تحلل بالموجات فوق الصوتية من الإشريكية القولونية
- بكتيريا الإشريكية القولونية هي البكتيريا الأكثر استخداما في علم الأحياء الدقيقة والتكنولوجيا الحيوية.
- تقدم مخللات الخلايا بالموجات فوق الصوتية نتائج موثوقة وقابلة للتكرار لتحلل الإشريكية القولونية.
- تؤدي قوى التجويف والقص المكثفة التي يمكن التحكم فيها بدقة إلى اضطراب كامل وإنتاجية استخراج عالية (مثل البروتينات والحمض النووي).
لماذا يعتبر تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية للإشريكية القولونية الطريقة المفضلة؟
توفر المجانسات بالموجات فوق الصوتية أو الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار العديد من المزايا لتحلل الإشريكية القولونية حيث تعمل الموجات فوق الصوتية المكثفة على تعطيل جدران الخلايا والأغشية بكفاءة. تستخدم الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار على نطاق واسع لتحلل الإشريكية القولونية للأسباب التالية:
يتم استخراج البروتين من خلايا E.coli بكفاءة باستخدام مسبار بالموجات فوق الصوتية UP200St
يوفر جهاز الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار العديد من المزايا لتحلل الإشريكية القولونية. يسمح التحكم الموثوق والدقيق في معلمات العملية بالموجات فوق الصوتية بتحسين معلمات التشغيل مثل الطاقة والمدة ومعالجة العينات لتحقيق النتائج المرجوة.
التحليلات الكهربائية للحمض النووي الجينومي للإشريكية القولونية EDL933 تخضع للموجات فوق الصوتية 0 - 15 دقيقة. L يشير إلى سلم الحمض النووي.
(دراسة وصورة: ©Basselet et al. 2008)
اضطراب الخلايا باستخدام التجويف بالموجات فوق الصوتية
تعمل المجانسات من نوع المسبار بالموجات فوق الصوتية مع حوالي 20000 دورة في الثانية (عند 20 كيلو هرتز) وتسبب التجويف في السوائل أو المعلقات. مناطق مجهرية ذات تجويف صوتي من الضغوط الشبيهة بالفراغ ودرجات الحرارة المرتفعة التي تمزق الخلايا. على الرغم من أن درجات الحرارة قد تصل إلى عدة آلاف من الدرجات المئوية ، إلا أن أحجام التجويف صغيرة جدا بحيث لا تسخن العملية بشكل كبير. الموجات فوق الصوتية ولدت التجويف الصوتي وقوى القص ثقب أو كسر غشاء الخلية من الخلايا البكتيرية مثل E.coli. الموجات فوق الصوتية Hielscher تسمح بالتحكم الدقيق في معلمات العملية مثل كثافة الموجات فوق الصوتية والسعة ومدخلات الطاقة ودرجة الحرارة. وبالتالي ، يمكن ضبط عملية التحلل بالموجات فوق الصوتية على النحو الأمثل لنوع الخلية وثقافة الخلية وهدف العملية.
- التحكم الدقيق في التحلل (الشدة ، السعة ، درجة الحرارة)
- نتائج موثوقة وقابلة للتكرار
- التكيف الأمثل مع عينات محددة
- التحكم في درجة الحرارة
- للعينات الصغيرة جدا إلى الكبيرة جدا (ميكرولتر إلى لتر)
- المعالجة الميكانيكية البحتة
- عملية سهلة الاستخدام وآمنة
- التوسع الخطي من المختبر إلى الإنتاج
VialTweeter للتحلل بالموجات فوق الصوتية
الخالط بالموجات فوق الصوتية مقابل تقنيات التحلل الأخرى
في حين أن التحلل الكيميائي والأنزيمي يمكن أن يكون مشكلة – نظرا لأن التحلل الكيميائي يمكن أن يغير هياكل البروتين ويسبب مشاكل التنقية ويتطلب التحلل الأنزيمي أوقات حضانة طويلة وغير قابل للتكرار – الاضطراب بالموجات فوق الصوتية هو طريقة متطورة وسريعة لتعطيل الخلايا.
يعتمد التحلل بالموجات فوق الصوتية على القوى الميكانيكية فقط. لا يتم إضافة أي مواد كيميائية ، صوتنة يكسر جدار الخلية بواسطة قوى القص. يمكن أن يغير التحلل الكيميائي بنية البروتين ويسبب مشاكل التنقية. يتطلب الاضطراب الأنزيمي أوقات حضانة طويلة وغير قابل للتكرار. تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية لخلايا بكتيريا E.coli سريع وبسيط وموثوق وقابل للتكرار. هذا هو السبب في استخدام الموجات فوق الصوتية Hielscher في المختبرات البيولوجية والكيميائية الحيوية في جميع أنحاء العالم لإعداد العينات، قبل التحليلات، diagonstics في المختبر والمقايسات المتعددة.
توصيات عامة للتحلل بالموجات فوق الصوتية
Sonication هي التقنية الأكثر شيوعا لتحليل كميات صغيرة جدا ومتوسطة وكبيرة من معلقات الخلايا – من بيكو لتر تصل إلى 100 لتر / ساعة (باستخدام خلية تدفق بالموجات فوق الصوتية). يتم تحلل الخلايا عن طريق القص السائل والتجويف. يتم قص الحمض النووي أيضا أثناء الصوتنة ، لذلك ليس من الضروري إضافة DNase إلى تعليق الخلية.
التحكم في درجة الحرارة أثناء تحلل الإشريكية القولونية بالموجات فوق الصوتية
عن طريق التبريد المسبق للعينة والحفاظ على العينة أثناء صوتنة على الجليد ، يمكن بسهولة منع التدهور الحراري للعينة من العينة.
من الناحية المثالية ، يجب أن تبقى العينات باردة أثناء التحلل ، ولكن بالنسبة لمعظم العينات تكون كافية إذا لم ترتفع درجة الحرارة فوق درجة حرارة المزرعة أو مصدر الأنسجة. ولذلك فمن المستحسن, للحفاظ على تعليق على الجليد وصوتنة مع العديد من نبضات الموجات فوق الصوتية قصيرة من 5-10 ثانية وتوقف مؤقت من 10-30 ثانية. أثناء فترات التوقف ، يمكن أن تتبدد الحرارة من أجل إعادة إنشاء درجة حرارة منخفضة. بالنسبة لعينات الخلايا الأكبر حجما ، تتوفر مفاعلات خلايا التدفق المختلفة ذات سترات التبريد.
اقرأ هنا نصائح وتوصيات مفصلة لتحلل بالموجات فوق الصوتية ناجحة!
بروتوكولات لإعداد بالموجات فوق الصوتية من المحللة الإشريكية القولونية
يستخدم الباحثون الخالطات بالموجات فوق الصوتية Hielscher لتعطيل خلايا E.coli. أدناه يمكنك العثور على العديد من البروتوكولات التي تم اختبارها وثبتها لتحلل الإشريكية القولونية باستخدام المجانسات بالموجات فوق الصوتية Hielscher لمختلف التطبيقات المتعلقة بالإشريكية القولونية.
نمو الخلايا ، تشابك وإعداد مستخلصات خلايا الإشريكية القولونية باستخدام الموجات فوق الصوتية
بالنسبة ل SeqA و RNA polymerase ، نمت ChIP-Chip E. coli MG1655 أو MG1655 ΔseqA عند 37 درجة مئوية إلى OD600 من حوالي 0.15 في 50 مل رطل (+ 0.2٪ جلوكوز) قبل إضافة 27 ميكرولتر من الفورمالديهايد (37٪) لكل وسط مل (التركيز النهائي 1٪). تم إجراء التشابك عند الاهتزاز البطيء (100 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة متبوعا بالتبريد ب 10 مل من 2.5 متر جليكاين (التركيز النهائي 0.5 متر). بالنسبة لتجارب الصدمة الحرارية ، نمت الإشريكية القولونية MG1655 في وسط 65 مل رطل عند 30 درجة مئوية إلى OD600 من حوالي 0.3. بعد ذلك تم نقل 30 مل من المستزرع إلى دورق تم تسخينه مسبقا عند 43 درجة مئوية والباقي عند 30 درجة مئوية. كان التشابك والتبريد كما هو موضح أعلاه باستثناء أنه تم الاحتفاظ بالخلايا عند 30 أو 43 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل مزيد من الاهتزاز البطيء في درجة حرارة الغرفة. تم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسلها مرتين باستخدام TBS البارد (pH7.5). بعد إعادة التعليق في محلول تحلل 1 مل (10 مللي مول تريس (درجة الحموضة 8.0) ، 20٪ سكروز ، 50 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول EDTA ، 10 ملغ / مل ليزوزيم) والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تليها إضافة 4 مل من المخزن المؤقت IP ، تم صوتنة الخلايا على الجليد مع 12 مرة 30 ثانية و 30 ثانية فواصل باستخدام معالج الموجات فوق الصوتية Hielscher UP400St في إعداد الطاقة بنسبة 100٪. بعد الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 9000 جم ، تم تخزين 800 ميكرولتر من المادة الطافية عند -20 درجة مئوية. (والدمينغهاوس 2010)
الإفراط في إنتاج وتنقية الإنزيمات باستخدام مسبار بالموجات فوق الصوتية
بالنسبة للإفراط في إنتاج البروتينات الموسومة بالديكاهيستيدين (His10) ، تم تحويل E. coli BL21 (DE3) باستخدام تركيبات pET19b. تم حصاد الزراعة المسبقة بين عشية وضحاها عن طريق الطرد المركزي ، وتم استخدام 1٪ لتلقيح ثقافة التعبير. نمت الخلايا التي تحمل pET19mgtB عند 22 درجة مئوية حتى كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD600) تبلغ 0.7. تم نقل الاستزراع إلى 17 درجة مئوية وحفزه 100 ميكرومتر IPTG. بعد 16 ساعة ، تم حصاد الاستزراع بالطرد المركزي عند 7500 × جم عند 4 درجات مئوية. تم إعادة تعليق الخلايا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 50 مللي متر (PBS) مع 0.3 M كلوريد الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4 وتعطلت عن طريق الموجات فوق الصوتية مع سونوترود S2 micro-tip في الموجات فوق الصوتية Hielscher UP200St في دورة 0.5 وسعة 75٪.
تم تحفيز الإفراط في إنتاج GtfC الموسوم بالديكاهيستيدين عند 37 درجة مئوية عند OD600 من 0.6 مع 100 ميكرومتر IPTG. ثم تم تحضين الخلايا لمدة 4 ساعات ، وحصادها ، وتحللها كما هو مذكور أعلاه ل MgtB.
تم طرد مستخلصات الخلايا الخام بالطرد المركزي عند 15000 × جم و 4 درجات مئوية لترسب حطام الخلية. تم تحميل المستخلصات الموضحة على أعمدة HisTrap FF Crude سعة 1 مل باستخدام نظام ÄKTAprime Plus. تم تنقية الإنزيمات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للشطف المتدرج للبروتينات الموسومة به. تم تحليل محاليل البروتين المفرغة مرتين مقابل 1000 حجم من 50 مللي مول PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، مع 0.3 M كلوريد الصوديوم عند 4 درجات مئوية. تم تحليل التنقية بنسبة 12٪ SDS-PAGE. تم تحديد تركيز البروتين بواسطة طريقة برادفورد باستخدام Roti-Quant. (رابوش وآخرون 2013)
استخراج البروتين بالموجات فوق الصوتية من بكتيريا الإشريكية القولونية
يتم دمج بروتين الطعم المثير للاهتمام (في هذه الحالة ، MTV1 من Arabidopsis thaliana) في علامة GST ويتم التعبير عنه في خلايا BL21 Escherichia coli (E. coli).
- خذ حبة واحدة من GST-MTV1 و GST (المقابلة ل 50 مل من الثقافة البكتيرية) وأعد تعليق كل منها في مخزن مؤقت لاستخراج الجليد البارد سعة 2.5 مل.
- استخدام الموجات فوق الصوتية UP100H (مجهزة MS3 microtip-sonotrode لأحجام صغيرة من حوالي 2-5mL) لتعطيل الخلايا البكتيرية حتى يتم تحليلها ، وهو ما يشار إليه من خلال انخفاض العتامة وزيادة اللزوجة. يجب أن يتم ذلك على الجليد ، ويوصى بصوتنة على فترات (على سبيل المثال ، صوتنة 10 ثوان متبوعة بتوقف مؤقت لمدة 10 ثوان على الجليد وما إلى ذلك). يجب الحرص على عدم صوتنة بكثافة عالية جدا. إذا تم الكشف عن رغوة أو تشكيل راسب أبيض ، فيجب خفض الشدة.
- انقل محلول البكتيريا المحللة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 16000 × جم لمدة 20 دقيقة.
مسبار نوع الموجات فوق الصوتية مثل UP400St استخدم مبدأ عمل التجويف الصوتي للتحلل الفعال للإشريكية القولونية.
تحليل التعبير وتنقية البروتين المؤتلف باستخدام Sonication
تم صوتنة بيليه الإشريكية القولونية باستخدام الموجات فوق الصوتية Hielscher UP100H. لهذا الغرض ، تم إعادة تعليق حبيبات الخلية في محلول تحلل مبرد (50 mM Tris-HCl pH = 7.5 ، 100 mM NaCl ، 5 mM DTT ، 1 mM PMSF) وتبريدها على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تم صوتنة تعليق الخلية ب 10 رشقات نارية قصيرة من 10 ثوان متبوعة بفاصل 30 ثانية للتبريد. أخيرا ، تمت إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 14000 دورة في الدقيقة. لتأكيد تعبير rPR ، تم تشغيل المادة الطافية على 12٪ من هلام بولي أكريلاميد وتم تحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي. تم تنقية rPR باستخدام راتنج Ni2 + -NTA (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقا لدليل الشركة المصنعة. في هذه المرحلة ، تم استخدام طريقة التنقية الأصلية. تم تقييم نقاء البروتين المنقى باستخدام الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد 12٪ وتلطيخ أزرق كوماسي اللاحق. تم قياس تركيز البروتين المنقى بواسطة مجموعة فحص البروتين Micro BCA (بيرس ، الولايات المتحدة الأمريكية). (أزارنزهاد وآخرون 2016)
المجانسات بالموجات فوق الصوتية لتحلل الإشريكية القولونية
Hielscher Ultrasonics تصميم وتصنيع وتوريد المجانسات بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء لتحلل موثوق وفعال من البكتيريا الإشريكية القولونية وغيرها من أنواع الخلايا والأنسجة والثقافات الخلية.
تتيح لنا مجموعة واسعة من المجسات بالموجات فوق الصوتية بالإضافة إلى أنظمة الصوتنة غير المباشرة أن نقدم لك خالط الأنسجة بالموجات فوق الصوتية المثالي لتعطيل الخلايا وتطبيق الاستخراج.
التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صنع في ألمانيا
Hielscher الموجات فوق الصوتية معروفة جيدا لأعلى معايير الجودة والتصميم. البرامج الذكية، قائمة بديهية، إعدادات قابلة للبرمجة وبروتوكول البيانات التلقائي ليست سوى عدد قليل من الميزات من الموجات فوق الصوتية Hielscher. المتانة وسهولة التشغيل تسمح بالتكامل السلس للموجات فوق الصوتية لدينا في مرافق البحث والتكنولوجيا الحيوية. حتى الظروف القاسية والبيئات الصعبة يتم التعامل معها بسهولة بواسطة الموجات فوق الصوتية Hielscher.
Hielscher Ultrasonics هي شركة حاصلة على شهادة الأيزو وتركز بشكل خاص على الموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. بطبيعة الحال، الموجات فوق الصوتية Hielscher هي CE المتوافقة وتلبية متطلبات UL، وكالة الفضاء الكندية وبنفايات.
يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزة الموجات فوق الصوتية لدينا:
| حجم الدفعة | معدل التدفق | الأجهزة الموصى بها |
|---|---|---|
| لوحات متعددة الآبار / microtiter | ن.أ. | UIP400MTP |
| CupHorn للقوارير أو الدورق | ن.أ. | كوب بالموجات فوق الصوتيةهورن |
| مفاعل التدفق الجزئي بالموجات فوق الصوتية | ن.أ. | جي دي ميني2 |
| ما يصل إلى 10 قوارير مع 0.5 إلى 1.5 مل | ن.أ. | VialTweeter |
| 0.5 إلى 1.5 مل | ن.أ. | VialTweeter |
| 1 إلى 500 مل | 10 إلى 200 مل / دقيقة | UP100H |
| 10 إلى 2000 مل | 20 إلى 400 مل / دقيقة | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 إلى 20 لتر | 0.2 إلى 4 لتر / دقيقة | UIP2000hdT |
| 10 إلى 100 لتر | 2 إلى 10 لتر / دقيقة | UIP4000 |
| ن.أ. | 10 إلى 100 لتر / دقيقة | UIP16000 |
| ن.أ. | أكبر | مجموعة من UIP16000 |
اتصل بنا! / اسألنا!
بروتوكولات إضافية لتحلل الإشريكية القولونية بالموجات فوق الصوتية
البروتينات المعدلة بالأليسين في الإشريكية القولونية باستخدام VialTweeter بالموجات فوق الصوتية
تحديد محتويات سلفهيدريل بواسطة 5،5 ′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) مقايسة
تم استخدام مزرعة E. coli MG1655 بين عشية وضحاها لتلقيح MOPS الحد الأدنى من الوسط (1: 100). نمت الثقافة الهوائية حتى تم الوصول إلى A600 من 0.4. تم تقسيم الثقافة إلى ثلاث ثقافات سعة 15 مل لعلاج الإجهاد. كانت الثقافة غير المعالجة بمثابة عنصر تحكم سلبي. تمت إضافة 0.79 mM allicin (128 μg ml-1) أو 1 mM diamide إلى إحدى الثقافتين المتبقيتين لكل منهما. تم تحضين المستنبتات لمدة 15 دقيقة ، وتم حصاد 5 مل من كل مزرعة عن طريق الطرد المركزي (8525 × جم ، 4 درجات مئوية ، 10 دقائق). تم غسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من PBS (137 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 10 mM Na2HPO4 ، 2 mM KH2PO4 ، pH 7.4 ، مخزنة لاهوائيا قبل الاستخدام) والطرد المركزي (13000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 10 دقائق). تم إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للتحلل (PBS مع 6 mM guanidinium HCl ، درجة الحموضة 7.4) قبل الاضطراب عند 4 درجات مئوية عن طريق الموجات فوق الصوتية (VialTweeter الموجات فوق الصوتية، Hielscher GmbH، ألمانيا) (3 × 1 دقيقة). تم تكوير حطام الخلايا بواسطة الطرد المركزي (13000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 15 دقيقة). تم نقل المادة الطافية إلى كفيت QS-macro سعة 3.5 مل (10 مم) مع شريط تحريك مغناطيسي وخلطها مع 1 مل من محلول التحلل. تم رصد انقراض العينات عند 412 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي Jasco V-650 المجهز بحامل الخلية PSC-718 الذي يتم التحكم في درجة حرارته في درجة حرارة الغرفة. تمت إضافة 100 ميكرولتر من محلول ثنائي ثيوبيس 3 مللي متر (حمض 2-نيتروبنزويك). تم رصد الانقراض حتى وصل إلى التشبع. تم حساب تركيز الثيول باستخدام معامل الانقراض ε412 = 13,700 م-1 سم-1 لحمض ثيو-2-نيتروبنزويك (TNB). تم حساب تركيزات الثيول الخلوي على أساس حجم خلايا الإشريكية القولونية 6.7 × 10-15 لتر وكثافة خلية A600 = 0.5 (أي ما يعادل 1 × 108 خلايا مل-1 الثقافة). (مولر وآخرون 2016)
في الجسم الحي الجلوتاثيون تحديد باستخدام كسارة الخلايا بالموجات فوق الصوتية
نمت E.coli MG1655 في وسط MOPS الحد الأدنى في حجم إجمالي 200 مل حتى تم الوصول إلى A600 من 0.5. تم تقسيم الثقافة إلى ثقافات 50 مل لعلاج الإجهاد. بعد 15 دقيقة من الحضانة مع 0.79 mM allicin أو 1 mM diamide أو dimethyl sulfoxide (السيطرة) ، تم حصاد الخلايا عند 4000 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت KPE قبل إعادة تعليق الكريات في 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت KPE. لإزالة البروتين ، تمت إضافة 300 لتر من 10٪ (وزن / حجم) حمض السلفوساليسيليك قبل تعطيل الخلايا عن طريق الموجات فوق الصوتية (3 × 1 دقيقة ؛ VialTweeter بالموجات فوق الصوتية). تم جمع المواد الطافية بعد الطرد المركزي (30 دقيقة ، 13000 جرام ، 4 درجات مئوية). انخفضت تركيزات حمض السلفوساليسيليك إلى 1٪ بإضافة 3 أحجام من المخزن المؤقت KPE. تم إجراء قياسات الجلوتاثيون الكلي و GSSG كما هو موضح أعلاه. تم حساب تركيزات الجلوتاثيون الخلوية على أساس حجم خلايا الإشريكية القولونية 6.7×10-15 لتر وكثافة خلية A600 0.5 (ما يعادل 1×108 خلايا مل-1 الثقافة). تم حساب تركيزات GSH عن طريق طرح 2 [GSSG] من إجمالي الجلوتاثيون. (مولر وآخرون 2016)
التعبير عن mAspAT البشري في الإشريكية القولونية باستخدام الخالط بالموجات فوق الصوتية
مستعمرة واحدة من E. coli BL21 (DE3) تؤوي متجه التعبير في 30 مل من وسط Luria-Bertani (LB) الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين ، ثم تزرع عند 37 درجة مئوية حتى الكثافة البصرية (OD600) 0.6. تم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 10 دقائق ، وإعادة تعليقها في وسط LB جديد سعة 3 لتر يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين.
بعد ذلك ، تم تحفيز التعبير البروتيني باستخدام 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) لمدة 20 ساعة عند 16 درجة مئوية. تم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 15 دقيقة وغسلها بالمخزن المؤقت A (20 mM NaH2PO4 ، 0.5 M NaCl ، درجة الحموضة 7.4). تم الحصول على خلايا 45 جم (الوزن الرطب) تقريبا من مزرعة 3 لتر. بعد الطرد المركزي ، تم إعادة تعليق كريات الخلية في 40 مل (ل 1 لتر مزرعة) عازلة لاستخراج الجليد البارد A ، وتم تحليلها بواسطة الموجات فوق الصوتية عند درجة حرارة الجليد البارد باستخدام كسارة الخلايا بالموجات فوق الصوتية Hielscher UP400St. تم طرد تحلل الخلية بالطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة لفصل الكسور القابلة للذوبان (الطافية) والمترسبة (الحبيبات). (جيانغ وآخرون 2015)
حقائق تستحق المعرفة
الإشريكية القولونية
الإشريكية القولونية (E. coli) هي بكتيريا قولونية سالبة الجرام ، لاهوائية اختيارية ، على شكل قضيب ، من جنس الإشريكية التي توجد عادة في الأمعاء السفلية للكائنات الحية ذوات الدم الحار (ماص للحرارة). هناك عدد كبير من سلالات الإشريكية القولونية (أو الأنواع الفرعية) ذات الخصائص المتنوعة. معظم سلالات الإشريكية القولونية غير ضارة للبشر ، على سبيل المثال سلالات B و K-12 التي تستخدم عادة لتطبيقات البحث في المختبرات. ومع ذلك ، فإن بعض السلالات ضارة ويمكن أن تسبب مرضا خطيرا.
تلعب الإشريكية القولونية دورا مهما في الهندسة البيولوجية الحديثة وعلم الأحياء الدقيقة الصناعي حيث يسهل التلاعب بالبكتيريا. التطبيقات المعملية الشائعة التي تنطوي في كثير من الأحيان على استخدام الإشريكية القولونية ، على سبيل المثال لإنشاء حمض الديوكسي ريبونوكلييك المؤتلف (DNA) أو للعمل ككائن نموذجي.
الإشريكية القولونية هي مضيف متعدد الاستخدامات لإنتاج البروتينات غير المتجانسة ، وتتوفر أنظمة تعبير البروتين المتعددة لإنتاج البروتينات المؤتلفة في الإشريكية القولونية. باستخدام البلازميدات التي تسمح بالتعبير عن مستوى عال من البروتين ، يمكن إدخال الجينات في البكتيريا ، والتي تمكن من إنتاج هذه البروتينات بكميات كبيرة في عمليات التخمير الصناعية.
تستخدم الإشريكية القولونية كمصانع للخلايا لإنتاج الأنسولين. وتشمل التطبيقات الأخرى استخدام خلايا الإشريكية القولونية المعدلة لتطوير وإنتاج اللقاحات والإنزيمات الثابتة، لإنتاج الوقود الحيوي، وكذلك للمعالجة الحيوية.
السلالة K-12 هي شكل متحور من الإشريكية القولونية التي تفرط في التعبير عن إنزيم الفوسفاتيز القلوي (ALP). تحدث هذه الطفرة بسبب خلل في الجين الذي يرمز باستمرار للإنزيم. إذا كان الجين ينتج منتجا دون أي تثبيط ، فإن هذا يعرف بالنشاط التأسيسي. يستخدم هذا الشكل الطافر المحدد لعزل وتنقية إنزيم ALP.
كما تستخدم بكتيريا الإشريكية القولونية على نطاق واسع كمصانع للخلايا. يمكن استخدام الميكروبات المهندسة (مثل البكتيريا) والخلايا النباتية كمصانع خلايا مزعومة. تنتج هذه الخلايا المعدلة وراثيا جزيئات ومواد كيميائية وبوليمرات وبروتينات ومواد أخرى ، والتي تستخدم على سبيل المثال في صناعة الأدوية والأغذية والمواد الكيميائية. من أجل إطلاق الجزيئات المنتجة في داخل هذه الخلايا المهندسة بيولوجيا ، يعد التحلل بالموجات فوق الصوتية طريقة شائعة لتعطيل جدران الخلايا ونقل المواد المستهدفة إلى السائل المحيط. اقرأ المزيد عن تحلل الخلايا المهندسة بيولوجيا!
قص الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية
قوى القص بالموجات فوق الصوتية هي طريقة شائعة الاستخدام لإطلاق الجزيئات والعضيات والبروتينات من داخل الخلية وكذلك لكسر خيوط الحمض النووي إلى أجزاء. التجويف الصوتي يكسر جدران الخلايا والأغشية لاستخراج الحمض النووي من الخلايا وتوليد شظايا من حوالي 600 – 800 نقطة أساس في الطول ، وهو مثالي للتحليل.
انقر هنا لمعرفة المزيد عن المجانسات بالموجات فوق الصوتية لتجزئة الحمض النووي!
الأدب / المراجع
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع الخالط بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء من المختبر ل الحجم الصناعي.