تحلل الخلية من خلايا BL21 عن طريق الموجات فوق الصوتية
خلايا BL21 هي سلالة من الإشريكية القولونية تستخدم على نطاق واسع في مختبرات الأبحاث والتكنولوجيا الحيوية والإنتاج الصناعي نظرا لقدرتها على التعبير عن البروتينات بكفاءة عالية. يعد تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية والتحلل واستخراج البروتين الطريقة الشائعة لعزل وجمع البروتينات المستهدفة من الداخل الخلوي لخلايا BL21. الموجات فوق الصوتية يعطل الخلية تماما ويطلق جميع البروتينات المحاصرة ، مما يجعل 100 ٪ من البروتين المتاحة.
خلايا BL21 للتعبير عن البروتين
خلية BL21 هي سلالة بكتيرية من الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا ومناسبة للتحويل والتعبير البروتيني عالي المستوى باستخدام نظام تحريض T7 RNA polymerase-IPTG. تسمح خلايا BL21 بالتعبير البروتيني عالي الكفاءة لأي جين يخضع لسيطرة مروج T7. سلالة الإشريكية القولونية BL21 (DE3) هي سلالة إنتاج بروتين تعتمد على بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 جنبا إلى جنب مع ناقلات التعبير القائمة على محفز T7 ويتم تطبيقها على نطاق واسع في المختبرات والصناعة لإنتاج البروتينات المؤتلفة. في BL21 (DE3) ، يتم نسخ التعبير عن الجين الذي يشفر البروتين المؤتلف بواسطة بوليميراز T7 RNA المشفر كروموسوميا (T7 RNAP) ، والذي ينسخ ثماني مرات أسرع من E. coli RNAP التقليدي. هذا يجعل السلالة BL21 (DE3) عالية الكفاءة ويحولها إلى واحدة من أكثر أنظمة خلايا التعبير عن البروتين المفضلة.
بروتوكول التحلل بالموجات فوق الصوتية واستخراج البروتين من خلايا BL21
يتم تنفيذ تحلل الخلايا من خلايا BL21 في الغالب باستخدام الموجات فوق الصوتية في تركيبة مع الصوديوم لورويل ساركوسينات (المعروف أيضا باسم ساركوسيل) كما العازلة التحلل. تكمن مزايا تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراج البروتين في الموثوقية والتكاثر وكذلك التشغيل البسيط والآمن والسريع للموجات فوق الصوتية. يعطي البروتوكول أدناه اتجاها خطوة بخطوة لتحلل خلية BL21 بالموجات فوق الصوتية:
- من أجل إزالة بروتينات chaperone ، تم إعادة تعليق الكريات البكتيرية BL21 في 50 مل من المخزن المؤقت Sodium Tris-EDTA (STE) البارد (يتكون من 10 mM Tris-HCL ، pH 8.0 ، 1 mM EDTA ، 150 mM NaCl مع 100 mM PMSF).
- يتم إضافة 500 ميكرولتر من الليزوزيم (10 ملغ / مل) ويتم تحضين الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- بعد ذلك ، يتم إضافة 500 ul من DTT و 7 مل من sarkosyl (10٪ (w / v) تتكون في المخزن المؤقت STE).
- من الضروري الحفاظ على برودة جميع مخازن التنقية والحفاظ على العينات على الجليد طوال الوقت. يجب تنفيذ جميع خطوات التنقية في الغرفة الباردة إن أمكن.
- للتحلل بالموجات فوق الصوتية واستخراج البروتين ، يتم صوتنة العينات في VialTweeter متعدد العينات بالموجات فوق الصوتية لمدة 4 × 30 ثانية بسعة 100٪ مع فاصل زمني 2 دقيقة بين كل صوتنة. بدلا من ذلك ، الخالط بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار مع طرف دقيق على سبيل المثال ، UP200Ht مع S26d2 (3 × 30 ثانية ، 2 دقيقة وقفة بين دورات الموجات فوق الصوتية ، سعة 80٪) يمكن استخدامها.
- لمزيد من خطوات التنقية ، يجب حفظ العينات على الثلج أو تخزينها بدلا من ذلك في -80 درجة مئوية حتى تتم المعالجة الإضافية.
تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية UP200St مع طرف دقيق S26d2 للتحلل واستخراج البروتين
تحلل بالموجات فوق الصوتية تحت التحكم في درجة الحرارة Prescise
يعد التحكم الدقيق والموثوق في درجة الحرارة أمرا بالغ الأهمية عند التعامل مع العينات البيولوجية. تؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى تدهور البروتين الناجم عن الحرارة في العينات.
مثل جميع تقنيات تحضير العينات الميكانيكية ، فإن صوتنة يخلق الحرارة. ومع ذلك ، يمكن التحكم في درجة حرارة العينات بشكل جيد عند استخدام VialTweeter. نقدم لك خيارات متنوعة لمراقبة درجة حرارة عيناتك والتحكم فيها أثناء إعدادها باستخدام VialTweeter و VialPress للتحليل.
- مراقبة درجة حرارة العينة: تم تجهيز المعالج بالموجات فوق الصوتية UP200St ، الذي يقود VialTweeter ، ببرنامج ذكي ومستشعر درجة حرارة قابل للتوصيل. قم بتوصيل مستشعر درجة الحرارة ب UP200St وأدخل طرف مستشعر درجة الحرارة في أحد أنابيب العينة. عبر شاشة رقمية ملونة تعمل باللمس ، يمكنك ضبط نطاق درجة حرارة محدد في قائمة UP200St لصوتنة عينتك. سيتوقف جهاز الموجات فوق الصوتية تلقائيا عند الوصول إلى درجة الحرارة القصوى ويتوقف مؤقتا حتى تنخفض درجة حرارة العينة إلى القيمة الأقل ل ∆ درجة الحرارة المحددة. ثم يبدأ صوتنة تلقائيا مرة أخرى. تمنع هذه الميزة الذكية التدهور الناجم عن الحرارة.
- يمكن تبريد كتلة VialTweeter مسبقا. ضع كتلة VialTweeter (فقط sonotrode بدون محول الطاقة!) في الثلاجة أو الفريزر لتبريد كتلة التيتانيوم مسبقا يساعد على تأجيل ارتفاع درجة الحرارة في العينة. إذا أمكن ، يمكن تبريد العينة نفسها مسبقا أيضا.
- استخدم الثلج الجاف ليبرد أثناء صوتنة. استخدم صينية ضحلة مملوءة بالثلج الجاف وضع VialTweeter على الثلج حتى تتبدد الحرارة بسرعة.
يستخدم العملاء في جميع أنحاء العالم VialTweeter و VialPress لعملهم اليومي في إعداد العينات في المختبرات البيولوجية والكيميائية الحيوية والطبية والسريرية. البرنامج الذكي والتحكم في درجة الحرارة لمعالج UP200St ، يتم التحكم في درجة الحرارة بشكل موثوق وتجنب تدهور العينات الناجم عن الحرارة. إعداد عينة بالموجات فوق الصوتية مع VialTweeter و VialPress يوفر نتائج موثوقة للغاية وقابلة للتكرار!
العثور على المعطل بالموجات فوق الصوتية الأمثل لتطبيق Lysis الخاص بك
Hielscher Ultrasonics هي الشركة المصنعة ذات الخبرة منذ فترة طويلة من المعرقلين الخلايا بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء والمجانسات للمختبرات ، مقاعد البدلاء وأنظمة النطاق الصناعي. يعد حجم زراعة الخلايا البكتيرية وهدف البحث أو الإنتاج وحجم الخلية المراد معالجتها في الساعة أو اليوم من العوامل الأساسية للعثور على معطل الخلايا بالموجات فوق الصوتية المناسب لتطبيقك.
Hielscher الموجات فوق الصوتية تقدم حلولا مختلفة لصوتنة في وقت واحد من عينات متعددة (ما يصل إلى 10 قوارير مع VialTweeter) وعينات الكتلة (أي لوحات microtiter / لوحات ELISA مع UIP400MTP)، فضلا عن الموجات فوق الصوتية مختبر من نوع التحقيق الكلاسيكية مع مستويات الطاقة المختلفة من 50 إلى 400 واط إلى المعالجات بالموجات فوق الصوتية الصناعية بالكامل مع ما يصل إلى 16000 واط لكل وحدة لتعطيل الخلايا التجارية واستخراج البروتين في الإنتاج الكبير. تم بناء جميع الموجات فوق الصوتية Hielscher لعملية 24/7/365 تحت حمولة كاملة. المتانة والموثوقية هي السمات الأساسية لأجهزتنا بالموجات فوق الصوتية.
تم تجهيز جميع المجانسات الرقمية بالموجات فوق الصوتية ببرامج ذكية وشاشة ملونة تعمل باللمس وبروتوكول تلقائي للبيانات ، مما يجعل جهاز الموجات فوق الصوتية أداة عمل مريحة في مرافق المختبر والإنتاج.
أخبرنا ، أي نوع من الخلايا ، ما الحجم ، بأي تردد وبأي هدف لديك لمعالجة عيناتك البيولوجية. سوف نوصيك بأنسب معطل للخلايا بالموجات فوق الصوتية لمتطلبات العملية الخاصة بك.
يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأنظمتنا بالموجات فوق الصوتية من المجانسات المدمجة المحمولة باليد وأجهزة الموجات فوق الصوتية متعددة العينات إلى المعالجات بالموجات فوق الصوتية الصناعية للتطبيقات التجارية:
| حجم الدفعة | معدل التدفق | الأجهزة الموصى بها |
|---|---|---|
| 96 بئر / لوحات عيار دقيق | ن.أ. | UIP400MTP |
| 10 قوارير à 0.5 إلى 1.5 مل | ن.أ. | VialTweeter في UP200St |
| 0.01 إلى 250 مل | 5 إلى 100 مل / دقيقة | UP50H |
| 0.01 إلى 500 مل | 10 إلى 200 مل / دقيقة | UP100H |
| 10 إلى 2000 مل | 20 إلى 400 مل / دقيقة | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 إلى 20 لتر | 0.2 إلى 4 لتر / دقيقة | UIP2000hdT |
| 10 إلى 100 لتر | 2 إلى 10 لتر / دقيقة | UIP4000hdT |
| ن.أ. | 10 إلى 100 لتر / دقيقة | UIP16000 |
| ن.أ. | أكبر | مجموعة من UIP16000 |
اتصل بنا! / اسألنا!
UIP400MTP لوحة صوتي لتعطيل الخلايا عالية الإنتاجية في لوحات 96 بئرا
الموجات فوق الصوتية UP200Ht مع 2mm microtip S26d2 لصوتنة العينات الصغيرة
اقرأ المزيد حول كيفية استخدام خالط الأنسجة بالموجات فوق الصوتية لإعداد فعال وموثوق للحلول العازلة!
حقائق تستحق المعرفة
بكتيريا الإشريكية القولونية
الإشريكية القولونية هي نوع من البكتيريا ، وهي غير مكونة للجراثيم ، سالبة الجرام وتتميز بشكلها من قضيب مستقيم. توجد بكتيريا E.coli في البيئة والأطعمة والأمعاء للإنسان. عادة ما تكون الإشريكية القولونية متحركة باستخدام سوط peritrichous ، ولكن هناك أنواع غير متحركة أيضا. E.coli هي ما يسمى الكائنات الكيميائية اللاهوائية التغذية الاختيارية ، مما يعني أنها قادرة على كل من التمثيل الغذائي التنفسي والتخمير. معظم أنواع الإشريكية القولونية حميدة وتؤدي وظائف مفيدة في الجسم ، مثل قمع نمو الأنواع البكتيرية الضارة ، وتوليف الفيتامينات وما إلى ذلك.
خلية بكتيريا الإشريكية القولونية من النوع B المزعوم هي فئة خاصة من سلالات E.coli ، والتي تستخدم على نطاق واسع في البحث للتحقيق في آليات مثل حساسية البكتيريا أو أنظمة تعديل التقييد. علاوة على ذلك ، يتم تقييم بكتيريا E.coli كعمود عمل موثوق به للتعبير عن البروتين في مختبرات التكنولوجيا الحيوية وعلوم الحياة. على سبيل المثال ، تستخدم E.coli لتجميع المركبات مثل البروتينات والسكريات قليلة السكاريد على نطاق صناعي. نظرا لميزات محددة مثل نقص الأنزيم البروتيني ، وانخفاض إنتاج الأسيتات عند مستوى عال من الجلوكوز ، وتعزيز النفاذية ، فإن خلايا E. coli B هي الخلايا المضيفة الأكثر استخداما لإنتاج البروتينات المعدلة وراثيا.
البروتين المؤتلف
تكتسب البروتينات المؤتلفة (rProt) أهمية كبيرة في الفروع المتعددة ، بما في ذلك في الإنتاج الكيميائي والأدوية ومستحضرات التجميل والطب البشري والحيواني والزراعة والغذاء وكذلك صناعات معالجة النفايات.
يتطلب إنتاج البروتين المؤتلف استخدام نظام تعبير. كتعبير عن الأنظمة الخلوية لإنتاج الحمض النووي المعاد الاتحاد، يمكن استخدام كل من الخلايا بدائية النواة والخلايا حقيقية النواة. في حين أن الخلايا البكتيرية تستخدم على نطاق واسع للتعبير عن البروتين بسبب عوامل مثل التكلفة المنخفضة وسهولة التوسع وظروف الوسائط البسيطة ، فإن الأنظمة الخالية من الثدييات والخميرة والطحالب والحشرات والخلايا هي بدائل راسخة. يؤثر نوع البروتين والنشاط الوظيفي وكذلك العائد المطلوب من البروتين المعبر عنه على اختيار نظام الخلية المستخدم للتعبير عن البروتين.
للتعبير عن البروتين المعاد الاتحاد، يجب نقل خلية معينة بناقل DNA يحتوي على قالب الحمض النووي المعاد الاتحاد. ثم يتم استزراع الخلايا المنقولة مع القالب. نتيجة للآلية الخلوية ، تقوم الخلايا بنسخ وترجمة البروتين محل الاهتمام ، وبالتالي إنتاج البروتين المستهدف.
نظرا لأن البروتينات المعبر عنها محاصرة في المصفوفة الخلوية ، يجب تحليل الخلية (تعطيلها وكسرها) لإطلاق البروتينات. في خطوة تنقية لاحقة ، يتم فصل البروتين وتنقيته.
كان أول بروتين مؤتلف يستخدم في العلاج هو الأنسولين البشري المؤتلف في عام 1982. اليوم ، يتم إنتاج أكثر من 170 نوعا من البروتين المؤتلف في جميع أنحاء العالم للعلاجات الطبية. البروتينات المؤتلفة شائعة الاستخدام المستخدمة في الطب هي على سبيل المثال الهرمونات المؤتلفة ، والإنترفيرون ، والإنترلوكينات ، وعوامل النمو ، وعوامل نخر الورم ، وعوامل تخثر الدم ، وأدوية التخثر ، والإنزيمات لعلاج الأمراض الرئيسية مثل السكري ، والتقزم ، واحتشاء عضلة القلب ، وفشل القلب الاحتقاني ، والسكتة الدماغية ، والتصلب المتعدد ، وقلة العدلات ، ونقص الصفيحات ، وفقر الدم ، والتهاب الكبد ، والتهاب المفاصل الروماتويدي ، والربو ، ومرض كرون ، وعلاجات السرطان. (راجع Phuc V. Pham ، في Omics Technologies and Bio-Engineering ، 2018)
الأدب / المراجع
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
فيال تويتر سونيكاتور لصوتنة 10 عينات في وقت واحد ، على سبيل المثال لتعطيل خلايا BL21
الموجات فوق الصوتية عالية الأداء! تغطي مجموعة منتجات Hielscher الطيف الكامل من الموجات فوق الصوتية للمختبر المدمجة على وحدات مقاعد البدلاء إلى أنظمة الموجات فوق الصوتية الصناعية الكاملة.