Drosophila melanogaster يستخدم على نطاق واسع في المختبرات ككائن حي نموذجي. لذلك ، يجب أن يتم بشكل متكرر خطوات الإعداد قبل التحليل مثل التحلل ، واضطراب الخلايا ، واستخراج البروتين و القص الحمض النووي لعينات Drosophila melanogaster. dismembrators بالموجات فوق الصوتية هي موثوقة وفعالة ويمكن استخدامها لأداء مهام مختلفة مثل تحلل، استخراج البروتين أو تفتيت الحمض النووي في سهولة عن طريق ضبط فقط معلمات عملية الموجات فوق الصوتية. المجانسات بالموجات فوق الصوتية وبالتالي أدوات مرنة مع مجموعة واسعة من التطبيقات.

بالموجات فوق الصوتية Lysis والبروتين استخراج

تحلل، سولوبيلية الخلية، تجانس الأنسجة واستخراج البروتين هي المهام النموذجية لdismembrators بالموجات فوق الصوتية في المختبرات البيولوجية. DISMembrators بالموجات فوق الصوتية وتعطل الخلايا هي مناسبة تماما لتجانس الأنسجة الحيوانية، والحشرات (على سبيل المثال، Drosophila الميلانوغاستر، C. elegans) أو عينات النباتات. التطبيقات اللاحقة من ultrasonication هي تحلل من تعليق الخلايا والكريات وكذلك استخراج البروتينات داخل الخلايا.
التحلل بالموجات فوق الصوتية واستخراج البروتين هي عمليات موثوقة للغاية وقابلة للتكرار، والتي يمكن أن تؤدي على أساس البروتوكولات المعمول بها. منذ كثافة عملية الموجات فوق الصوتية يمكن تعديلها تماما عن طريق المعلمات sonication مثل السعة، دورة / وضع نبض، ودرجة الحرارة وحجم العينة، مرة واحدة ثبت يمكن تكرار البروتوكولات مع نفس النتيجة مرارا وتكرارا.

الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية والتفتيت RNA

بعد تحلل الخلايا واستخراج البروتين ، وهي خطوة شائعة مطلوبة في إعداد العينة هي القص وتفتيت الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والكروماتين ، على سبيل المثال قبل التحلل المناعي للكروماتين (ChIP). الحمض النووي والحمض النووي الريبي يمكن تحقيق موثوق بها عن طريق كسر الروابط التساهمية التي تعقد الحمض النووي معا من قبل القوى المادية. باستخدام القص المادي مثل sonication ، في البداية يتم كسر خيوط الحمض النووي ، ثم يتم تفتيت الحمض النووي إلى قطع أصغر.
تجزئة الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية هو موثوق بها وفعالة في القص الحمض النووي إلى طول المستهدفة، على سبيل المثال 500bp (أزواج قاعدة). المزايا الرئيسية لتفتيت الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية تشمل السيطرة الدقيقة على معلمات عملية الموجات فوق الصوتية وكثافة. يمكن تعديل معلمات عملية الموجات فوق الصوتية عن طريق ضبط كثافة سونيكيشن، دورات والوقت على وجه التحديد. وهذا يجعل من الممكن لخلق الأحجام المطلوبة الحمض النووي وال DNA طول المستهدفة يمكن أن تنتج بشكل موثوق وكذلك استنساخها. قطع الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية هو أيضا مثالية لخلق شظايا الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي.

بروتوكولات لتحلل بالموجات فوق الصوتية من drosophila melanogaster

أدناه يمكنك العثور على بروتوكولات مختلفة لتحلل بمساعدة الموجات فوق الصوتية, استخراج البروتين, وتفتيت الحمض النووي أو الكروماتين من عينات Drosophila.

التحلل بالموجات فوق الصوتية للربط عبر المناعي (كليب) فحص

تم إجراء فحص CLIP كما تم الإبلاغ عنه مسبقًا مع بعض التعديلات. ما يقرب من 20 ملغ مبايض من 0- إلى 1 يوم من العمر البرية من نوع الإناث كانت الأشعة فوق البنفسجية عبر (3 × 2000 μJ/cm2)، متجانسة على الجليد في 1 مل RCB العازلة (50 mM HEPES pH 7.4، 200 mM NaCl، 2.5 mM MgCl2، 0.1٪ تريتون X-100، 250 mM السكروز، 1 mM DTT، 1× مثبطات بروتياز كاملة خالية من EDTA، 1 mM PMSF) تكملها 300 URNAseOUT وتوضع على الجليد لمدة 30 دقيقة. وكان سونيكاتيد التجانس على الجليد، في 80٪ السلطة، خمس مرات في 20 رشقات نارية مع بقية 60 s في ما بين استخدام معالج الموجات فوق الصوتية Hielscher UP100H (100 واط، 30 كيلو هرتز) وطاردة (16000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية). تم اِدْلَ مستخلص قابل للذوبان مسبقًا مع 20 ميكرولتر بروتين-G dynabeads لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد إزالة العينات للمناعة وكمية من مدخلات الحمض النووي الريبي (1٪)، تم المناعية HP1 مع المضادة HP1 9A9 من 450 ميكرولتر استخراج مسبقة عن طريق الحضانة لمدة 4 ساعة مع 50 ميكرولتر بروتين-G dynabeads. تم غسلها المناعي 4 مرات مع RCB. إلى elute RNAs المناعة، تم غلي الخرز بيليه في 100 ميكرولتر من المياه المعالجة UltraPure DEPC لمدة 5 دقائق. تم إضافة 900 ميكرولتر تشيوزول كاشف إلى supernatant تعافى لإعداد RNA. وقد استخدم الحمض النووي الريبي تنقية كقالب لتجميع cDNA باستخدام oligo dT، الهيكسميرات العشوائية و SuperScript النسخ العكسي الثالث وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
(كاسالي وآخرون 2019)

التحلل بالموجات فوق الصوتية لChromatin الفحص المناعي

تم إجراء Chromatin المناعي وفقا للطريقة التي وصفتها Menet مع تعديلات طفيفة. تم تجانس ما يقرب من 20 ملغ مبايض من 0 - إلى 1 يوم من العمر من النوع البري للإناث في 1 مل من العازلة NEB (10 mM HEPES-Na في 8.0 ، 10 mM NaCl ، 0.1 mM EGTA -Na عند pH 8 ، 0.5 mM EDTA-Na عند مستوى الحموضة 8، 1 mM DTT، 0.5٪ NP-40، 0.5 mM Spermidine، 0.15 mM Spermine، 1× EDTA- مثبطات Protease كاملة خالية) مع مخالط التجانس / تشتت الغمر 1 دقيقة (عند 3000 دورة في الدقيقة). تم نقل المتجانس إلى دونسي الزجاج المبرد مسبقًا وتم تطبيق 15 ضربة كاملة مع حشرات ضيقة. ثم تم طرد النوى الحرة في 6000xg لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. وأعيد تعليق الكريات المحتوية على النيوكلي في 1 مل من NEB وتم طردها في 20000 × غرام لمدة 20 دقيقة على تدرج السكروز (0.65 مل من 1.6 M سكروز في NEB، 0.35 مل من 0.8 سكروز في NEB). تم إعادة تعليق بيليه في 1 مل من NEB والفورمالديهايد إلى تركيز نهائي من 1٪. كانت النوى عبر ربط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وإخمادها بإضافة 1/10 vol من 1.375 M جليسين. جمعت النوى بواسطة الطرد المركزي في 6000 × غرام لمدة 5 دقائق. تم غسلها النوى مرتين في 1 مل من NEB و resuspended في 1 مل من Lysis العازلة (15 mM HEPES-Na في 7.6، 140 mM NaCl، 0.5 mM EGTA، 1 mM EDTA عند الأسك 8، 1% تريتون X-100، 0.5 mM DTT، 0.1٪ Na Deoxycholate، 0.1٪ SDS، 0.5٪ N-lauroylsarcosine و 1× مثبطات Protease كاملة خالية من EDTA). كانت سونيكاتيد Nuclei باستخدام معالج Hielscher بالموجات فوق الصوتية UP100H (100 واط، 30 كيلو هرتز) ست مرات لمدة 20 s على و 1 دقيقة على الجليد. تم طرد نوى سونيكاتيد في 13000 × ز لمدة 4 دقائق في 4 درجة مئوية. وكان غالبية الكروماتين سونيكاتيد 500 إلى 1000 أزواج قاعدة (bp) في الطول. لكل من المناعي، 15 ميكروغرام من الكروماتين كان محتضنا في وجود 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة HP1 9A9 أحادية النسيلة (3 ح عند 4 درجة مئوية في عجلة دوارة). ثم، تمت إضافة 50 ميكرولتر من بروتين dynabeads G واستمر الاحتضان بين عشية وضحاها في 4°C. تم التخلص من المابس supernatants وتم غسل العينات مرتين في Lysis Buffer (كل غسل 15 دقيقة في 4 درجات مئوية) ومرتين في TE Buffer (1 mM EDTA ، 10 mM TrisHCl في درجة حرارة 8). وكان Chromatin مُلَد من الخرز في خطوتين؛ الأولى في 100 ميكرولتر من Eluition العازلة 1 (10 mM EDTA، 1٪ SDS، 50 mM TrisHCl في درجة الحرارة 8) في 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها الطرد المركزي والانتعاش من عظمى. تم إعادة استخراج المواد الخرز في 100 ميكرولتر من TE + 0.67٪ SDS. تم احتضان الـ eluate (200 ميكرولتر) بين عشية وضحاها عند 65 درجة مئوية لعكس الروابط المتقاطعة ومعالجتها بـ 50 ميكروغرام/مل RNaseA لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية وبـ 500 ميكروغرام/مل بروتيناتاز K لمدة 3 ساعات عند 65 درجة مئوية. وكانت العينات استخراج الفينول - الكلوروفورم والإيثانول العجل. تم إعادة تعليق الحمض النووي في 25 ميكرولتر من الماء. لتعظيم التحليلات الجزيئية مع الحمض النووي مناعية، تم تضخيم الجينات المرشحة في أزواج من خلال بروتوكول ثنائي ثنائي PCR الأمثل باستخدام مجموعتين مختلفتين من التمهيدية وجود درجات حرارة ذوبان مماثلة في رد فعل واحد.
(Casale وآخرون 2019)
 

عالية الأداء تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية لعينات البيولوجية

Hielscher الفوق صوتيات هو شريكك ذوي الخبرة الطويلة عندما يتعلق الأمر بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء لتعطيل الخلايا، تحلل، استخراج البروتين، الحمض النووي، RNA، وتفتيت الكروماتين، فضلا عن غيرها من خطوات إعداد عينة ما قبل التحليل. تقدم مجموعة شاملة من المهيجات مختبر بالموجات فوق الصوتية ووحدات إعداد العينة، Hielscher لديه جهاز الموجات فوق الصوتية المثالي للتطبيقات والمتطلبات البيولوجية الخاصة بك.
الكلاسيكية المسبار من نوع ultrasonicator مع تلميح صغير مثل UP200St (200W؛ انظر الصورة إلى اليسار) أو واحدة من وحدات إعداد عينة بالموجات فوق الصوتية VialTweeter أو UP200ST_TD_CupHorn مع VialHolder هي نماذج المفضلة في مختبرات البحوث والتحليل. مسبار الموجات فوق الصوتية الكلاسيكية مثالية، عند إعداد عينات أقل يجب أن يكون lysed، استخراج أو مجزأة. وحدات إعداد العينة VialTweeter UP200St_TD_CupHorn تسمح sonication في وقت واحد من ما يصل إلى 10 أو 5 قوارير، على التوالي.
إذا كان يجب معالجة أرقام العينات العالية (مثل 96-ألواح الآبار، ولوحات microtiter الخ) ، UIP400MTP هو الإعداد سونيكيشن المثالي. وظائف UIP400MTP مثل أكبر cuphorn، الذي هو مليئة بالماء ومساحة كافية لعقد لوحات صغيرة جيدا. مدعوم من معالج الموجات فوق الصوتية قوية 400 واط, وUIP400MTP يسلم سونيكيشن موحدة جدا ومكثفة من لوحات متعددة جيدا من أجل تعطيل الخلايا, عينات من الليزي, solubilize الكريات, استخراج البروتينات أو الحمض النووي القص.

التحكم الدقيق عبر البرامج الذكية

جميع حلول Hielscher sonication من 200 واط صعودا مجهزة بشاشة رقمية تعمل باللمس بالألوان وبرنامج ذكي. عبر البيانات الذكية protocolling يتم حفظ تلقائيا جميع المعلمات عملية بالموجات فوق الصوتية كملف CSV على بطاقة SD المدمج في أقرب وقت يتم تشغيل ultrasonicator. وهذا يجعل البحث والبروتوكول أكثر ملاءمة بكثير. بعد تجارب سونيكيشن أو إعداد العينة، يمكنك ببساطة مراجعة معلمات سونيكيشن لكل تشغيل sonication ومقارنتها.
عبر القائمة بديهية، يمكن أن تكون معلمة عديدة مسبقا قبل sonication: على سبيل المثال، للسيطرة على درجة الحرارة في العينة ومنع تدهور الحراري، يمكن تعيين الحد الأعلى من درجة حرارة العينة. جهاز استشعار درجة الحرارة للتوصيل، والذي يأتي مع وحدة الموجات فوق الصوتية، يعطي ردود فعل المعالج بالموجات فوق الصوتية على درجة حرارة سونيكيشن الفعلية. عندما يتم الوصول إلى الحد الأعلى لدرجة الحرارة، يتوقف جهاز الموجات فوق الصوتية حتى يتم الوصول إلى الحد الأدنى من مجموعة ∆T ويبدأ ثم sonicating تلقائيا مرة أخرى.
إذا كان المطلوب sonication مع مدخلات الطاقة محددة، يمكنك مسبقا الطاقة بالموجات فوق الصوتية النهائي لتشغيل sonication. بالطبع، يمكن تعيين نبض الموجات فوق الصوتية ووضع دورة بشكل فردي، أيضا.
لإعادة استخدام المعلمات سونيكيشن الأكثر نجاحا، يمكنك حفظ وسائط sonication المختلفة (مثل وقت sonication، وكثافة، ووضع دورة الخ) كما وضع مجموعة مسبقة، بحيث يمكن أن تكون سهلة وبدأت بسرعة مرة أخرى.
لمزيد من الراحة التشغيلية، يمكن تشغيل جميع وحدات الموجات فوق الصوتية الرقمية عن طريق جهاز التحكم عن بعد المتصفح في أي متصفح مشترك (على سبيل المثال، InternetExplorer، سفاري، كروم الخ). اتصال LAN هو إعداد بسيط plug-n-play ولا يتطلب أي تثبيت إضافي للبرامج.
نحن في Hielscher نعرف أن سونيكيشن ناجحة من العينات البيولوجية يتطلب الدقة والتكرار. لذلك، قمنا بتصميم أوفوق الموجات فوق الصوتية لدينا كأجهزة ذكية مع جميع الميزات التي تمكن إعداد عينة فعالة وموثوقة وقابلة للاستنساخ ومريحة.

الجدول أدناه يعطيك مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية للأنظمة بالموجات فوق الصوتية لدينا من الموجات فوق الصوتية الجزئية نصائح والتجانس الموجات فوق الصوتية الكلاسيكية لMulsSampleators لإعداد مريحة وموثوق بها من العديد من العينات: