها الرئيسية.
يمكن تشغيل ELISA بتنسيق نوعي أو كمي. توفر النتائج النوعية نتيجة إيجابية أو سلبية بسيطة ، بينما في ELISA الكمي تتم مقارنة الكثافة الضوئية (OD) للعينة بمنحنى قياسي ، والذي عادة ما يكون تخفيفا تسلسليا لمحلول تركيز معروف للجزيء المستهدف.
إليسا المباشرة
ELISA المباشر هو أبسط أشكال الفحص من Elisa ، حيث يتم استخدام الجسم المضاد الأولي المسمى بالإنزيم فقط ولا يلزم وجود أجسام مضادة ثانوية. يرتبط الجسم المضاد الأساسي المسمى بالإنزيم مباشرة بالهدف ، أي المستضد. يضاف محلول المستضد المخزن إلى كل بئر من صفيحة العيار الدقيق (عادة 96 لوحة بئر ، ألواح ELISA) ، حيث يلتصق بالسطح البلاستيكي من خلال تفاعلات الشحنة. عندما يتفاعل الإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الأولي مع ركيزته، فإنه ينتج إشارة مرئية يمكن قياسها عبر مقياس الطيف الضوئي أو مقياس الفلور أو مقياس الإضاءة.
إليسا غير مباشر
لاختبار ELISA غير المباشر ، يلزم وجود جسم مضاد أولي وجسم مضاد ثانوي. ومع ذلك ، على عكس ELISA المباشر ، ليس الجسم المضاد الأساسي ، ولكن الجسم المضاد الثانوي موسوم بإنزيم. يجمد المستضد إلى صفيحة البئر ويرتبط بالجسم المضاد الأساسي. بعد ذلك، يرتبط الجسم المضاد الثانوي المسمى بالإنزيم بالجسم المضاد الأولي. وأخيرا، يتفاعل الإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الثانوي مع ركيزته لإنتاج إشارة مرئية يمكن اكتشافها.
ساندويتش إليسا
بينما في اختبارات ELISA المباشرة وغير المباشرة ، يتم تجميد المستضد وتغطيته بسطح صفيحة البئر ، في شطيرة ELISA ، يتم تثبيت الجسم المضاد على السطح البلاستيكي للوحة ELISA. تعرف الأجسام المضادة المجمدة في شطيرة ELISA باسم الأجسام المضادة للالتقاط. بالإضافة إلى الأجسام المضادة التقاط ، في شطيرة ELISA أيضا ما يسمى الأجسام المضادة للكشف مطلوبة. تتضمن الأجسام المضادة للكشف جسما مضادا للكشف الأولي غير المسمى وجسم مضاد للكشف الثانوي يسمى بالإنزيم.
خطوة بخطوة ، يرتبط مستضد الاهتمام بالجسم المضاد الملتقط الذي يجمد على اللوحة. بعد ذلك ، يرتبط الجسم المضاد للكشف الأولي بمولد الضد. بعد ذلك ، يرتبط الجسم المضاد للكشف الثانوي بالجسم المضاد للكشف الأولي. في خطوة التفاعل الأخيرة، يتفاعل الإنزيم مع ركيزته لإنتاج إشارة مرئية يمكن اكتشافها بصريا.
إليسا تنافسية
ELISA التنافسي ، المعروف أيضا باسم تثبيط ELISA ، هو أكثر أنواع ELISA تعقيدا لأنه ينطوي على استخدام مستضد مثبط. يمكن تكييف كل تنسيق من التنسيقات الثلاثة ، المباشر وغير المباشر وساندويتش ELISA ، مع تنسيق ELISA التنافسي. في ELISA التنافسي ، يتنافس مستضد المثبط والمستضد محل الاهتمام على الارتباط بالجسم المضاد الأساسي.
بالنسبة ل ELISA التنافسي ، يتم تحضين الجسم المضاد غير المسمى في وجود مستضده ، أي العينة. ثم تضاف هذه المجمعات المرتبطة بالأجسام المضادة / المستضد إلى بئر مغلفة بالمستضد.
يتم غسل اللوحة ، بحيث تتم إزالة الأجسام المضادة غير المنضمة. ELISA التنافسي له اسمه يرجع إلى حقيقة أنه كلما زاد عدد المستضد في العينة ، يتم تشكيل المزيد من مجمعات الأجسام المضادة للمستضد. هذا يعني أن هناك عددا أقل من الأجسام المضادة غير المنضمة المتاحة للارتباط بمولد الضد في البئر ويجب أن تتنافس مولدات الضد على الجسم المضاد المتاح. يضاف جسم مضاد ثانوي يطابق الجسم المضاد الأولي. يرتبط هذا الجسم المضاد الثاني بالإنزيم. عند إضافة الركيزة ، تنتج الإنزيمات المتبقية إشارة كروموجينية أو فلورية.
عند هذه النقطة ، يتم إيقاف التفاعل لتجنب التشبع النهائي للإشارة.
تتضمن بعض مجموعات ELISA التنافسية مستضدا مرتبطا بالإنزيم بدلا من جسم مضاد مرتبط بالإنزيم. يتنافس مولد الضد المسمى على مواقع ارتباط الأجسام المضادة الأولية مع عينة مولد الضد (غير المسمى). كلما قل مولد الضد في العينة ، زاد الاحتفاظ بمولد الضد المسمى في البئر وزادت الإشارة.
عكس إليسا
لا يستخدم ELISA العكسي ألواح الآبار ، ولكنه يترك المستضدات معلقة في سائل الاختبار. يقيس اختبار ELISA العكسي كمية الجسم المضاد المرتبط عبر المستضد. تم تطويره خصيصا للكشف عن بروتين غلاف فيروس غرب النيل والتحقيق فيه وكيف يمكنه العثور على الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس.
ما هي العلامات الأنزيمية المستخدمة في ELISA؟
تعطي القائمة أدناه العلامات الأنزيمية الأكثر شيوعا المستخدمة في مقايسات ELISA ، والتي تسمح بقياس نتائج الفحص عند الانتهاء.
- يتحول OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) إلى الكهرمان للكشف عن HRP (بيروكسيديز الفجل) ، والذي يستخدم غالبا كبروتين مترافق.
- TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) يتحول إلى اللون الأزرق عند اكتشاف HRP ويتحول إلى اللون الأصفر بعد إضافة حمض الكبريتيك أو الفوسفوريك.
- كلية اللاهوت المعمدانية العربية (2,2′- Azinobis [3-إيثيل بنزوثيازولين -6-حمض السلفونيك] - ملح ثنائي الأمونيوم) يتحول إلى اللون الأخضر عند اكتشاف HRP.
- PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate ، ملح الصوديوم) يتحول إلى اللون الأصفر عند اكتشاف الفوسفاتيز القلوي.