Hielscher تكنولوجيا الموجات فوق الصوتية

بالموجات فوق الصوتية تحلل من كولاي

  • E. البكتيريا القولونية هي البكتيريا الأكثر شيوعا في علم الأحياء الدقيقة والتكنولوجيا الحيوية.
  • اختلال خلية بالموجات فوق الصوتية تحقيق نتائج موثوقة وقابلة للتكرار للتحلل من E. القولونية.
  • التجويف والقص قوات مكثفة بعد السيطرة على وجه التحديد يؤدي إلى اضطراب كامل وعائدات استخراج عالية (مثل البروتينات والحمض النووي).

تعطيل الخلية عن طريق التجويف

وهي lysed البكتيريا القولونية موثوق باستخدام المجانسة الأنسجة بالموجات فوق الصوتية.بالموجات فوق الصوتية التحقيق من نوع المجانسة تعمل مع تقريبا. 20000 دورة في الثانية (في 20KHZ) وتسبب التجويف في سوائل أو supsensions. التجويف المناطق المجهرية الصوتية من الضغوط مثل الفراغ ودرجات الحرارة المرتفعة التي تمزق الخلايا عن بعضها البعض. على الرغم من أن درجات الحرارة قد تصل إلى عدة آلاف درجة مئوية، وحجم التجويف صغيرة جدا لدرجة أنها لا تسخن عملية إلى حد كبير. الموجات فوق الصوتية ولدت التجويف الصوتية وقوى القص خرم أو كسر غشاء الخلية من القولونية – بالاعتماد على إعداد الجهاز للالخالط بالموجات فوق الصوتية.

مزايا بالموجات فوق الصوتية تحلل

  • مراقبة دقيقة من تحلل (كثافة، والسعة ودرجة الحرارة)
  • التكيف الأمثل لعينات محددة
  • التحكم في درجة الحرارة
  • للشركات الصغيرة جدا العينات كبيرة جدا (ميكرولتر للتر)
  • المعالجة الميكانيكية نقية
  • الخطي على نطاق والمتابعة من مختبر لإنتاج
جهاز الموجات فوق الصوتية VialTweeter يسمح لإعداد العينات في وقت واحد لمدة تصل إلى 10 قارورة في ظل ظروف العملية نفسها. (اضغط للتكبير!)

VialTweeter للتحلل بالموجات فوق الصوتية

طلب معلومات





بينما تحلل المواد الكيميائية وenzymtic يمكن أن يكون مشكلة – منذ تحلل الكيميائي يمكن أن تغير الهياكل بروتين وإدخال المشاكل تنقية وتحلل الأنزيمي يتطلب مرات حضانة طويلة وليس استنساخه – تعطل بالموجات فوق الصوتية هو متطورة، خلية سريعة طريقة التعطيل.
ويستند بالموجات فوق الصوتية على أساس القوى الميكانيكية فقط. لا يتم إضافة أي مواد كيميائية، سونيكيشن يكسر جدار الخلية من قبل قوات القص. يمكن أن يغير الليسر الكيميائي بنية البروتين ويدخل مشاكل تنقية. اضطراب الأنزيمية يتطلب أوقات حضانة طويلة وغير قابلة للاستنساخ.

توصيات عامة

UP400St ultrasonicator مع تدفق مفاعلصوتنة هو الأسلوب الأكثر شعبية بالنسبة الناشر كميات صغيرة جدا والمتوسطة والكبيرة من الايقاف الخلية – من بيكو لتر تصل إلى 100L / ساعة (باستخدام خلية تدفق الموجات فوق الصوتية). وهي lysed الخلايا عن طريق القص السائل والتجويف. والمنفصمة DNA أيضا خلال صوتنة، لذلك ليس من الضروري إضافة الدناز إلى تعليق الخلية.
التحكم في درجة الحرارة:
بواسطة ما قبل التبريد العينة والحفاظ على عينة خلال صوتنة على الجليد، عينة تدهور الحراري للعينة يمكن منعت بسهولة.
من الناحية المثالية، يجب أن تبقى عينات الجليد الباردة أثناء lysis، ولكن بالنسبة لمعظم العينات يكفي إذا كانت درجة الحرارة لا ترتفع فوق درجة حرارة الثقافة أو مصدر الأنسجة. ولذلك فمن المستحسن، للحفاظ على تعليق على الجليد وsonicate مع عدة نبضات الموجات فوق الصوتية قصيرة من 5-10 ثانية وتوقف من 10-30 ثانية. خلال توقف، يمكن أن تتبدد الحرارة من أجل إعادة تأسيس درجة حرارة منخفضة. للحصول على عينات خلايا أكبر، ومفاعلات الخلايا تدفق مختلفة مع سترات التبريد متوفرة.

بروتوكولات لإعداد كولاي لست]

تحليل التعبير وتنقية البروتين المؤتلف

كان sonicated القولونية E. بيليه مع نظام الموجات فوق الصوتية UP100H (HIELSCHER). لهذا الغرض، وكان معلق بيليه خلية في تحلل العازلة المبردة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة = 7.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي DTT، 1 ملم PMSF) وتبريده على الجليد لمدة 10 دقيقة. ثم، كان sonicated تعليق الخلية مع 10 رشقات نارية قصيرة من 10 ثانية تليها فترة من 30 ثانية للتبريد. وأخيرا، تم إزالة الحطام الخلية تنبيذ فائق في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 14000 دورة في الدقيقة. لتأكيد التعبير امتاز، تم تشغيل طاف على 12٪ هلام بولي أكريلاميد وتحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي. وقد تم تنقية امتاز باستخدام ني2+الراتنج -NTA (إينفيتروجن، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقا لدليل الشركة المصنعة. في هذه المرحلة، تم استخدام طريقة تنقية الأصلي. تم تقييم نقاء البروتين النقي باستخدام الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد 12٪ ولاحق Coomassie تلطيخ الأزرق. وقد تم قياس تركيز البروتين النقي عن طريق مايكرو BCA عدة البروتين فحص (بيرس، الولايات المتحدة الأمريكية). (Azarnezhad وآخرون 2016)

بالموجات فوق الصوتية UP100H خلية اختلال و(100W) للتحلل، واختلال الخلايا والقص DNA.

الخالط بالموجات فوق الصوتية UP100H (100وات)

نمو الخلية، يشابك وإعداد E. القولونية مقتطفات خلية

لSeqA وRNA البلمرة رقاقة رقاقة كولاي MG1655 MG1655 أو ΔseqA كانت تزرع في 37 ° C إلى OD600 من حوالي 0.15 في 50 مل LB (+ 0.2 ٪ الجلوكوز) قبل إضافة 27 ميكرولتر من الفورمالديهايد (37 ٪) لكل وسيلة متوسطة (تركيز النهائي 1 ٪). تم إجراء التشابك بالاهتزاز البطيء (100 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة تليها التبريد مع 10 مل من 2.5 جليكاين M (التركيز النهائي 0.5 م). في تجارب الصدمة الحرارية ، نمت E. coli MG1655 في وسط LB 65 مل عند 30 درجة مئوية إلى OD600 من حوالي 0.3. وفي وقت لاحق تم نقل 30 مل من ثقافة إلى قبل تحسنت قارورة في 43 ° C، وتبقى ما تبقى عند 30 درجة مئوية. كان يشابك والتبريد كما هو موضح أعلاه باستثناء التي تم الاحتفاظ الخلايا في 30 أو 43 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل مزيد من الهز ببطء في درجة حرارة الغرفة. وقد تم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وغسلها مرتين مع TBS الباردة (pH7.5). بعد إعادة تعليق في 1 مل تحلل العازلة (10 ملي تريس (درجة الحموضة 8.0)، و 20٪ سكروز، 50 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي EDTA، 10 ملغ / مل الليزوزيم) والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تليها إضافة 4 مل IP العازلة، وsonicated الخلايا على الجليد مع 12 مرات 30 ثانية و 30 ثانية فواصل في ل UP400St المعالج بالموجات فوق الصوتية (HIELSCHER الفوق GmbH ل) مع قوة 100٪. بعد الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 9000 غرام، تم تخزين 800 aliquotes ميكرولتر من طاف في -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

الإفراط في الإنتاج وتنقية الإنزيمات.

لالإفراط في decahistidine (His10) البروتينات -tagged، E. القولونية BL21 (DE3) تحولت مع pET19b يبني. كان حصادها وpreculture بين عشية وضحاها بواسطة الطرد المركزي، وكان يستخدم 1٪ لتطعيم ثقافة التعبير. وقد نمت الخلايا تحمل pET19mgtB عند 22 درجة مئوية حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600) 0.7. تم نقل الثقافة إلى 17 درجة مئوية، ويتسبب بنسبة 100 ميكرومتر IPTG. بعد 16 ساعة، وكان حصاد الثقافة بواسطة الطرد المركزي في 7500 × غرام عند 4 درجات مئوية. ومعلق الخلايا في 50 ملي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 0.3 M كلوريد الصوديوم في 7.4 درجة الحموضة وعطلت من قبل ultrasonication مع S2 sonotrode طرف الصغيرة في UP200St ultrasonicator (HIELSCHER، في Teltow، ألمانيا) في حلقة مفرغة من 0.5 واتساع 75٪.
وكان المستحث الإفراط في إنتاج GtfC الموسومة decahistidine-عند 37 درجة مئوية في لOD600 0.6 مع 100 ميكرومتر IPTG. ثم تم تحضين الخلايا لمدة 4 ساعات، تحصد، وهي lysed كما هو مذكور أعلاه لMgtB.
تم طرد مقتطفات خلية النفط الخام في 15000 × ز و 4 ° C إلى الرواسب والحطام الخلية. تم تحميل مقتطفات أوضح على أعمدة الخام 1 مل HisTrap FF باستخدام نظام ÄKTAprime زائد (GE للرعاية الصحية). تم تنقية الإنزيمات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لشطف التدرج من البروتينات صاحب الموسومة. ومدال حلول بروتين مزال مرتين ضد 1000 حجم 50 ملم PBS، ودرجة الحموضة 7.4، مع 0.3 M كلوريد الصوديوم عند 4 درجات مئوية. تم تحليل تنقية بنسبة 12٪ SDS-PAGE. تم تحديد تركيز البروتين طريقة برادفورد باستخدام روتي-كوانت (كارل روث محدودة، كارلسروه، ألمانيا). (Rabausch وآخرون 2013)

استخراج البروتين من E. البكتيريا القولونية
بروتين الطعم من الفائدة (في هذه الحالة، MTV1 من thaliana نبات الأرابيدوبسيس) وتنصهر إلى علامة GST وأعرب في BL21 القولونية (إي كولاي) الخلايا.
1. خذ بيليه واحد من GST-MTV1 وGST (الموافق 50 مل ثقافة البكتيرية) وإعادة تعليق كل في 2.5 مل الجليد استخراج العازلة الباردة.
2. استخدام ultrasonicator UP100H (مجهزة MS3 microtip-sonotrode لكميات صغيرة (2-5mL)) لتعطيل الخلايا البكتيرية حتى هي lysed أنها، التي دلت على انخفاض التعتيم وزيادة اللزوجة. هذا لابد من تنفيذها على الجليد، وينصح يصوتن في فترات (على سبيل المثال 10 ثانية sonicating تليها 10 ثانية على الجليد وهلم جرا). لديها الحرص على أن تؤخذ لا يصوتن مع كثافة عالية جدا. إذا رغوة أو يتم الكشف عن تشكيل راسب أبيض، لا بد من خفض كثافة.
3. نقل البكتيريا الحل هي lysed إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 16000 ز س لمدة 20 دقيقة.

البروتينات المعدلة الأليسين في E. القولونية

وVialTweeter هو ultrasonicator مريح للعينة تجانس صغيرتحديد سلفهيدريل المحتويات التي كتبها 5،5'-Dithiobis (حمض 2-nitrobenzoic) (DTNB) الفحص
تم استخدام الثقافة بين عشية وضحاها كولاي MG1655 لتطعيم اجتماعات الأطراف الحد الأدنى من المتوسط ​​(1: 100). كانت تزرع ثقافة هوائيا حتى تم التوصل إلى A600 0.4. تم تقسيم الثقافة في ثلاث ثقافات 15 مل للعلاج الإجهاد. خدم ثقافة غير المعالجة كوسيلة لمراقبة سلبية. 0.79 ملي الأليسين (128 ميكروغرام مل-1وأضيف) أو 1 ملم ثنائي الأميد إلى واحد من اثنين من الثقافات المتبقية لكل منهما. وحضنت الثقافات لمدة 15 دقيقة. كانت تحصد 5 مل من كل ثقافة عن طريق الطرد المركزي (8525 × ز، 4 ° C، 10 دقيقة). وجرفت المياه الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا2HPO4، 2 مم KH2بو4، ودرجة الحموضة 7.4، وتخزينها قبل هوائيا لاستخدام) وطرد (13،000 × ز، 4 ° C، 10 دقيقة). ومعلق الخلايا في تحلل العازلة (PBS مع 6 ملي guanidinium حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4) قبل انقطاع في 4 درجات مئوية بحلول ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator، HIELSCHER محدودة، وألمانيا) (3 × 1 دقيقة). ومكعبات الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي (13،000 × ز، 4 ° C، 15 دقيقة). تم نقل طاف ل3.5 مل ماكرو QS-كوفيت (10 ملم) مع شريط مغناطيسي ومختلطة مع 1 مل من تحلل العازلة. تم رصد انقراض عينات في 412 نانومتر مع معمل JASCO V-650 مجهزة حامل خلية التحكم في درجة حرارته PSC-718 (JASCO) في درجة حرارة الغرفة. أضيفت 100μl حل 3 مم dithiobis (حمض 2-nitrobenzoic). تم رصد الانقراض حتى وصلت إلى درجة التشبع. تم إجراء حساب تركيز ثيول باستخدام ε معامل الانقراض412 = 13700 M-1 سم-1 لثيو-2-nitrobenzoic حمض (TNB). تم احتساب تراكيز ثيول الخلوية وبلغ حجم التداول E. خلايا القولونية 6.7 × 10-15 لتر وكثافة خلية من A600 = 0.5 (أي ما يعادل 1 × 108 خلايا مل-1 الثقافة). (مولر وآخرون 2016)

في فيفو الجلوتاثيون تحديد

وقد نمت القولونية MG1655 في اجتماعات الأطراف الحد الأدنى من المتوسط ​​في إجمالي حجم 200ml في حين وA600 0.5 تم التوصل إليه. تم تقسيم الثقافة في الثقافات 50 مل للعلاج الإجهاد. بعد 15 دقيقة من الحضانة مع 0.79 ملي الأليسين، 1 ملم ثنائي الأميد، أو سلفوكسيد ثنائي ميثيل (السيطرة)، وكان حصاد الخلايا في 4،000g في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وجرفت المياه الخلايا مرتين مع العازلة KPE قبل إعادة تعليق الكريات في 700μl من العازلة KPE. لdeproteination، 300L من 10٪ (ث / ت) تم إضافة حمض السلفوساليسيليك قبل تعطل الخلايا عن طريق ultrasonication (3 × 1 دقيقة. VialTweeter ultrasonicator). تم جمع Supernatants بعد الطرد المركزي (30 دقيقة، 13،000g، 4 ° C). وانخفضت تركيزات حمض السلفوساليسيليك إلى 1٪ من خلال إضافة 3 مجلدات من العازلة KPE. أجريت القياسات من إجمالي الجلوتاثيون وGSSG كما هو موضح أعلاه. تم احتساب تراكيز الجلوتاثيون الخلوية وبلغ حجم التداول E. القولونية خلايا 6.7×10-15 لتر وكثافة خلية من A600 00.5 (أي ما يعادل 1×108 خلايا مل-1 حضاره). تم حساب تركيزات GSH من الطرح من 2 [GSSG] من مجموع الجلوتاثيون. (مولر وآخرون 2016)

اختلال بالموجات فوق الصوتية للتحلل الخلية واستخراج المواد البيولوجية (انقر للتكبير!)

التحقيق من نوع ultrasonicator UP400St

التعبير عن mAspAT الإنسان في E. القولونية

بالموجات فوق الصوتية المحمولة اختلال UP400St (400W) لاستخراج المواد داخل الخلايا (مثل البروتينات، العضيات، DNA، RNA الخ)في مستعمرة واحدة من E. القولونية BL21 (DE3) إيواء ناقلات التعبير في 30 مل من لوريا، Bertani (LB) المتوسط ​​تحتوي على 100μg / مل الأمبيسلين، ومن ثم زراعتها في 37ºC حتى الكثافة الضوئية (OD600) وصلت 0.6. وقد تم حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4000 × ز لمدة 10 دقيقة، ومعلق في 3L المتوسطة LB الطازجة التي تحتوي على 100μg / مل الأمبيسلين.
وفي وقت لاحق، وكان المستحث التعبير البروتين مع 1 ملم الآيزوبروبيل β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) لمدة 20 ساعة عند 16ºC. وقد تم حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 8000 × ز لمدة 15 دقيقة ويغسل مع العازلة A (20 ملي NaH2PO4، و 0.5 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4). وقد تم الحصول على 45g ويقترب (الوزن الرطب) الخلايا من 3 ثقافة L. بعد الطرد المركزي، ومعلق الكريات خلية في 40 مل (لمدة 1 L الثقافة) المثلج استخراج عازلة A، وهي lysed من قبل ultrasonication في درجة حرارة شديدة البرودة باستخدام UP400St أداة (الدكتور HIELSCHER محدودة، وألمانيا). تم طرد تحلل الخلية في 12000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة لفصل ذوبان (طاف) وعجلت (بيليه) الكسور. (جيانغ وآخرون 2015)

الجدول أدناه يعطيك مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لultrasonicators لدينا:

دفعة حجم معدل المد و الجزر الأجهزة الموصى بها
00.5 إلى 1.5mL زمالة المدمنين المجهولين VialTweeter
1 إلى 500ML 10 إلى 200ML / دقيقة UP100H
10 إلى 2000ML 20 إلى 400ML / دقيقة Uf200 ः ر، UP400St
00.1 إلى 20L 00.2 إلى 4L / دقيقة UIP2000hdT
10 إلى 100L 2 إلى 10L / دقيقة UIP4000
زمالة المدمنين المجهولين 10 إلى 100L / دقيقة UIP16000
زمالة المدمنين المجهولين أكبر مجموعة من UIP16000

اتصل بنا! / اسألنا!

يرجى استخدام النموذج أدناه، إذا كنت ترغب في طلب معلومات إضافية حول التجانس بالموجات فوق الصوتية. سنكون سعداء لنقدم لكم نظام الموجات فوق الصوتية تلبية الاحتياجات الخاصة بك.









يرجى ملاحظة لدينا سياسة الخصوصية.


مراجع الادب



حقائق تستحق العلم

بكتريا قولونية

Escherichia coli (E. coli) هي عبارة عن بكتريا القولون سلبية اللاهوائي ، والقوالب الشكلية ، والكوليفورمية من جنس Escherichia التي توجد عادة في الأمعاء الدقيقة للكائنات الحية ذوات الدم الحار (endotherms). هناك عدد كبير من سلالات E. coli (أو الأنواع الفرعية) ذات الخصائص المتنوعة. معظم سلالات E. coli غير ضارة للبشر ، مثل سلالات B و K-12 التي تستخدم عادة لتطبيقات البحث في المختبرات. ومع ذلك ، بعض السلالات ضارة ويمكن أن تسبب مرض خطير.
يلعب كولاي دورا هاما في مجال الهندسة البيولوجية الحديثة وعلم الأحياء الدقيقة الصناعي منذ البكتيريا من السهل التلاعب. تطبيقات مختبر المشتركة التي تنطوي في كثير من الأحيان استخدام كولاي، على سبيل المثال، لخلق حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين المؤتلف (DNA) أو ليكون بمثابة كائن نموذج.
E. القولونية هي مجموعة متعددة جدا لإنتاج البروتينات مغاير، وهي أنظمة تعبير البروتين المتعددة المتاحة لإنتاج البروتينات المؤتلف في E. القولونية. استخدام البلازميدات التي تسمح التعبير مستوى عال من البروتين، ويمكن إدخال جينات في البكتيريا، والتي تمكن من إنتاج هذه البروتينات بكميات عالية في عمليات التخمير الصناعية.
وتستخدم القولونية بمثابة مصانع الخلية لإنتاج الأنسولين. وتشمل التطبيقات مواصلة استخدام الخلايا القولونية E. معدلة لتطوير وإنتاج اللقاحات والانزيمات يجمد، لإنتاج الوقود الحيوي، فضلا عن المعالجة البيولوجية.
سلالة K-12 هو شكل متحولة من E. القولونية أن الإفراط في تعبر عن انزيم الفوسفاتاز القلوية (ALP). تحدث هذه الطفرات بسبب وجود خلل في الجين الذي باستمرار رموز الانزيم. إذا ينتج الجين المنتج دون أي تثبيط هذا هو المعروف باسم النشاط التأسيسي. يستخدم هذا النموذج متحولة محددة لعزل وتنقية انزيم ALP.

بالموجات فوق الصوتية DNA قص

بالموجات فوق الصوتية قوى القص هي طريقة تستخدم عادة لفصل من الخلية وكسر خيوط DNA إلى قطع. التجويف الصوتية يكسر جدران الخلايا والأغشية لاستخراج DNA من الخلايا وتوليد شظايا من حوالي 600 – 800 شركة بريتيش بتروليوم في الطول، والذي يعتبر مثاليا للتحليل.
انقر هنا لمعرفة المزيد عن المجانسة بالموجات فوق الصوتية لتفتيت الحمض النووي!