تحليل E. Coli بالموجات فوق الصوتية

بكتيريا E. coli هي البكتيريا الأكثر استخدامًا في علم الأحياء الدقيقة والتكنولوجيا الحيوية.
توفر أجهزة تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية نتائج موثوقة وقابلة للتكرار لتحليل E. coli.
تؤدي قوى التجويف والقص الشديدة، التي يمكن التحكم فيها بدقة، إلى تفكيك كامل ومردود استخلاص مرتفع (مثل البروتينات وDNA).

لماذا يُعد تفكيك خلايا E. coli بالموجات فوق الصوتية الطريقة المفضلة؟

توفر المجانسات بالموجات فوق الصوتية أو أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار عدة مزايا لتحليل E. coli، إذ تفكك الموجات فوق الصوتية الشديدة جدران الخلايا وأغشيتها بكفاءة. وتُستخدم أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار على نطاق واسع لتحليل E. coli للأسباب التالية:

تفكيك جدران الخلايا بكفاءة: تمتلك E. coli جدارًا خلويًا شبه صلب يتكون من الببتيدوغليكان، وقد يصعب تفكيكه باستخدام طرق التحليل التقليدية. يولد جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار موجات فوق صوتية شديدة تُنشئ فقاعات تجويف في السائل المحيط بالخلايا. وعندما تنهار هذه الفقاعات، فإنها تولد نفاثات سائلة عالية السرعة وموجات صدمية تؤدي إلى تفكيك ميكانيكي لجدران الخلايا، مما يحرر المحتويات الخلوية، مثل الجزيئات الحيوية، بفعالية.

تعزيز الاختراق: يمكن للموجات فوق الصوتية التي يولدها المسبار / السونوترود أن تخترق العينة بعمق، فتصل إلى عدد أكبر من خلايا E. coli وتعالجها بالتساوي. ويساعد ذلك على ضمان تجانس التحليل بدرجة أكبر في جميع أجزاء العينة، مما يؤدي إلى زيادة كفاءة تفكيك الخلايا.

تقليل وقت المعالجة: تكون الطاقة التي ينقلها جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار شديدة التركيز وموضعية، مما يؤدي إلى تحليل سريع وفعال للخلايا. وبالمقارنة مع طرق أخرى، مثل الخض بالخرز أو التحليل الإنزيمي، يمكن للمعالجة بالموجات فوق الصوتية أن تحقق تحليل E. coli خلال دقائق أو حتى ثوانٍ. وبينما تتطلب العديد من التقنيات البديلة، مثل التجميد والإذابة، عدة دورات من المعالجة، يفتح التحليل بالموجات فوق الصوتية الخلايا في خطوة معالجة واحدة.

التحكم في درجة الحرارة: تُجهز أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية الحديثة بمستشعرات لدرجة الحرارة وبرمجيات ذكية تتيح ضبط درجة حرارة قصوى للعملية. ويتوقف جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية تلقائيًا عند بلوغ الحد الأقصى لدرجة الحرارة، ويبدأ المعالجة بالموجات فوق الصوتية عند الوصول إلى درجة حرارة محددة. ويُعد تبريد العينات في حمام ثلجي طريقة بسيطة للحفاظ على انخفاض درجة حرارة العينة ومنع تدهورها بفعل الحرارة.

قابلية التوسع: تتوفر أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار بأحجام مختلفة، من الأجهزة المحمولة باليد إلى الطرازات الصناعية واسعة النطاق. وهذا يجعلها مناسبة لمعالجة أحجام صغيرة في المختبر أو للتوسع إلى تطبيقات معالجة حيوية أكبر، مثل إنتاج اللقاحات أو التخليق الحيوي للجزيئات.

تعدد الاستخدامات: يمكن استخدام أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية في تطبيقات متنوعة تتجاوز تحليل الخلايا، مثل قص DNA، واستخلاص البروتينات، وتجنيس الأنسجة، وتشتيت الجسيمات النانوية، والاستحلاب. ولذلك، يوفر الاستثمار في جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار تعددًا في الاستخدامات في البيئات البحثية أو الصناعية.

تُعد أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار، مثل UP200St، مجانسات موثوقة للأنسجة وأجهزة موثوقة لتفكيك الخلايا، ولذلك تُستخدم على نطاق واسع لتحضير العينات في علم الوراثة، مثل تحليل E.coli

يُجرى استخلاص البروتينات من خلايا E.coli بكفاءة باستخدام المسبار فوق الصوتي UP200St

يوفر جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار مزايا عديدة لتحليل E. coli. ويتيح التحكم الموثوق والدقيق في معلمات عملية المعالجة بالموجات فوق الصوتية تحسين معلمات التشغيل، مثل القدرة والمدة والتعامل مع العينات، لتحقيق النتائج المطلوبة.

يشرح هذا الدرس نوع جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية الأنسب لمهام تحضير العينات، مثل التحلل الخلوي وتفكيك الخلايا وعزل البروتينات وتجزئة DNA وRNA في المختبرات والتحليل والبحث. اختر نوع الجهاز المثالي لتطبيقك وحجم العينات وعددها ومعدل معالجة العينات. لدى Hielscher Ultrasonics المجانس بالموجات فوق الصوتية المثالي لك!

تُستخدم تجزئة DNA بالموجات فوق الصوتية كثيرًا كخطوة لتحضير العينات في التسلسل من الجيل التالي (NGS)

تحليلات بالرحلان الكهربائي لـDNA الجينومي لبكتيريا E. coli EDL933 التي خضعت للمعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 0 – 15 min. يشير L إلى سلم DNA.
(الدراسة والصورة: ©Basselet et al. 2008)

تفكيك الخلايا باستخدام التجويف بالموجات فوق الصوتية

تعمل المجانسات بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار بنحو 20,000 دورة في الثانية (عند 20kHz)، وتسبب التجويف في السوائل أو المعلقات. يُنشئ التجويف الصوتي مناطق مجهرية ذات ضغوط شبيهة بالفراغ ودرجات حرارة مرتفعة تمزق الخلايا. وعلى الرغم من أن درجات الحرارة قد تصل إلى عدة آلاف من الدرجات المئوية، فإن أحجام مناطق التجويف صغيرة للغاية، فلا تؤدي إلى تسخين العملية بدرجة ملحوظة. ويؤدي التجويف الصوتي وقوى القص الناتجان عن الموجات فوق الصوتية إلى ثقب أو تمزيق الغشاء الخلوي للخلايا البكتيرية مثل E.coli. وتتيح أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher التحكم الدقيق في معلمات العملية، مثل شدة الموجات فوق الصوتية والسعة والطاقة المُدخلة ودرجة الحرارة. وبذلك، يمكن ضبط عملية التحليل بالموجات فوق الصوتية على النحو الأمثل وفقًا لنوع الخلايا والمزرعة الخلوية وهدف العملية.

مزايا التحليل بالموجات فوق الصوتية

التحكم الدقيق في التحليل (الشدة، السعة، درجة الحرارة)
نتائج موثوقة وقابلة للتكرار
التكييف الأمثل مع عينات محددة
التحكم في درجة الحرارة
للعينات الصغيرة جدًا إلى الكبيرة جدًا (من µL إلى لترات)
معالجة ميكانيكية بحتة
تشغيل آمن وسهل الاستخدام
توسيع النطاق خطيًا من المختبر إلى الإنتاج

يتيح جهاز الموجات فوق الصوتية VialTweeter التحضير المتزامن للعينات في ما يصل إلى 10 قوارير تحت ظروف العملية نفسها. (انقر للتكبير!)

VialTweeter للتحليل بالموجات فوق الصوتية

المجانس بالموجات فوق الصوتية مقارنةً بتقنيات التحليل الأخرى

قد ينطوي التحليل الكيميائي والإنزيمي على مشكلات – إذ يمكن للتحليل الكيميائي أن يغير بُنى البروتينات ويسبب مشكلات في التنقية، بينما يتطلب التحليل الإنزيمي فترات حضانة طويلة ولا يكون قابلًا للتكرار – أما التفكيك بالموجات فوق الصوتية فهو طريقة متطورة وسريعة لتفكيك الخلايا.
يعتمد التحليل بالموجات فوق الصوتية على القوى الميكانيكية فقط. ولا تُضاف أي مواد كيميائية، إذ تفكك المعالجة بالموجات فوق الصوتية الجدار الخلوي بواسطة قوى القص. ويمكن للتحليل الكيميائي أن يغير بنية البروتين ويسبب مشكلات في التنقية. ويتطلب التفكيك الإنزيمي فترات حضانة طويلة ولا يكون قابلًا للتكرار. ويتميز تفكيك خلايا بكتيريا E.coli بالموجات فوق الصوتية بالسرعة والبساطة والموثوقية وقابلية التكرار. ولهذا تُستخدم أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher في مختبرات الأحياء والكيمياء الحيوية حول العالم لتحضير العينات، والعمل في مرحلة ما قبل التحليل، والتشخيص في المختبر، وإجراء اختبارات متنوعة.

توصيات عامة للتحليل بالموجات فوق الصوتية

المعالجة بالموجات فوق الصوتية هي التقنية الأكثر شيوعًا لتحليل كميات صغيرة جدًا ومتوسطة وكبيرة من المعلقات الخلوية – من البيكولترات حتى 100L/hr (باستخدام خلية التدفق بالموجات فوق الصوتية). وتُحلل الخلايا بواسطة قص السائل والتجويف. كما يُقص DNA أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية، ولذلك لا يلزم إضافة DNase إلى المعلق الخلوي.

التحكم في درجة الحرارة أثناء تحليل E.coli بالموجات فوق الصوتية
يمكن منع التدهور الحراري للعينة بسهولة من خلال تبريدها مسبقًا وإبقائها على الثلج أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية.
يُفضل الحفاظ على العينات باردة بدرجة حرارة الثلج أثناء التحليل، ولكن بالنسبة إلى معظم العينات يكفي ألا ترتفع درجة الحرارة فوق درجة حرارة المزرعة أو مصدر النسيج. ولذلك يُوصى بإبقاء المعلق على الثلج ومعالجته بالموجات فوق الصوتية باستخدام عدة نبضات قصيرة مدتها 5–10 sec، مع فترات توقف مدتها 10–30 sec. وخلال فترات التوقف، يمكن للحرارة أن تتبدد لاستعادة درجة حرارة منخفضة. وللعينات الخلوية الأكبر حجمًا، تتوفر مفاعلات مختلفة لخلايا التدفق مزودة بأغلفة تبريد.
اقرأ هنا نصائح وتوصيات مفصلة لتحقيق تحليل ناجح بالموجات فوق الصوتية!

بروتوكولات تحضير محللات E. Coli بالموجات فوق الصوتية

يستخدم الباحثون المجانسات بالموجات فوق الصوتية من Hielscher لتفكيك خلايا E.coli. ويمكنك أدناه الاطلاع على بروتوكولات متنوعة مختبرة ومثبتة لتحليل E.coli باستخدام المجانسات بالموجات فوق الصوتية من Hielscher في تطبيقات مختلفة تتعلق ببكتيريا E. coli.

نمو الخلايا والتشابك وتحضير مستخلصات خلايا E. coli باستخدام الموجات فوق الصوتية

لإجراء ChIP-Chip لكل من SeqA وبوليميراز RNA، نُمّيت E. coli MG1655 أو MG1655 ΔseqA عند 37°C حتى بلغت كثافة بصرية OD₆₀₀ مقدارها نحو 0.15 في 50 ml من LB (+ 0.2% غلوكوز)، قبل إضافة 27 μl من الفورمالديهايد (37%) لكل ml من الوسط (التركيز النهائي 1%). أُجري التشابك مع الرج البطيء (100 rpm) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 min، ثم أُوقف التفاعل باستخدام 10 ml من الغليسين بتركيز 2.5 M (التركيز النهائي 0.5 M). وفي تجارب الصدمة الحرارية، نُمّيت E. coli MG1655 في 65 ml من وسط LB عند 30°C حتى بلغت كثافة بصرية OD₆₀₀ مقدارها نحو 0.3. ثم نُقل 30 ml من المزرعة إلى دورق مسخن مسبقًا عند 43°C، وأُبقي الباقي عند 30°C. وأُجري التشابك وإيقاف التفاعل كما وُصف أعلاه، باستثناء إبقاء الخلايا عند 30 أو 43°C لمدة 5 min قبل مواصلة الرج البطيء في درجة حرارة الغرفة. جُمعت الخلايا بالطرد المركزي وغُسلت مرتين باستخدام TBS بارد (pH7.5). وبعد إعادة تعليقها في 1 ml من محلول التحليل المنظم (10 mM Tris ‏(pH 8.0)، و20% سكروز، و50 mM NaCl، و10 mM EDTA، و10 mg/ml ليزوزيم)، وحضانتها عند 37°C لمدة 30 min، ثم إضافة 4 ml من محلول IP المنظم، عولجت الخلايا بالموجات فوق الصوتية على الثلج في 12 دورة، مدة كل منها 30 sec، مع فترات توقف مدتها 30 sec، باستخدام معالج الموجات فوق الصوتية UP400St من Hielscher عند ضبط القدرة على 100%. وبعد الطرد المركزي لمدة 10 min عند 9000 g، حُفظت قسامات مقدار كل منها 800 μl من السائل الفوقاني عند -20°C. (Waldminghaus 2010)

الإنتاج المفرط للإنزيمات وتنقيتها باستخدام مسبار فوق صوتي

للإنتاج المفرط للبروتينات الموسومة بعشرة بقايا هيستيدين (His10)، حُولت E. coli BL21(DE3) باستخدام تراكيب pET19b. وحُصدت مزرعة أولية نُمّيت طوال الليل بالطرد المركزي، واستُخدم 1% منها لتلقيح مزرعة التعبير. ونُمّيت الخلايا الحاملة لـpET19mgtB عند 22°C حتى بلغت الكثافة البصرية عند 600 nm ‏(OD600) مقدار 0.7. ثم نُقلت المزرعة إلى 17°C، وحُفزت باستخدام 100 μM IPTG. وبعد 16 h، حُصدت المزرعة بالطرد المركزي عند 7,500 × g و4°C. وأُعيد تعليق الخلايا في 50 mM من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) المحتوي على 0.3 M NaCl عند pH 7.4، وفُككت بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام سونوترود S2 ذي طرف دقيق مع جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UP200St من Hielscher، عند دورة مقدارها 0.5 وسعة مقدارها 75%.
وحُفز الإنتاج المفرط لـGtfC الموسوم بعشرة بقايا هيستيدين عند 37°C وعند كثافة بصرية OD₆₀₀ مقدارها 0.6 باستخدام 100 μM IPTG. ثم حُضنت الخلايا لمدة 4 h، وحُصدت وحُللت كما ذُكر أعلاه بالنسبة إلى MgtB.
خضعت المستخلصات الخلوية الخام للطرد المركزي عند 15,000 × g و4°C لترسيب الحطام الخلوي. وحُمّلت المستخلصات المروقة على أعمدة HisTrap FF Crude بحجم 1-ml باستخدام نظام ÄKTAprime Plus. ونُقيت الإنزيمات وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة للإزاحة بالتدرج للبروتينات الموسومة بـHis. وخضعت محاليل البروتين المُزاحة للديلزة مرتين مقابل 1,000 ضعف حجمها من 50 mM PBS، عند pH 7.4، مع 0.3 M NaCl عند 4°C. وحُللت التنقية باستخدام 12% SDS-PAGE. وحُدد تركيز البروتين بطريقة Bradford باستخدام Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

استخلاص البروتين من بكتيريا E. coli بالموجات فوق الصوتية
يُدمج بروتين طُعم مستهدف (في هذه الحالة، MTV1 من Arabidopsis thaliana) مع وسم GST، ويُعبَّر عنه في خلايا BL21 Escherichia coli ‏(E. coli).

خذ راسبًا واحدًا لكل من GST-MTV1 وGST (يقابل 50 ml من المزرعة البكتيرية)، وأعد تعليق كل منهما في 2.5 mL من محلول الاستخلاص المنظم البارد بدرجة حرارة الثلج.
استخدم جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UP100H (المجهز بسونوترود MS3 ذي طرف دقيق للأحجام الصغيرة التي تبلغ نحو 2–5mL) لتفكيك الخلايا البكتيرية حتى تتحلل، ويُستدل على ذلك بانخفاض العتامة وزيادة اللزوجة. ويجب إجراء ذلك على الثلج، ويُوصى بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية على فترات (مثل 10 sec من المعالجة بالموجات فوق الصوتية، تتبعها فترة توقف على الثلج لمدة 10 sec، وهكذا). ويجب الحرص على عدم المعالجة بالموجات فوق الصوتية بشدة مرتفعة للغاية. وإذا لوحظ تكوّن رغوة أو راسب أبيض، فيجب خفض الشدة.
انقل محلول البكتيريا المحللة إلى أنابيب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5 mL، وأجرِ الطرد المركزي عند 4°C و16,000 x g لمدة 20 min.

تستخدم المسابير فوق الصوتية قوى التجويف الصوتي لتفكيك الخلايا واستخلاص الجزيئات وDNA من E.coli.

أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار، مثل UP400St، تستخدم مبدأ عمل التجويف الصوتي لتحليل E.coli بكفاءة.

تحليل التعبير وتنقية البروتين المؤتلف باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية

عولج راسب E. coli بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UP100H من Hielscher. ولهذا الغرض، أُعيد تعليق الراسب الخلوي في محلول تحليل منظم مبرد (50 mM Tris-HCl ‏pH=7.5، و100 mM NaCl، و5 mM DTT، و1 mM PMSF)، وبُرد على الثلج لمدة 10 min. ثم عولج المعلق الخلوي بالموجات فوق الصوتية باستخدام 10 نبضات قصيرة، مدة كل منها 10 s، تتبعها فترة توقف مدتها 30 s للتبريد. وأخيرًا، أُزيل الحطام الخلوي بالطرد المركزي الفائق عند 4°C لمدة 15 min وبسرعة 14,000 rpm. ولتأكيد التعبير عن rPR، أُخضع السائل الفوقاني للرحلان على هلام بولي أكريلاميد بتركيز 12%، وحُلل باستخدام SDS-PAGE واللطخ الغربي. وأُجريت تنقية rPR باستخدام راتنج Ni2+-NTA ‏(Invitrogen، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لدليل الشركة المصنعة. وفي هذه المرحلة، استُخدمت طريقة التنقية في الحالة الأصلية. وقُيم نقاء البروتين المنقى باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد بتركيز 12%، ثم التلوين بأزرق Coomassie. وقيس تركيز البروتين المنقى باستخدام مجموعة اختبار البروتين Micro BCA ‏(PIERCE، الولايات المتحدة الأمريكية). (Azarnezhad et al. 2016)

يعرض هذا الفيديو السونوترود الكأسي بالموجات فوق الصوتية بقدرة 200 واط لتشتيت العينات المختبرية أو تجانسها أو استخلاصها أو إزالة الغازات منها.

مجانسات بالموجات فوق الصوتية لتحليل E. coli

تصمم Hielscher Ultrasonics وتصنع وتورد مجانسات بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء للتحليل الموثوق والفعال لبكتيريا E. coli وغيرها من أنواع الخلايا والأنسجة والمزارع الخلوية.
وتتيح لنا المجموعة الواسعة من المسابير فوق الصوتية، إلى جانب أنظمة المعالجة غير المباشرة بالموجات فوق الصوتية، أن نقدم لك مجانس الأنسجة بالموجات فوق الصوتية المثالي لتطبيق تفكيك الخلايا والاستخلاص لديك.

التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صُنعت في ألمانيا

تشتهر أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher بأعلى معايير الجودة والتصميم. والبرمجيات الذكية، والقائمة سهلة الاستخدام، والإعدادات القابلة للبرمجة، والتسجيل التلقائي للبيانات ليست سوى بعض مزايا أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher. وتتيح المتانة وسهولة التشغيل دمج أجهزتنا للمعالجة بالموجات فوق الصوتية بسلاسة في مرافق البحث والتكنولوجيا الحيوية. وتتعامل أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher بسهولة حتى مع الظروف القاسية والبيئات ذات المتطلبات الصعبة.

Hielscher Ultrasonics شركة حاصلة على شهادة ISO، وتولي اهتمامًا خاصًا بأجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. وبالطبع، تتوافق أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher مع CE، وتفي بمتطلبات UL وCSA وRoHs.

يمنحك الجدول أدناه مؤشرًا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزتنا للمعالجة بالموجات فوق الصوتية:

حجم الدفعة	معدل التدفق	الأجهزة الموصى بها
صفائح متعددة الآبار / صفائح المعايرة الدقيقة	n.a.	UIP400MTP
CupHorn للقوارير أو الكأس المخبري	n.a.	CupHorn بالموجات فوق الصوتية
مفاعل تدفق دقيق بالموجات فوق الصوتية	n.a.	GDmini2
حتى 10 قوارير بحجم 0.5 إلى 1.5mL	n.a.	VialTweeter
0.5 إلى 1.5mL	n.a.	VialTweeter
1 إلى 500mL	10 إلى 200mL/min	UP100H
10 إلى 2000mL	20 إلى 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0.1 إلى 20L	0.2 إلى 4L/min	UIP2000hdT
10 إلى 100L	2 إلى 10L/min	UIP4000
n.a.	10 إلى 100L/min	UIP16000
n.a.	أكبر	مجموعة من أجهزة UIP16000

تواصل معنا! / اسألنا!

يعرض الفيديو نظام تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP، الذي يتيح تحضيرًا موثوقًا للعينات في أي صفائح قياسية متعددة الآبار باستخدام موجات فوق صوتية عالية الشدة. وتشمل التطبيقات المعتادة لجهاز UIP400MTP تحليل الخلايا وقص DNA وRNA والكروماتين، بالإضافة إلى استخلاص البروتين.

بروتوكولات إضافية لتحليل E. coli بالموجات فوق الصوتية

البروتينات المعدلة بالأليسين في E. coli باستخدام VialTweeter بالموجات فوق الصوتية

تحديد محتوى مجموعات السلفهيدريل باستخدام اختبار 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
استُخدمت مزرعة E. coli MG1655 نُمّيت طوال الليل لتلقيح وسط MOPS الأدنى (1:100). ونُمّيت المزرعة هوائيًا حتى بلغ A600 مقدار 0.4. وقُسمت المزرعة إلى ثلاث مزارع، حجم كل منها 15-ml، للمعالجة بالإجهاد. واستُخدمت مزرعة غير معالجة كشاهد سلبي. وأُضيف 0.79 mM من الأليسين (128 μg ml-1) إلى إحدى المزرعتين المتبقيتين، و1 mM من الدياميد إلى الأخرى. وحُضنت المزارع لمدة 15 min. وحُصد 5 ml من كل مزرعة بالطرد المركزي (8,525 × g، و4°C، و10 min). وغُسلت الخلايا مرتين باستخدام 1 ml من PBS ‏(137 mM NaCl، و2.7 mM KCl، و10 mM Na2HPO4، و2 mM KH2PO4، وpH 7.4، محفوظ في ظروف لاهوائية قبل الاستخدام)، وأُجري الطرد المركزي (13,000 × g، و4°C، و10 min). وأُعيد تعليق الخلايا في محلول التحليل المنظم (PBS مع 6 mM من guanidinium HCl، وpH 7.4) قبل تفكيكها عند 4°C بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية (VialTweeter ، جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية، Hielscher GmbH، ألمانيا) (3 × 1 min). ورُسب الحطام الخلوي بالطرد المركزي (13,000 × g، و4 °C، و15 min). ونُقل السائل الفوقاني إلى كوفيت QS-macro بحجم 3.5-ml ‏(10 mm) مزودة بقضيب تحريك مغناطيسي، ومُزج مع 1 ml من محلول التحليل المنظم. ورُصدت امتصاصية العينات عند 412 nm باستخدام مقياس الطيف الضوئي Jasco V-650، المجهز بحامل خلايا PSC-718 ذي تحكم في درجة الحرارة، في درجة حرارة الغرفة. وأُضيف 100μl من محلول dithiobis(2-nitrobenzoic acid) بتركيز 3 mM. ورُصدت الامتصاصية حتى بلغت التشبع. وحُسب تركيز الثيول باستخدام معامل الامتصاص ϵ₄₁₂ = 13,700 M^-1 cm^-1 لـthio-2-nitrobenzoic acid (TNB). وحُسبت تراكيز الثيول الخلوية بناءً على حجم خلايا E. coli البالغ 6.7 × 10^-15 لتر وكثافة خلوية مقدارها A600 = 0.5 (تعادل 1 × 10⁸ خلية ml^-1 من المزرعة). (Müller et al. 2016)

تحديد الغلوتاثيون داخل الكائن الحي باستخدام جهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية

نُمّيت E.coli MG1655 في وسط MOPS الأدنى بحجم إجمالي قدره 200ml حتى بلغ A600 مقدار 0.5. وقُسمت المزرعة إلى مزارع بحجم 50-ml للمعالجة بالإجهاد. وبعد الحضانة لمدة 15 min مع 0.79 mM من الأليسين، أو 1 mM من الدياميد، أو ثنائي ميثيل السلفوكسيد (الشاهد)، حُصدت الخلايا عند 4,000g و4°C لمدة 10 min. وغُسلت الخلايا مرتين بمحلول KPE المنظم قبل إعادة تعليق الرواسب في 700µl من محلول KPE المنظم. ولإزالة البروتينات، أُضيف 300l من حمض السلفوساليسيليك بتركيز 10% (w/v) قبل تفكيك الخلايا بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية (3 x 1 min؛ VialTweeter ، جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية). وجُمعت السوائل الفوقانية بعد الطرد المركزي (30 min، و13,000g، و4°C). وخُفضت تراكيز حمض السلفوساليسيليك إلى 1% بإضافة 3 أضعاف الحجم من محلول KPE المنظم. وأُجريت قياسات الغلوتاثيون الكلي وGSSG كما وُصف أعلاه. وحُسبت تراكيز الغلوتاثيون الخلوية بناءً على حجم خلايا E. coli البالغ 6.7×10^-15 لتر وكثافة خلوية مقدارها A600 0.5 (تعادل 1×10⁸ خلية ml^-1 من المزرعة). حُسبت تراكيز GSH بطرح 2[GSSG] من الغلوتاثيون الكلي. (Müller et al. 2016)

التعبير عن mAspAT البشري في E. coli باستخدام مجانس بالموجات فوق الصوتية

وُضعت مستعمرة واحدة من E. coli BL21 (DE3) الحاملة لناقل التعبير في 30 mL من وسط Luria-Bertani ‏(LB) المحتوي على 100μg/mL من الأمبيسيلين، ثم نُمّيت عند 37ºC حتى بلغت الكثافة البصرية (OD₆₀₀) مقدار 0.6. وحُصدت الخلايا بالطرد المركزي عند 4,000 × g لمدة 10 min، وأُعيد تعليقها في 3L من وسط LB الطازج المحتوي على 100μg/mL من الأمبيسيلين.
ثم حُفز التعبير عن البروتين باستخدام 1 mM من إيزوبروبيل β-ᴅ-1-ثيوغالاكتوبيرانوزيد (IPTG) لمدة 20 h عند 16ºC. وحُصدت الخلايا بالطرد المركزي عند 8,000 × g لمدة 15 min، وغُسلت بالمحلول المنظم A ‏(20 mM NaH2PO4، و0.5 M NaCl، وpH 7.4). وحُصل على نحو 45g (وزن رطب) من الخلايا من مزرعة بحجم 3 L. وبعد الطرد المركزي، أُعيد تعليق الرواسب الخلوية في 40 mL (لكل 1 L من المزرعة) من محلول الاستخلاص المنظم A البارد بدرجة حرارة الثلج، وحُللت بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية عند درجة حرارة الثلج باستخدام جهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية UP400St من Hielscher. وخضع محلل الخلايا للطرد المركزي عند 12,000 rpm لمدة 15 min لفصل الأجزاء الذائبة (السائل الفوقاني) والمترسبة (الراسب). (Jiang et al. 2015)

موضوعات ذات صلة

حقائق جديرة بالمعرفة

E.coli

Escherichia coli (E. coli) هي بكتيريا قولونية سالبة الغرام، ولاهوائية اختيارية، وعصوية الشكل، تنتمي إلى جنس Escherichia، وتوجد عادةً في الجزء السفلي من أمعاء الكائنات ذات الدم الحار (داخلية الحرارة). ويوجد عدد كبير من سلالات E. coli (أو أنماطها الفرعية) ذات خصائص متنوعة. ومعظم سلالات E. coli غير ضارة للإنسان، مثل سلالات B وسلالات K-12 التي تُستخدم عادةً في التطبيقات البحثية في المختبرات. ومع ذلك، فإن بعض السلالات ضارة ويمكن أن تسبب أمراضًا خطيرة.
تؤدي E. coli دورًا مهمًا في الهندسة الحيوية الحديثة وعلم الأحياء الدقيقة الصناعي، إذ يسهل التعامل مع هذه البكتيريا وتعديلها. وتشمل التطبيقات المختبرية الشائعة التي كثيرًا ما تستخدم E. coli إنشاء الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) المؤتلف، أو استخدامها ككائن حي نموذجي.
تُعد E. coli مضيفًا متعدد الاستخدامات للغاية لإنتاج البروتينات غير المتجانسة المنشأ، وتتوفر أنظمة عديدة للتعبير عن البروتين لإنتاج البروتينات المؤتلفة في E. coli. وباستخدام بلازميدات تتيح التعبير عن البروتين بمستوى مرتفع، يمكن إدخال الجينات إلى البكتيريا، مما يتيح إنتاج هذه البروتينات بكميات كبيرة في عمليات التخمير الصناعية.
تُستخدم E.coli كمصانع خلوية لإنتاج الإنسولين. وتشمل التطبيقات الأخرى استخدام خلايا E. coli المعدلة لتطوير اللقاحات والإنزيمات المثبتة وإنتاجها، وإنتاج الوقود الحيوي، وكذلك المعالجة الحيوية للملوثات.
السلالة K-12 شكل طافر من E. coli يفرط في التعبير عن إنزيم الفوسفاتاز القلوي (ALP). وتحدث هذه الطفرة بسبب خلل في الجين الذي يرمز باستمرار إلى الإنزيم. وإذا كان الجين ينتج ناتجًا دون أي تثبيط، فإن ذلك يُعرف بالنشاط التأسيسي. ويُستخدم هذا الشكل الطافر المحدد لعزل إنزيم ALP وتنقيته.
كما تُستخدم بكتيريا E. coli على نطاق واسع كمصانع خلوية. ويمكن استخدام الميكروبات المهندسة (مثل البكتيريا) والخلايا النباتية فيما يُسمى المصانع الخلوية. وتنتج هذه الخلايا المعدلة وراثيًا جزيئات ومواد كيميائية وبوليمرات وبروتينات ومواد أخرى تُستخدم، على سبيل المثال، في الصناعات الدوائية والغذائية والكيميائية. ولتحرير الجزيئات المنتجة داخل هذه الخلايا المهندسة حيويًا، يُعد التحليل بالموجات فوق الصوتية طريقة شائعة لتفكيك جدران الخلايا ونقل المواد المستهدفة إلى السائل المحيط. اقرأ المزيد عن تحليل الخلايا المهندسة حيويًا!

قص DNA بالموجات فوق الصوتية

تُعد قوى القص بالموجات فوق الصوتية طريقة شائعة الاستخدام لتحرير الجزيئات والعضيات والبروتينات من داخل الخلية، وكذلك لتقطيع سلاسل DNA إلى أجزاء. ويفكك التجويف الصوتي جدران الخلايا وأغشيتها لاستخلاص DNA من الخلايا وتوليد قطع يبلغ طولها نحو 600 – 800 bp، وهو طول مثالي للتحليل.
انقر هنا لمعرفة المزيد عن المجانسات بالموجات فوق الصوتية لتجزئة DNA!

المؤلفات / المراجع

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

تقنيات موجات فوق صوتية عالية الأداء! تغطي مجموعة منتجات Hielscher النطاق الكامل، من جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية المختبري المدمج، مرورًا بالوحدات المنضدية، وصولًا إلى أنظمة الموجات فوق الصوتية الصناعية الكاملة.

تصنع Hielscher Ultrasonics مجانسات بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء بأحجام تتراوح من الحجم المختبري إلى الحجم الصناعي.