تحلل خلايا BL21 بالموجات فوق الصوتية

خلايا BL21 هي سلالة من E. coli تُستخدم على نطاق واسع في المختبرات البحثية والتكنولوجيا الحيوية والإنتاج الصناعي لقدرتها على التعبير عن البروتينات بكفاءة عالية جدًا. ويُعد تفكيك الخلايا وتحللها واستخلاص البروتينات بالموجات فوق الصوتية الطريقة الشائعة لعزل البروتينات المستهدفة وجمعها من داخل خلايا BL21. وتُفكك المعالجة بالموجات فوق الصوتية الخلية بالكامل وتُحرر جميع البروتينات المحتجزة، مما يجعل 100% من البروتين متاحًا.

خلايا BL21 للتعبير عن البروتينات

خلايا BL21 هي سلالة بكتيرية من E. coli ذات كفاءة كيميائية لاستقبال الحمض النووي، وهي مناسبة للتحول الوراثي والتعبير عن البروتينات بمستويات عالية باستخدام نظام تحريض يعتمد على بوليميراز RNA من نوع T7 وIPTG. وتتيح خلايا BL21 التعبير بكفاءة عالية عن البروتين الذي يشفره أي جين يخضع لتحكم محفز T7. وسلالة E. coli المسماة BL21(DE3) هي سلالة لإنتاج البروتين تعتمد على بوليميراز RNA من نوع T7، وتُستخدم مع نواقل تعبير تعتمد على محفز T7، وتُطبق على نطاق واسع في المختبرات والصناعة لإنتاج البروتينات المؤتلفة. وفي BL21(DE3)، يُنسخ التعبير عن الجين المشفر للبروتين المؤتلف بواسطة بوليميراز RNA من نوع T7 المشفر كروموسوميًا (T7 RNAP)، الذي ينسخ بسرعة تفوق سرعة RNAP التقليدي في E. coli بثماني مرات. وهذا يجعل سلالة BL21(DE3) عالية الكفاءة ويجعلها أحد أكثر الأنظمة الخلوية تفضيلًا للتعبير عن البروتينات.

بروتوكول التحلل بالموجات فوق الصوتية واستخلاص البروتينات من خلايا BL21

يُجرى تحلل خلايا BL21 غالبًا باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية مع لورويل ساركوسينات الصوديوم (المعروف أيضًا باسم ساركوسيل) بوصفه محلولًا منظمًا للتحلل. وتتمثل مزايا تفكيك الخلايا واستخلاص البروتينات بالموجات فوق الصوتية في الموثوقية وقابلية تكرار النتائج، فضلًا عن سهولة تشغيل أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية وأمانه وسرعته. ويقدم البروتوكول التالي إرشادات خطوة بخطوة لتحلل خلايا BL21 بالموجات فوق الصوتية:

• لإزالة البروتينات المرافقة، أُعيد تعليق رواسب بكتيريا BL21 في 50 ml من محلول الصوديوم Tris-EDTA المنظم (STE) المبرد إلى درجة حرارة الثلج (ويتكون من 10 mM من Tris-HCL، وpH 8.0، و1 mM من EDTA، و150 mM من NaCl، مع إضافة 100 mM من PMSF).
• ثم تُضاف 500 ul من الليزوزيم (10 mg/ ml) وتُحضن الخلايا على الثلج لمدة 15 min.
• بعد ذلك، تُضاف 500 ul من DTT و7 ml من ساركوسيل (10% (w/v) محضر في محلول STE المنظم).
• من الضروري إبقاء جميع المحاليل المنظمة المستخدمة للتنقية مبردة إلى درجة حرارة الثلج، وإبقاء العينات على الثلج طوال الوقت. ويجب إجراء جميع خطوات التنقية في غرفة باردة إن أمكن.



• لإجراء التحلل بالموجات فوق الصوتية واستخلاص البروتينات، تُعالج العينات بالموجات فوق الصوتية في جهاز VialTweeter للمعالجة بالموجات فوق الصوتية لعينات متعددة لمدة 4 x 30 sec بسعة اهتزاز 100%، مع فاصل زمني قدره 2 min بين كل معالجة بالموجات فوق الصوتية وأخرى. وبدلًا من ذلك، يمكن استخدام مجانس بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار مزود بطرف دقيق، مثل UP200Ht مع S26d2 (3 x 30 sec، وفترة توقف قدرها 2 min. بين دورات الموجات فوق الصوتية، وسعة اهتزاز 80%).
• لإجراء خطوات التنقية اللاحقة، يجب إبقاء العينات على الثلج أو تخزينها بدلًا من ذلك عند -80°C حتى إجراء المعالجة اللاحقة.

التحلل بالموجات فوق الصوتية مع تحكم دقيق في درجة الحرارة

يُعد التحكم الدقيق والموثوق في درجة الحرارة أمرًا بالغ الأهمية عند التعامل مع العينات البيولوجية. وتؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى بدء تحلل البروتينات بفعل الحرارة في العينات.
وكما هو الحال مع جميع تقنيات تحضير العينات الميكانيكية، تولد المعالجة بالموجات فوق الصوتية حرارة. ومع ذلك، يمكن التحكم جيدًا في درجة حرارة العينات عند استخدام VialTweeter. ونقدم لكم خيارات متنوعة لمراقبة درجة حرارة عيناتكم والتحكم فيها أثناء تحضيرها باستخدام VialTweeter وVialPress للتحليل.

1. مراقبة درجة حرارة العينة: إن معالج الموجات فوق الصوتية UP200St، الذي يشغل VialTweeter، مزود ببرنامج ذكي ومستشعر درجة حرارة قابل للتوصيل. وصّل مستشعر درجة الحرارة بجهاز UP200St وأدخل طرف المستشعر في أحد أنابيب العينات. ومن خلال شاشة اللمس الرقمية الملونة، يمكنك تحديد نطاق معين لدرجة الحرارة لمعالجة عينتك بالموجات فوق الصوتية في قائمة UP200St. وسيتوقف جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية تلقائيًا عند بلوغ درجة الحرارة القصوى، ويظل متوقفًا حتى تنخفض درجة حرارة العينة إلى القيمة الدنيا لدرجة الحرارة المضبوطة ∆. ثم تبدأ المعالجة بالموجات فوق الصوتية تلقائيًا من جديد. وتمنع هذه الميزة الذكية التحلل الناجم عن الحرارة.
2. يمكن تبريد كتلة VialTweeter مسبقًا. ضع كتلة VialTweeter (السونوترود فقط دون محول الطاقة!) في الثلاجة أو المجمد لتبريد كتلة التيتانيوم مسبقًا، مما يساعد على تأخير ارتفاع درجة حرارة العينة. ويمكن أيضًا تبريد العينة نفسها مسبقًا إن أمكن.
3. استخدم الثلج الجاف للتبريد أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية. واستخدم صينية ضحلة مملوءة بالثلج الجاف، وضع VialTweeter على الثلج حتى تتبدد الحرارة بسرعة.

يستخدم العملاء في جميع أنحاء العالم VialTweeter وVialPress في أعمال تحضير العينات اليومية في مختبرات علم الأحياء والكيمياء الحيوية والمختبرات الطبية والسريرية. وبفضل البرنامج الذكي والتحكم في درجة الحرارة في المعالج UP200St، يجري التحكم في درجة الحرارة بشكل موثوق وتجنب تحلل العينات الناجم عن الحرارة. ويقدم تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية باستخدام VialTweeter وVialPress نتائج عالية الموثوقية وقابلة للتكرار!
 

اعثر على جهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية الأمثل لتطبيق التحلل لديك

تتمتع Hielscher Ultrasonics بخبرة طويلة في تصنيع أجهزة تفكيك الخلايا والمجانسات بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء للمختبرات والأنظمة المنضدية والأنظمة على النطاق الصناعي. ويُعد حجم مزرعة الخلايا البكتيرية لديك، وهدفك البحثي أو الإنتاجي، وحجم الخلايا المطلوب معالجتها في الساعة أو اليوم عوامل أساسية لاختيار جهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية المناسب لتطبيقك.
تقدم Hielscher Ultrasonics حلولًا متنوعة للمعالجة المتزامنة بالموجات فوق الصوتية لعينات متعددة (حتى 10 قوارير باستخدام VialTweeter) ولأعداد كبيرة من العينات (أي ألواح المعايرة الدقيقة / ألواح ELISA باستخدام UIP400MTP)، فضلًا عن جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية المختبري التقليدي من نوع المسبار بمستويات قدرة مختلفة من 50 إلى 400 واط، وصولًا إلى معالجات الموجات فوق الصوتية الصناعية بالكامل بقدرة تصل إلى 16,000 واط لكل وحدة لتفكيك الخلايا واستخلاص البروتينات تجاريًا في الإنتاج واسع النطاق. وجميع أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher مصممة للتشغيل بنظام 24/7/365 تحت الحمل الكامل. وتُعد المتانة والموثوقية من السمات الأساسية لأجهزتنا بالموجات فوق الصوتية.
جميع المجانسات الرقمية بالموجات فوق الصوتية مزودة ببرنامج ذكي وشاشة لمس ملونة وتسجيل تلقائي للبيانات، مما يجعل جهاز الموجات فوق الصوتية أداة عمل مريحة في المختبرات ومنشآت الإنتاج.
أخبرنا بنوع الخلايا وحجم العينات البيولوجية التي تحتاج إلى معالجتها، ووتيرة المعالجة وهدفها. وسنوصي لك بجهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية الأنسب لمتطلبات عمليتك.

يقدم الجدول أدناه مؤشرًا على القدرة التقريبية لمعالجة العينات لأنظمتنا بالموجات فوق الصوتية، بدءًا من المجانسات المدمجة المحمولة باليد وأجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية لعينات متعددة، وصولًا إلى معالجات الموجات فوق الصوتية الصناعية للتطبيقات التجارية:

المؤلفات / المراجع

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.