بروتوكول تعطيل فيروس كورونا SARS-CoV-2 بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية

يُعد Hielscher VialTweeter وحدة فريدة لتحضير عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية، وتُستخدم لتعطيل فيروس كورونا SARS-COV-2. يتيح VialTweeter تحضير ما يصل إلى 10 قوارير عينات في وقت واحد، مما يجعله الوحدة المثالية لمعالجة أعداد كبيرة من العينات.

تعطيل فيروس كورونا SARS-CoV-2 باستخدام VialTweeter

بعد إزالة المثبّت، غُسلت الطبقات الأحادية ثلاث مرات بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) قبل كشط الخلايا وجمعها في 1mL MEM/5% FBS ومعالجتها بالموجات فوق الصوتية (3 × تشغيل لمدة 10 ثوانٍ، وإيقاف لمدة 10 ثوانٍ، بقدرة وسعة عند 100%) باستخدام المعالج بالموجات فوق الصوتية من Hielscher UP200St مع VialTweeter بوصفه ملحقًا. رُوّقت السوائل الطافية بالطرد المركزي عند 3000 × g لمدة 10 دقائق. اقرأ أدناه البروتوكول الكامل لتعطيل فيروس كورونا SARS-CoV-2 الذي وضعه Welch وآخرون (2020):

الخلايا والفيروس

زُرعت خلايا Vero E6‏ (Vero C1008; ATCC CRL-1586) في وسط Eagle المعدّل الأساسي الأدنى (MEM)، المضاف إليه مصل العجل الجنيني (FCS) بنسبة 10% (v/v). كان الفيروس المستخدم هو سلالة SARS-CoV-2‏ hCOV-19/England/2/2020، التي عزلتها PHE من أول مجموعة مرضى في المملكة المتحدة بتاريخ 29/01/2020. جرى الحصول على هذا الفيروس في التمرير 1، واستُخدم في دراسات التعطيل في التمرير 2 أو 3.
للاطلاع على الكواشف والمواد الكيميائية المستخدمة لتعطيل SARS-CoV-2، وكذلك إزالة السمية الخلوية للكواشف، يُرجى مراجعة التقرير العلمي الذي أعده Welch وآخرون (2020).

تعطيل الفيروس بالمنظفات – بروتوكول تعطيل فيروس كورونا SARS-CoV-2 الذي وضعه Welch وآخرون 2020

تعطيل SARS-CoV-2


بالنسبة إلى المنتجات التجارية، عولجت المستحضرات الفيروسية (سائل زراعة الأنسجة، بعيارات تتراوح من 1 × 10⁶ إلى 1 × 10⁸ PFU/ml) بالكواشف بثلاث مكررات، بالتراكيز ولمدد التلامس الموصى بها في تعليمات الاستخدام الصادرة عن الشركة المصنّعة، حيثما توفرت، أو بالتراكيز والمدد التي طلبتها مختبرات الاختبار تحديدًا. وعندما حددت الشركة المصنّعة نطاقًا من التراكيز، اختُبرت أدنى نسبة من المنتج إلى العينة (أي أدنى تركيز موصى به للمنتج المختبَر). اختُبرت كواشف أنابيب نقل العينات باستخدام نسبة حجم واحد من سائل زراعة الأنسجة إلى عشرة أحجام من الكاشف، ما لم تحدد الشركة المصنّعة نسبة حجمية لسائل العينة إلى الكاشف. اختُبرت المنظفات والمثبّتات والمذيبات بالتراكيز المحددة وللمدد المحددة. أُجريت جميع خطوات التعطيل في درجة حرارة الغرفة المحيطة (18 – 25°C). ولاختبار أنواع بديلة من العينات، أُضيف الفيروس إلى مصفوفة العينة المحددة بنسبة 1:9، ثم عولجت بكواشف الاختبار كما ورد أعلاه. تضمنت جميع التجارب عينات ضابطة خضعت لمعاملة صورية بثلاث مكررات، باستخدام حجم مكافئ من PBS بدلًا من كاشف الاختبار. وفور انقضاء مدة التلامس المطلوبة، عولج 1mL من العينة المعالَجة باستخدام مصفوفة الترشيح المختارة على نحو مناسب. أُزيلت الكواشف لاختبار التعطيل باستخدام أعمدة طرد مركزي أكبر حجمًا من نوع Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns‏ (Thermo Fisher)، أو بملء أعمدة طرد مركزي فارغة من Pierce بسعة 10mL‏ (Thermo Fisher) بمواد SM2 Bio-Beads أو Sephacryl S-400HR أو Sephadex LH-20 للحصول على 4mL من الخرز/الراتنج المعبّأ. وللتنقية باستخدام مرشحات Amicon، نُقّيت عينات بحجم 2 × 500μl باستخدام مرشحين للطرد المركزي بالطريقة الموصوفة سابقًا، ثم جُمعت معًا. ولإزالة الفورمالدهيد والفورمالدهيد مع الغلوتارالدهيد، استُخدم مرشح واحد مع حجم عينة قدره 1× 500μl، ثم أُعيد تعليق العينة بعد المعالجة في 500μl PBS وأُضيفت إلى 400ul MEM/5% FBS. ولتعطيل ما أُصيب بالعدوى من الطبقات الأحادية المصابة، استُخدمت قوارير بمساحة 12.5 cm² تحتوي على خلايا Vero E6‏ (2.5 × 10⁶ خلية/قارورة في 2.5mL MEM/5% FBS)، وأُصيبت الخلايا عند MOI 0.001 وحُضنت عند 37°C/5% CO₂ لمدة 24 ساعة. أُزيل السائل الطافي، وثُبّتت الخلايا باستخدام 5mL من الفورمالدهيد، أو الفورمالدهيد والغلوتارالدهيد، في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 أو 60 دقيقة. أُزيل المثبّت، وغُسلت الطبقات الأحادية ثلاث مرات باستخدام PBS قبل كشط الخلايا وجمعها في 1mL MEM/5% FBS ومعالجتها بالموجات فوق الصوتية (3 × تشغيل لمدة 10 ثوانٍ، وإيقاف لمدة 10 ثوانٍ، بقدرة وسعة عند 100%) باستخدام UP200St مع ملحق VialTweeter‏ (Hielscher Ultrasound Technology). رُوّقت السوائل الطافية بالطرد المركزي عند 3000 × g لمدة 10 دقائق.


تفاصيل الكاشف المستخدم لتعطيل فيروس كورونا SARS-CoV-2 باستخدام VialTweeter بالموجات فوق الصوتية وفقًا للبروتوكول الذي وضعه Welch وآخرون 2020

يمكن العثور هنا على البروتوكول الكامل، بما في ذلك استخدام Hielscher VialTweeter:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

أجهزة متطورة لتفتيت المواد وتفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية

يُعد جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية متعدد العينات VialTweeter واحدًا من حلول عديدة بالموجات فوق الصوتية لتحضير العينات في المختبرات البيولوجية والكيميائية الحيوية والسريرية. توفر Hielscher Ultrasonics جهاز التفتيت بالموجات فوق الصوتية المثالي لتطبيقك، مثل تحلل الخلايا، والاستخلاص من الخلايا، وتجنيس الأنسجة، وإذابة نواتج تحلل الخلايا، والإذابة، وإزالة الغازات من العينات، وغيرها.
أخبرنا بعدد العينات التي تحتاج إلى معالجتها في الساعة وفي اليوم، وما إذا كنت تفضّل المعالجة المباشرة أو غير المباشرة بالموجات فوق الصوتية، وما الهدف من معالجة العينات بالموجات فوق الصوتية. سنوصي لك بوحدة الموجات فوق الصوتية الأنسب لروتين عملك اليومي!
تُجهّز المعالجات الرقمية بالموجات فوق الصوتية من Hielscher Ultrasonics ببرمجيات ذكية، وتسجيل تلقائي للبيانات، وخيارات سهلة للضبط المسبق للتحكم في درجة الحرارة، ومدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، ونمط الدورة/النبض، بالإضافة إلى إضاءة العينات والتحكم عن بُعد عبر المتصفح. نسعى إلى جعل أجهزتنا بالموجات فوق الصوتية ذكية قدر الإمكان، لكي تصبح أبحاثك وروتين عملك مريحين وناجحين قدر الإمكان.
انقر هنا للاطلاع على المزيد من التطبيقات، بما في ذلك بروتوكولات تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية باستخدام VialTweeter!