التحلل بالموجات فوق الصوتية لعينات Drosophila Melanogaster

يُستخدم Drosophila melanogaster على نطاق واسع في المختبرات بوصفه كائنًا نموذجيًا. ولذلك، يجب إجراء خطوات تحضير ما قبل التحليل، مثل التحلل وتفكيك الخلايا واستخلاص البروتين وقص DNA، لعينات Drosophila melanogaster بصورة متكررة. تتميز أجهزة التفكيك بالموجات فوق الصوتية بالموثوقية والكفاءة، ويمكن استخدامها لأداء مهام مختلفة، مثل التحلل واستخلاص البروتين أو تجزئة DNA، بسهولة بمجرد ضبط معلمات العملية فوق الصوتية. وبذلك تُعد المجانسات بالموجات فوق الصوتية أدوات مرنة ذات نطاق واسع من التطبيقات.

التحلل واستخلاص البروتين بالموجات فوق الصوتية

يُعد التحلل وإذابة الخلايا وتجنيس الأنسجة واستخلاص البروتين من المهام المعتادة لأجهزة التفكيك بالموجات فوق الصوتية في المختبرات البيولوجية. وتناسب أجهزة التفكيك وأجهزة تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية تجنيس الأنسجة الحيوانية والحشرات (مثل Drosophila melanogaster وC. elegans) أو العينات النباتية. وتشمل التطبيقات اللاحقة للمعالجة بالموجات فوق الصوتية تحلل المعلقات الخلوية والرواسب، وكذلك استخلاص البروتينات داخل الخلايا.
يُعد التحلل واستخلاص البروتين بالموجات فوق الصوتية عمليتين موثوقتين للغاية وقابلتين للتكرار، ويمكن إجراؤهما استنادًا إلى بروتوكولات معتمدة. ونظرًا إلى إمكانية ضبط شدة العملية فوق الصوتية بدقة باستخدام معلمات المعالجة بالموجات فوق الصوتية، مثل السعة ونمط الدورة / النبض ودرجة الحرارة وحجم العينة، يمكن تكرار البروتوكولات بعد إثبات فعاليتها والحصول على النتيجة نفسها مرارًا.

تجزئة DNA وRNA بالموجات فوق الصوتية

بعد تحلل الخلايا واستخلاص البروتين، تتمثل إحدى الخطوات الشائعة المطلوبة في تحضير العينات في قص وتجزئة DNA وRNA والكروماتين، مثلًا قبل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP). ويمكن تحقيق تجزئة DNA وRNA بصورة موثوقة عن طريق كسر الروابط التساهمية التي تُبقي DNA متماسكًا باستخدام قوى فيزيائية. وعند استخدام القص الفيزيائي، مثل المعالجة بالموجات فوق الصوتية، تُكسر سلاسل DNA أولًا، ثم يُجزَّأ DNA إلى قطع أصغر.
تتميز تجزئة DNA بالموجات فوق الصوتية بالموثوقية والكفاءة في قص DNA إلى طول مستهدف، مثل 500bp (أزواج قاعدية). وتشمل المزايا الرئيسية لتجزئة DNA بالموجات فوق الصوتية التحكم الدقيق في معلمات العملية فوق الصوتية وشدتها. ويمكن ضبط معلمات العملية فوق الصوتية من خلال الضبط الدقيق لشدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية ودوراتها ومدتها. ويتيح ذلك إنتاج DNA بالأحجام المطلوبة، ويمكن إنتاج DNA بالطول المستهدف بصورة موثوقة وتكرار إنتاجه. كما يُعد قص DNA بالموجات فوق الصوتية مثاليًا لإنتاج قطع DNA ذات وزن جزيئي مرتفع.

بروتوكولات التحلل بالموجات فوق الصوتية لعينات Drosophila melanogaster

يمكنكم أدناه الاطلاع على بروتوكولات مختلفة للتحلل واستخلاص البروتين وتجزئة DNA أو الكروماتين من عينات Drosophila بمساعدة الموجات فوق الصوتية.

التحلل بالموجات فوق الصوتية لاختبار الترسيب المناعي بالربط المتصالب (CLIP)

أُجري اختبار CLIP وفقًا لما ورد سابقًا مع بعض التعديلات. أُخضع نحو 20 mg من المبايض المأخوذة من إناث من النمط البري بعمر 0–1 يوم للربط المتصالب بالأشعة فوق البنفسجية (3 × 2000 μJ/cm2)، ثم جرى تجنيسها على الثلج في 1 mL من محلول RCB المنظِّم (50 mM HEPES عند pH 7.4، و200 mM NaCl، و2.5 mM MgCl2، و0.1% Triton X-100، و250 mM سكروز، و1 mM DTT، و1× من مثبطات البروتياز Complete الخالية من EDTA، و1 mM PMSF) مضافًا إليه 300 U RNAseOUT، ووُضعت على الثلج لمدة 30 min. عُولج المجانس بالموجات فوق الصوتية على الثلج بقدرة 80%، خمس مرات على دفعات مدة كل منها 20 s، مع فترة راحة قدرها 60 s بينها، باستخدام معالج الموجات فوق الصوتية من Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) ، ثم أُخضع للطرد المركزي (16,000 × g لمدة 5 min عند 4°C). نُقِّي المستخلص القابل للذوبان مسبقًا باستخدام 20 μl من Protein-G dynabeads لمدة 20 min عند 4°C. وبعد سحب عينات لإجراء اللطخة المناعية والقياس الكمي لكمية RNA المُدخلة (1%)، رُسِّب HP1 مناعيًا باستخدام الجسم المضاد anti-HP1 9A9 من 450 μl من المستخلص المنقَّى مسبقًا، عن طريق التحضين لمدة 4 h مع 50 μl من Protein-G dynabeads. غُسلت الرواسب المناعية 4 مرات باستخدام RCB. ولإزاحة جزيئات RNA المترسِّبة مناعيًا، غُليت الخرزات المترسِّبة في 100 μL من ماء UltraPure المعالَج بـDEPC لمدة 5 min. وأُضيف 900 μL من كاشف Qiazol إلى السائل الطافي المسترجَع لتحضير RNA. واستُخدم RNA المنقَّى قالبًا لتخليق cDNA باستخدام oligo dT وسداسيات النوكليوتيد العشوائية وإنزيم النسخ العكسي SuperScript III وفقًا لبروتوكول الشركة المصنِّعة.
(Cassale et al. 2019)

التحلل بالموجات فوق الصوتية لاختبار الترسيب المناعي للكروماتين

أُجري الترسيب المناعي للكروماتين وفقًا للطريقة التي وصفها Menet مع تعديلات طفيفة. جرى تجنيس نحو 20 mg من المبايض المأخوذة من إناث من النمط البري بعمر 0–1 يوم في 1 mL من محلول NEB المنظِّم (10 mM HEPES-Na عند pH 8.0، و10 mM NaCl، و0.1 mM EGTA-Na عند pH 8، و0.5 mM EDTA-Na عند pH 8، و1 mM DTT، و0.5% NP-40، و0.5 mM سبيرميدين، و0.15 mM سبيرمين، و1× من مثبطات البروتياز Complete الخالية من EDTA) باستخدام مجانس / جهاز تشتيت بالغمر لمدة 1 min (عند 3000 rpm). نُقل المجانس إلى مجانس Dounce زجاجي مبرد مسبقًا، وأُجريت 15 حركة كاملة باستخدام مدقة محكمة الملاءمة. ثم أُخضعت النوى الحرة للطرد المركزي عند 6000xg لمدة 10 min عند 4°C. وأُعيد تعليق الرواسب المحتوية على النوى في 1 mL من NEB، وأُخضعت للطرد المركزي عند 20,000 × g لمدة 20 min على تدرج سكروز (0.65 mL من سكروز بتركيز 1.6 M في NEB، و0.35 mL من سكروز بتركيز 0.8 M في NEB). وأُعيد تعليق الراسب في 1 mL من NEB وفورمالديهايد بتركيز نهائي قدره 1%. أُخضعت النوى للربط المتصالب لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة، وأُوقف التفاعل بإضافة 1/10 vol من غليسين بتركيز 1.375 M. جُمعت النوى بالطرد المركزي عند 6000 × g لمدة 5 min. وغُسلت النوى مرتين في 1 mL من NEB، ثم أُعيد تعليقها في 1 mL من محلول التحلل المنظِّم (15 mM HEPES-Na عند pH 7.6، و140 mM NaCl، و0.5 mM EGTA، و1 mM EDTA عند pH 8، و1% Triton X-100، و0.5 mM DTT، و0.1% ديوكسيكولات الصوديوم، و0.1% SDS، و0.5% N-lauroylsarcosine، و1× من مثبطات البروتياز Complete الخالية من EDTA). عُولجت النوى بالموجات فوق الصوتية باستخدام معالج الموجات فوق الصوتية من Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) ست مرات، مع تشغيل لمدة 20 s ومدة 1 min على الثلج. أُخضعت النوى المعالَجة بالموجات فوق الصوتية للطرد المركزي عند 13,000 × g لمدة 4 min عند 4°C. وكان طول معظم الكروماتين المعالَج بالموجات فوق الصوتية يتراوح من 500 إلى 1000 زوج قاعدي (bp). ولكل عملية ترسيب مناعي، حُضِّن 15 μg من الكروماتين بوجود 10 μg من الجسم المضاد وحيد النسيلة HP1 9A9 (لمدة 3 h عند 4°C على عجلة دوارة). ثم أُضيف 50 μl من dynabeads protein G، واستمر التحضين طوال الليل عند 4°C. جرى التخلص من السوائل الطافية، وغُسلت العينات مرتين في محلول التحلل المنظِّم (كل غسلة لمدة 15 min عند 4 °C)، ومرتين في محلول TE المنظِّم (1 mM EDTA، و10 mM TrisHCl عند pH 8). أُزيح الكروماتين من الخرزات على خطوتين؛ أولًا في 100 μl من محلول الإزاحة المنظِّم 1 (10 mM EDTA، و1% SDS، و50 mM TrisHCl عند pH 8) عند 65°C لمدة 15 min، ثم أُجري الطرد المركزي واستُرجع السائل الطافي. وأُعيد استخلاص مادة الخرزات في 100 μl من TE + 0.67% SDS. وحُضِّنت حصيلة الإزاحة المجمَّعة (200 μl) طوال الليل عند 65°C لعكس الروابط المتصالبة، وعُولجت باستخدام 50 μg/ml RNaseA لمدة 15 min عند 65°C، وباستخدام 500 μg/ml Proteinase K لمدة 3 h عند 65°C. استُخلصت العينات بالفينول–الكلوروفورم، ورُسِّبت بالإيثانول. وأُعيد تعليق DNA في 25 μl من الماء. ولتعظيم التحليلات الجزيئية باستخدام DNA المترسِّب مناعيًا، ضُخِّمت الجينات المرشحة في أزواج باستخدام بروتوكول duplex-PCR مُحسَّن، وذلك باستعمال مجموعتين مختلفتين من البادئات لهما درجات حرارة انصهار متشابهة في تفاعل واحد.
(Casale et al. 2019)
 

أجهزة تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء للعينات البيولوجية

تُعد Hielscher Ultrasonics شريككم ذا الخبرة الطويلة في أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء لتفكيك الخلايا والتحلل واستخلاص البروتين وتجزئة DNA وRNA والكروماتين، وكذلك خطوات تحضير العينات الأخرى قبل التحليل. وتوفر Hielscher مجموعة شاملة من المجانسات المختبرية بالموجات فوق الصوتية ووحدات تحضير العينات، وتقدم الجهاز المثالي بالموجات فوق الصوتية لتطبيقكم البيولوجي ومتطلباتكم.
يُعد جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية التقليدي من نوع المسبار والمزوَّد بطرف دقيق، مثل UP200St (200W؛ انظر الصورة على اليسار)، أو إحدى وحدات تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية VialTweeter أو UP200ST_TD_CupHorn مع VialHolder، من الطرازات المفضلة في مختبرات البحث والتحليل. ويُعد المسبار التقليدي بالموجات فوق الصوتية مثاليًا عند الحاجة إلى تحلل عدد قليل من العينات أو استخلاصها أو تجزئتها. وتتيح وحدتا تحضير العينات VialTweeter وUP200St_TD_CupHorn المعالجة المتزامنة بالموجات فوق الصوتية لما يصل إلى 10 أو 5 قوارير، على التوالي.
وعند الحاجة إلى معالجة أعداد كبيرة من العينات (مثل الصفائح ذات 96 بئرًا وصفائح المعايرة الدقيقة وغيرها)، فإن UIP400MTP هو نظام المعالجة المثالي بالموجات فوق الصوتية. يعمل UIP400MTP مثل cuphorn أكبر حجمًا، يُملأ بالماء ويوفر مساحة كافية لاستيعاب صفائح الآبار الدقيقة. ويعمل UIP400MTP بمعالج موجات فوق صوتية قوي بقدرة 400 watts، ويوفر معالجة شديدة ومتجانسة للغاية بالموجات فوق الصوتية للصفائح متعددة الآبار بهدف تفكيك الخلايا أو تحلل العينات أو إذابة الرواسب أو استخلاص البروتينات أو قص DNA.

تحكم دقيق عبر برمجيات ذكية

جميع حلول المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher بقدرة 200 واط فما فوق مزودة بشاشة لمس رقمية ملونة وبرمجيات ذكية. ومن خلال التسجيل الذكي للبيانات، تُحفظ جميع معلمات العملية فوق الصوتية تلقائيًا في ملف CSV على بطاقة SD مدمجة بمجرد تشغيل جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية. ويجعل ذلك البحث والتوثيق أكثر سهولة بكثير. وبعد تجارب المعالجة بالموجات فوق الصوتية أو تحضير العينات، يمكنكم ببساطة مراجعة معلمات كل تشغيل للمعالجة بالموجات فوق الصوتية ومقارنتها.
ومن خلال القائمة سهلة الاستخدام، يمكن ضبط العديد من المعلمات مسبقًا قبل المعالجة بالموجات فوق الصوتية: مثلًا، للتحكم في درجة حرارة العينة ومنع تدهورها الحراري، يمكن تعيين حد أعلى لدرجة حرارة العينة. ويزوِّد مستشعر درجة حرارة قابل للتوصيل، يأتي مع وحدة الموجات فوق الصوتية، معالج الموجات فوق الصوتية بتغذية راجعة عن درجة الحرارة الفعلية أثناء المعالجة. وعند بلوغ الحد الأعلى لدرجة الحرارة، يتوقف جهاز الموجات فوق الصوتية مؤقتًا حتى بلوغ الحد الأدنى لفرق درجة الحرارة المحدد ∆T، ثم يبدأ المعالجة بالموجات فوق الصوتية مجددًا بصورة تلقائية.
وإذا كانت المعالجة بالموجات فوق الصوتية تتطلب إدخال مقدار محدد من الطاقة، فيمكنكم ضبط الطاقة فوق الصوتية النهائية لتشغيل المعالجة مسبقًا. وبالطبع، يمكن أيضًا ضبط النبضات فوق الصوتية ونمط الدورة كلٌّ على حدة.
ولإعادة استخدام أنجح معلمات المعالجة بالموجات فوق الصوتية لديكم، يمكنكم حفظ أنماط مختلفة للمعالجة (مثل مدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية وشدتها ونمط الدورة وغيرها) بوصفها أنماطًا محددة مسبقًا، بحيث يمكن تشغيلها مجددًا بسهولة وسرعة.
ولمزيد من سهولة التشغيل، يمكن تشغيل جميع وحدات الموجات فوق الصوتية الرقمية عبر التحكم عن بُعد بواسطة المتصفح في أي متصفح شائع (مثل InternetExplorer وSafari وChrome وغيرها). ويُعد اتصال LAN إعدادًا بسيطًا قائمًا على التوصيل والتشغيل، ولا يتطلب تثبيت برمجيات إضافية.
نعلم في Hielscher أن نجاح معالجة العينات البيولوجية بالموجات فوق الصوتية يتطلب الدقة وقابلية التكرار. ولذلك، صممنا أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية لدينا بوصفها أجهزة ذكية تتضمن جميع الميزات التي تتيح تحضير العينات بكفاءة وموثوقية وسهولة وبنتائج قابلة للتكرار.

يقدم الجدول أدناه مؤشرًا على قدرة المعالجة التقريبية لأنظمتنا بالموجات فوق الصوتية، بدءًا من الأطراف الدقيقة بالموجات فوق الصوتية والمجانسات التقليدية بالموجات فوق الصوتية، وصولًا إلى أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية MultiSample لتحضير العديد من العينات بسهولة وموثوقية: