خلية تحلل من خلايا BL21 بواسطة Ultrasonication
BL21 الخلايا للتعبير البروتين
BL21 خلية هي سلالة بكتيريا الإشريكية القولونية المختصة كيميائياً مناسبة للتحول وتعبير البروتين عالي المستوى باستخدام نظام تحريضي من نوع T7 RNA polymerase-IPTG. خلايا BL21 تسمح عالية الكفاءة تعبير البروتين من أي جين الذي هو تحت سيطرة المروج T7. سلالة القولونية BL21 (DE3) هي سلالة إنتاج البروتين القائمة على T7 RNA RNA protein productions مع ناقلات التعبير المستندة إلى T7 ويتم تطبيقها على نطاق واسع في المختبرات والصناعة لإنتاج البروتينات المؤتلفة. في BL21 (DE3)، يتم نسخ التعبير عن ترميز الجينات البروتين المؤتلف بواسطة بوليميراز T7 RNA المشفرة الكروموسومية (T7 RNAP)، الذي يُناقل ثماني مرات أسرع من الحمض التقليدي القولونية RNAP. وهذا يجعل سلالة BL21 (DE3) كفاءة عالية ويحول إلى واحدة من أكثر الأنظمة المفضلة خلية التعبير البروتين.
بروتوكول لتحلل بالموجات فوق الصوتية واستخراج البروتين من خلايا BL21
يتم إجراء معظم خلايا الخلايا BL21 باستخدام ultrasonication في تركيبة مع ساركوسينات لاورويل الصوديوم (المعروف أيضا باسم ساركوسيل) كما العازلة التحلل. مزايا انقطاع الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراج البروتين تكمن في الموثوقية، وإعادة التكاثر، فضلا عن عملية بسيطة وآمنة وسريعة من ultrasonicators. البروتوكول أدناه يعطي خطوة بخطوة الاتجاه لتحلل خلية بالموجات فوق الصوتية BL21:
تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية UP200St مع تلميح صغير S26d2 لتحلل واستخراج البروتين
- من أجل إزالة البروتينات مرافق، تم إعادة تعليق الكريات البكتيرية BL21 في 50 مل من الجليد البارد تريس EDTA (STE) العازلة (التي تتكون في 10 mM تريس-HCL، pH 8.0، 1 mM EDTA، 150 mM NaCl تكملها 100 mM PMSF).
- و، 500 ul من lysozyme (10 ملغ / مل) تضاف ويتم احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- بعد ذلك، 500 ul من DTT و 7 مل من الساركوسيل (10٪ (ث / الخامس) تتكون في المخزن المؤقت STE).
- من الضروري الحفاظ على جميع مخازن التنقية الجليد الباردة والحفاظ على العينات على الجليد في كل وقت. يجب أن يتم تنفيذ جميع خطوات التنقية في الغرفة الباردة إذا كان ذلك ممكنا.
- لتحلل بالموجات فوق الصوتية واستخراج البروتين، هي سونيكاتيد العينات في VialTweeter MultiSample Ultrasonicator لمدة 4 × 30 ثانية في 100٪ السعة مع فاصل 2 دقيقة بين كل صوتنة. بدلا من ذلك ، وهو مجس الموجات فوق الصوتية من نوع التحقيق مع تلميح صغير على سبيل المثال ، Uf200 ः ر مع S26d2 (3 × 30 ثانية، 2 دقيقة وقفة بين دورات الموجات فوق الصوتية، يمكن استخدام السعة 80٪).
- لمزيد من خطوات التنقية، يجب الاحتفاظ بالعينات على الجليد أو تخزينها بدلاً من ذلك عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
التحلل بالموجات فوق الصوتية تحت التحكم في درجة الحرارة Prescise
إن التحكم الدقيق والموثوق في درجة الحرارة أمر بالغ الأهمية عند التعامل مع العينات البيولوجية. ارتفاع درجات الحرارة بدء تدهور البروتين الناجم حراريا في العينات.
كما كل تقنيات إعداد العينة الميكانيكية، سونيكيشن يخلق الحرارة. ومع ذلك، يمكن التحكم في درجة حرارة العينات جيدا عند استخدام VialTweeter. نقدم لك خيارات مختلفة لرصد والتحكم في درجة حرارة العينات الخاصة بك أثناء إعدادها مع VialTweeter و VialPress للتحليل.
- مراقبة درجة حرارة العينة: المعالج بالموجات فوق الصوتية UP200St، الذي يقود VialTweeter، مجهز ببرنامج ذكي ومستشعر درجة حرارة قابل للتوصيل. قم بتوصيل مستشعر درجة الحرارة في UP200St وأدخل طرف مستشعر درجة الحرارة في أحد أنابيب العينة. عبر الرقمية الملونة لمس الشاشة، يمكنك تعيين في القائمة من UP200St مجموعة درجة حرارة محددة ل sonication العينة الخاصة بك. سوف يتوقف أوب أوبساتاتوراتور تلقائيا عندما يتم التوصل إلى درجة الحرارة القصوى ووقفة حتى درجة حرارة العينة وصولا الى القيمة المنخفضة لدرجة الحرارة المحددة ∆. ثم يبدأ صوتنة تلقائيا مرة أخرى. هذه الميزة الذكية تمنع التحلل الناجم عن الحرارة.
- يمكن تبريد كتلة VialTweeter مسبقًا. وضع كتلة VialTweeter (فقط سونوترودي دون محول!) في الثلاجة أو الفريزر لتبريد ما قبل كتلة التيتانيوم يساعد على تأجيل ارتفاع درجة الحرارة في العينة. إذا كان ذلك ممكنا، يمكن أن تكون العينة نفسها قبل تبريد جدا.
- استخدام الثلج الجاف لتبرد أثناء سونيكيشن. استخدام علبة ضحلة مليئة بالجليد الجاف ووضع VialTweeter على الجليد بحيث يمكن أن تتبدد الحرارة بسرعة.
يستخدم العملاء في جميع أنحاء العالم VialTweeter و VialPress لعمل إعداد العينات اليومي في المختبرات البيولوجية والكيميائية الحيوية والطبية والسريرية. البرنامج الذكي والتحكم في درجة الحرارة من المعالج UP200St، يتم التحكم في درجة الحرارة بشكل موثوق وتجنب تدهور العينة الناجم عن الحرارة. إعداد عينة بالموجات فوق الصوتية مع VialTweeter و VialPress يسلم نتائج موثوقة للغاية وقابلة للتكرار!
العثور على تعطيل الموجات فوق الصوتية الأمثل لتطبيق Lysis الخاص بك
Hielscher الفوق صوتيات منذ فترة طويلة من ذوي الخبرة الشركة المصنعة لتعطل الخلايا بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء والتجانس للمختبرات ، مقاعد البدلاء ، وأنظمة النطاق الصناعي. حجم ثقافة الخلية البكتيرية الخاصة بك، والبحث أو الهدف الإنتاج وحجم الخلية لمعالجة في الساعة أو اليوم هي العوامل الأساسية للعثور على الحق تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية للتطبيق الخاص بك.
Hielscher الفوق صوتيات يقدم حلولا مختلفة ل sonication في وقت واحد من عينات متعددة (ما يصل الى 10 قارورة مع VialTweeter) وعينات الكتلة (أي ، لوحات microtiter / لوحات ELISA مع UIP400MTP)، وكذلك الأوفوقات المعمل من نوع التحقيق الكلاسيكي مع مستويات مختلفة من الطاقة من 50 إلى 400 واط لمعالجات الموجات فوق الصوتية الصناعية بالكامل مع ما يصل إلى 16،000watts لكل وحدة لتعطيل الخلايا التجارية واستخراج البروتين في الإنتاج الكبير. بنيت جميع الموجات فوق الصوتية Hielscher ل 24/7/365 عملية تحت حمولة كاملة. المتانة والموثوقية هي السمات الأساسية لأجهزة الموجات فوق الصوتية لدينا.
وقد تم تجهيز جميع المجانسات بالموجات فوق الصوتية الرقمية مع البرامج الذكية، وشاشة لمس الملونة و protocolling البيانات التلقائي، والتي تجعل الجهاز بالموجات فوق الصوتية في أداة عمل مريحة في المختبر ومرافق الإنتاج.
اسمحوا لنا أن نعرف، أي نوع من الخلايا، ما حجم، مع ما تردد ومع ما هو الهدف لديك لمعالجة العينات البيولوجية الخاصة بك. سوف نوصي لك تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية الأكثر ملاءمة لمتطلبات العملية الخاصة بك.
الجدول أدناه يعطيك مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية للأنظمة بالموجات فوق الصوتية لدينا من التجانس المحمولة باليد المدمجة ومتعددة Ultrasonicators إلى المعالجات بالموجات فوق الصوتية الصناعية للتطبيقات التجارية:
| دفعة حجم | معدل المد و الجزر | الأجهزة الموصى بها |
|---|---|---|
| 96-جيدا / لوحات microtiter | زمالة المدمنين المجهولين | UIP400MTP |
| 10 قنينات à 0.5 إلى 1.5mL | زمالة المدمنين المجهولين | VialTweeter في UP200St |
| 00.01 إلى 250 ملل | 5 إلى 100 مل/دقيقة | UP50H |
| 00.01 إلى 500 مل | 10 إلى 200ML / دقيقة | UP100H |
| 10 إلى 2000ML | 20 إلى 400ML / دقيقة | Uf200 ः ر، UP400St |
| 00.1 إلى 20L | 00.2 إلى 4L / دقيقة | UIP2000hdT |
| 10 إلى 100L | 2 إلى 10L / دقيقة | UIP4000hdT |
| زمالة المدمنين المجهولين | 10 إلى 100L / دقيقة | UIP16000 |
| زمالة المدمنين المجهولين | أكبر | مجموعة من UIP16000 |
اتصل بنا! / اسألنا!
أوبومنتالتور Uf200 ः ر مع 2mm microtip S26d2 ل sonication من عينات صغيرة
الأدب / المراجع
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
حقائق تستحق العلم
بكتيريا إيشريشيا كولي
Escherichia القولونية هو نوع من البكتيريا، وهذا هو غير بوغ تشكيل، غرام السلبية وتتميز بشكلها من قضيب مستقيم. البكتيريا القولونية موجودة في البيئة والأطعمة والأمعاء من البشر والحيوانات. الإشريكية القولونية عادة ما تكون مُتَلَكّية باستخدام flagella peritrichous، ولكن هناك أنواع غير مُتَمَلَة، أيضاً. الإشريكية القولونية هي ما يسمى بالكائنات الحية الكيميورجانوتروبية اللاهوائية، مما يعني أنها قادرة على كل من التمثيل الغذائي التنفسي والتخمير. معظم أنواع الإشريكية القولونية حميدة وتؤدي وظائف مفيدة في الجسم، على سبيل المثال قمع نمو الأنواع البكتيرية الضارة، وتركيب الفيتامينات وما إلى ذلك.
Escherichia كولاي البكتيريا الخلية من ما يسمى نوع B هي فئة خاصة من سلالات القولونية E.coli، والتي تستخدم على نطاق واسع في البحوث للتحقيق في آليات مثل حساسية البكتيريا أو أنظمة تقييد التعديل. وعلاوة على ذلك، تقدر بكتيريا الإشريكية القولونية كحصان عمل موثوق للتعبير عن البروتين في التكنولوجيا الحيوية ومختبرات علوم الحياة. على سبيل المثال، يتم استخدام الإشريكية القولونية لتجميع مركبات مثل البروتينات وأوليجوساكشاريدات على النطاق الصناعي. بسبب ميزات محددة مثل نقص البروتياز، وانخفاض إنتاج خلات على مستوى عال من الجلوكوز، وتعزيز نفاذية، E. القولونية B الخلايا هي انه الأكثر استخداما الخلايا المضيفة لإنتاج البروتينات المعدلة وراثيا.
بروتين المؤتلف
تكتسب البروتينات المؤتلفة (rProt) أهمية كبيرة في الفروع المتعددة، بما في ذلك في الإنتاج الكيميائي، والصيدلة، ومستحضرات التجميل، والطب البشري والحيواني، والزراعة، والأغذية، فضلا عن الصناعات معالجة النفايات.
يتطلب إنتاج البروتين المؤتلف استخدام نظام التعبير. كما التعبير عن نظم الخلايا لإنتاج الحمض النووي المؤتلف، يمكن استخدام خلايا كل من prokaryotic والخلايا النواة. في حين أن الخلايا البكتيرية هي الأكثر استخداما للتعبير عن البروتين بسبب عوامل مثل منخفضة التكلفة، وسهولة التوسع وظروف وسائل الإعلام بسيطة، الثدييات والخميرة والطحالب والحشرات والخلايا النظم المحددة بدائل. نوع البروتين، والنشاط الوظيفي، فضلا عن العائد المطلوب من البروتين أعرب عن تأثير على اختيار نظام الخلايا المستخدمة للتعبير البروتين.
من أجل التعبير عن البروتين المؤتلف ، يجب أن تكون خلية معينة مصابة بمتجه الحمض النووي يحتوي على قالب الحمض النووي المؤتلف. الخلايا التي يتم transfected مع القالب ثم مثقف. ونتيجة للآلية الخلوية، تقوم الخلايا بتدوين وترجمة البروتين الذي يهمها، وبالتالي إنتاج البروتين المستهدف.
كما هي مصيدة البروتينات أعرب في المصفوفة الخلوية، يجب أن تكون الخلية lysed (تعطلت وكسر) للافراج عن البروتينات. في خطوة تنقية لاحقة، يتم فصل البروتين وتنقيته.
وكان أول البروتين المؤتلف المستخدمة في العلاج الأنسولين البشري المؤتلف في عام 1982. اليوم، يتم إنتاج أكثر من 170 نوعا من البروتين المؤتلف في جميع أنحاء العالم للعلاجات الطبية. البروتينات المؤتلفة المستخدمة في الطب هي على سبيل المثال الهرمونات المؤتلفة، إنترفيرونات، interleukins، وعوامل النمو، وعوامل نخر الورم، وعوامل تخثر الدم، والأدوية تجلط الدم، والإنزيمات لعلاج الأمراض الرئيسية مثل مرض السكري، والقزامة، واحتشاء عضلة القلب، وفشل القلب الاحتقاني، apoplexy الدماغي، التصلب المتعدد، العدلات، الجلطات الدموية، فقر الدم، التهاب الكبد، التهاب المفاصل الروماتويدي، الربو، مرض كرون، وعلاجات السرطان. (راجع Phuc V. Pham، في شركة أوميكس تكنولوجيز والهندسة الحيوية، 2018)
الفوق صوتيات عالية الأداء! تغطي مجموعة منتجات Hielscher الطيف الكامل من جهاز ultrasonicator مختبر مدمج فوق وحدات مقاعد البدلاء إلى أنظمة الموجات فوق الصوتية الصناعية الكاملة.