التحلل بالموجات فوق الصوتية للخلايا المهندسة حيويًا في الإنتاج الصناعي

تُستخدم على نطاق واسع في التكنولوجيا الحيوية أنواع البكتيريا المهندسة حيويًا، مثل E. coli، وكذلك أنواع خلايا الثدييات والخلايا النباتية المعدلة وراثيًا، للتعبير عن الجزيئات. ولتحرير هذه الجزيئات الحيوية المُصنَّعة، يلزم استخدام تقنية موثوقة لتفكيك الخلايا. وتُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء طريقة مثبتة للتحلل الخلوي بكفاءة وموثوقية – ويمكن توسيع نطاقها بسهولة لتلبية معدلات معالجة مرتفعة. تقدم لكم Hielscher Ultrasonics معدات بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء لتحقيق تحلل خلوي فعال بهدف إنتاج كميات كبيرة من الجزيئات الحيوية عالية الجودة.

استخلاص الجزيئات من مصانع الخلايا

لإنتاج طيف واسع من الجزيئات الحيوية، يمكن استخدام ميكروبات وخلايا نباتية متنوعة مهندسة بوصفها مصانع خلايا ميكروبية، بما فيها Escherichia coli وBacillus subtilis وPseudomonas putida وStreptomyces وCorynebacterium glutamicum وLactococcus lacti وCyanobacteria وSaccharomyces cerevisiae وPichia pastoris وYarrowia lipolytica وNicotiana benthamiana والطحالب، إلى جانب أنواع أخرى كثيرة. ويمكن لمصانع الخلايا هذه إنتاج البروتينات والدهون والمواد الكيميائية الحيوية والبوليمرات والوقود الحيوي والمواد الكيميائية المشتقة من الزيوت والدهون، التي تُستخدم أغذيةً أو مواد خام للتطبيقات الصناعية. وتُستنبت الخلايا المستخدمة بوصفها مصانع خلايا في مفاعلات حيوية مغلقة، حيث يمكنها تحقيق كفاءة عالية ونوعية مرتفعة ومتطلبات منخفضة من الطاقة.
لعزل الجزيئات المستهدفة من مزارع الخلايا المهندسة حيويًا، يجب تفكيك الخلايا لتحرير المواد الموجودة داخلها. وقد ترسخ استخدام أجهزة تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية بوصفها تقنية عالية الموثوقية والكفاءة لتفكيك الخلايا وتحرير المركبات.

مصانع الخلايا الميكروبية هي خلايا مهندسة أيضيًا تُستخدم لتخليق مركبات قيّمة متنوعة. ويُعد تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية طريقة فعالة وموثوقة لتحرير المركبات القيّمة من داخل الخلايا.
الدراسة والرسم: ©Villaverde, 2010.

مزايا أجهزة تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية

بوصفها تقنية غير حرارية ولطيفة، ومع ذلك عالية الكفاءة، تُستخدم أجهزة التفكيك بالموجات فوق الصوتية في المختبر والصناعة لتحليل الخلايا وإنتاج مستخلصات عالية الجودة، تُستخدم مثلًا لعزل الجزيئات من مصانع الخلايا.

الموجات فوق الصوتية عالية القدرة لتفكيك مصانع الخلايا الميكروبية بكفاءة

آلية أجهزة تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية وتأثيراتها:
يستخدم تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية قدرة الموجات فوق الصوتية. ويُجهَّز المجانس بالموجات فوق الصوتية / جهاز تفكيك الخلايا بمسبار (يُعرف أيضًا باسم سونوترود) مصنوع من سبيكة تيتانيوم، يهتز بتردد عالٍ يبلغ نحو 20 kHz. وهذا يعني أن المسبار فوق الصوتي يقرن 20,000 اهتزاز في الثانية بالسائل الخاضع للمعالجة بالموجات فوق الصوتية. وتتميز الموجات فوق الصوتية المقترنة بالسائل بدورات متناوبة من الضغط المرتفع / الضغط المنخفض. وخلال دورة الضغط المنخفض، يتمدد السائل وتتكون فقاعات فراغية دقيقة. وتنمو هذه الفقاعات الصغيرة جدًا على مدى عدة دورات ضغط متناوبة إلى أن تعجز عن امتصاص أي طاقة إضافية. عند هذه النقطة، تنهار فقاعات التجويف بعنف وتُنشئ موضعيًا بيئة ذات كثافة طاقة استثنائية. وتُعرف هذه الظاهرة باسم التجويف الصوتي، وتتميز موضعيًا بدرجات حرارة مرتفعة جدًا وضغوط عالية جدًا وقوى قص. وتُحطِّم إجهادات القص هذه جدران الخلايا بكفاءة وتزيد انتقال الكتلة بين داخل الخلية والمذيب المحيط بها. وبوصفها تقنية ميكانيكية بحتة، تُستخدم قوى القص المتولدة بالموجات فوق الصوتية على نطاق واسع، وهي الإجراء الموصى به لتفكيك الخلايا البكتيرية وكذلك لعزل البروتينات. وبوصفها طريقة بسيطة وسريعة لتفكيك الخلايا، تُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية مثالية للعزل من أحجام صغيرة ومتوسطة وكبيرة. وتُجهَّز أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية الرقمية من Hielscher بقائمة إعدادات واضحة للتحكم الدقيق في المعالجة بالموجات فوق الصوتية. وتُخزَّن جميع بيانات المعالجة بالموجات فوق الصوتية تلقائيًا على بطاقة SD مدمجة، ويمكن الوصول إليها بسهولة. وتضمن خيارات تبديد الحرارة المتطورة، مثل التبريد الخارجي والمعالجة بالموجات فوق الصوتية في الوضع النبضي وغيرها، أثناء عملية التفكيك بالموجات فوق الصوتية، الحفاظ على درجة الحرارة المثالية للعملية، ومن ثم سلامة المركبات المستخلصة الحساسة للحرارة.

الأبحاث تؤكد نقاط قوة تفكيك الخلايا والاستخلاص بالموجات فوق الصوتية

يلخص الأستاذ Chemat وزملاؤه (2017) في دراستهم أن «الاستخلاص بمساعدة الموجات فوق الصوتية بديل صديق للبيئة ومجدٍ اقتصاديًا للتقنيات التقليدية الخاصة بالأغذية والمنتجات الطبيعية. وتتمثل الفوائد الرئيسية في تقليل زمن الاستخلاص والمعالجة، وكمية الطاقة والمذيبات المستخدمة، والعمليات الوحدوية، وانبعاثات CO₂ ».
استخدم Gabig-Ciminska وزملاؤه (2014) مجانسًا عالي الضغط وجهاز تفكيك خلايا بالموجات فوق الصوتية في دراستهم لتحليل الأبواغ بهدف تحرير DNA. وبعد مقارنة طريقتي تفكيك الخلايا، خلص فريق البحث، فيما يتعلق بالتحلل الخلوي للحصول على DNA الأبواغ، إلى أن «التحليل أُجري باستخدام نواتج التحلل الخلوي الناتجة عن التجانس عالي الضغط. وبعد ذلك، أدركنا أن تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية يتمتع بمزايا بارزة لهذا الغرض. فهو سريع نسبيًا، ويمكن تطبيقه على أحجام صغيرة من العينات». (Gabig-Ciminska et al., 2014)

الجزيئات الحيوية من مصانع الخلايا لإنتاج الأغذية

مصانع الخلايا الميكروبية منهجية إنتاج مجدية وفعالة تستخدم الكائنات الميكروبية لإنتاج مردود مرتفع من المستقلبات الأصلية وغير الأصلية، من خلال الهندسة الحيوية الأيضية للكائنات الدقيقة الميكروبية، مثل البكتيريا والخمائر والفطريات وغيرها. فعلى سبيل المثال، تُنتَج الإنزيمات بكميات كبيرة باستخدام كائنات دقيقة مثل Aspergillus oryzae والفطريات والبكتيريا. وتُستخدم هذه الإنزيمات المنتجة بكميات كبيرة في إنتاج الأغذية والمشروبات، وكذلك في الزراعة والطاقة الحيوية والعناية المنزلية.
تُنتج بعض البكتيريا، مثل Acetobacter xylinum وGluconacetobacter xylinus، السليلوز أثناء عملية التخمير، حيث تُخلَّق الألياف النانوية بعملية بناء من الأسفل إلى الأعلى. ويكافئ السليلوز البكتيري (المعروف أيضًا باسم السليلوز الميكروبي) السليلوز النباتي كيميائيًا، لكنه يتميز بدرجة تبلور عالية ونقاوة مرتفعة (إذ يخلو من اللجنين والهيميسليلوز والبكتين والمكونات الأخرى ذات المنشأ الحيوي)، فضلًا عن بنية فريدة تتمثل في شبكة ثلاثية الأبعاد (3D) منسوجة من ألياف السليلوز النانوية. (راجع Zhong, 2020) وبالمقارنة مع السليلوز المشتق من النباتات، يكون السليلوز البكتيري أكثر استدامة، ويكون السليلوز المنتج نقيًا ولا يتطلب خطوات تنقية معقدة. وتُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية والاستخلاص بالمذيبات باستخدام NaOH أو SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم) فعالين جدًا لعزل السليلوز البكتيري من الخلايا البكتيرية.

الجزيئات الحيوية من مصانع الخلايا لإنتاج المستحضرات الصيدلانية واللقاحات

يُعد الإنسولين البشري من أبرز المنتجات الصيدلانية المشتقة من مصانع الخلايا. ولإنتاج الإنسولين بالهندسة الحيوية، تُستخدم أساسًا E. coli وSaccharomyces cerevisiae. ونظرًا إلى أن الجزيئات ذات الحجم النانوي المُخلَّقة حيويًا توفر توافقًا حيويًا مرتفعًا، فإن الجسيمات النانوية الحيوية، مثل الفيريتين، تتمتع بمزايا في تطبيقات عديدة للتصنيع الحيوي. إضافة إلى ذلك، غالبًا ما يكون الإنتاج باستخدام ميكروبات مهندسة أيضيًا أكثر فعالية بدرجة كبيرة من حيث المردود المتحقق. فعلى سبيل المثال، ازداد إنتاج حمض الأرتيميسينيك والريسفيراترول والليكوبين بمقدار عشرة أضعاف إلى عدة مئات من الأضعاف، وقد أُرسيت بالفعل عمليات إنتاجها على النطاق الصناعي أو يجري تطويرها لهذا النطاق. (راجع Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
فعلى سبيل المثال، تُعد الجزيئات الحيوية البروتينية ذات الحجم النانوي وخصائص التجميع الذاتي، مثل الفيريتين والجسيمات الشبيهة بالفيروسات، مثيرة للاهتمام على نحو خاص في تطوير اللقاحات، لأنها تحاكي حجم العوامل الممرضة وبنيتها، كما تسمح بربط المستضدات بسطحها لتعزيز التفاعل مع الخلايا المناعية. ويُعبَّر عن هذه الجزيئات في ما يُسمى مصانع الخلايا (مثل سلالات E. coli المهندسة)، التي تنتج جزيئًا مستهدفًا معينًا.

بروتوكول التحلل بالموجات فوق الصوتية لخلايا E. coli BL21 لتحرير الفيريتين

الفيريتين بروتين تتمثل وظيفته الأساسية في تخزين الحديد. ويُظهر الفيريتين إمكانات واعدة بوصفه جسيمات نانوية ذاتية التجميع في اللقاحات، حيث يُستخدم حاملًا لتوصيل اللقاح (مثل بروتينات شوكة SARS-Cov-2). ويُظهر البحث العلمي الذي أجراه Sun وزملاؤه (2016) أن الفيريتين المؤتلف يمكن تحريره في صورة قابلة للذوبان من Escherichia coli عند تراكيز منخفضة من NaCl (≤50 mmol/L). وللتعبير عن الفيريتين في E. coli BL21 وتحريره، طُبِّق البروتوكول التالي بنجاح. أُدخل البلازميد المؤتلف pET-28a/ferritin إلى سلالة E coli BL21 (DE3) بالتحول الوراثي. واستُنبِتت خلايا E coli BL21 (DE3) المنتجة للفيريتين في أوساط نمو LB تحتوي على 0.5% كاناميسين عند 37°C، وحُفِّزت عند قيمة OD600 تبلغ 0.6 باستخدام 0.4% إيزوبروبيل-β-D-ثيوغالاكتوبيرانوزيد لمدة 3 ساعات عند 37°C. ثم جُمعت المزرعة النهائية بالطرد المركزي عند 8000g لمدة 10 دقائق عند 4°C، وجُمع الراسب. وبعد ذلك، أُعيد تعليق الراسب في وسط LB (1% NaCl، و1% Typone، و0.5% مستخلص خميرة)/محلول التحلل المنظِّم (20 mmol/L Tris، و50 mmol/L NaCl، و1 mmol/L EDTA، وpH 7.6) وتراكيز مختلفة من محلول NaCl (0، و50، و100، و170، و300 mmol/L)، على التوالي. ولتحليل الخلايا البكتيرية، طُبِّقت المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الوضع النبضي: مثلًا، باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UP400St بسعة اهتزاز 100% ودورة تشغيل تتضمن 5 ثوانٍ من التشغيل و10 ثوانٍ من الإيقاف، لمدة 40 دورة)، ثم أُجري الطرد المركزي عند 10 000g لمدة 15 دقيقة عند 4°C. وحُلِّل السائل الطافي والراسب باستخدام الرحلان الكهربائي في هلام البولي أكريلاميد بوجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE). ومُسحت جميع الهلامات المصبوغة بكبريتات دوديسيل الصوديوم باستخدام ماسح ضوئي عالي الدقة. وحُلِّلت صور الهلامات باستخدام برنامج Magic Chemi 1D. ولتحقيق الوضوح الأمثل، كُشفت حزم البروتينات من خلال ضبط المعلمات. ووُلِّدت بيانات الحزم من مكررات تقنية ثلاثية. (راجع Sun et al., 2016)

أجهزة تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية للتحلل الصناعي لمصانع الخلايا

يُعد التحلل والاستخلاص بالموجات فوق الصوتية طريقة موثوقة وميسرة لتحرير المستقلبات من مصانع الخلايا، مما يساعد على إنتاج الجزيئات المستهدفة بفعالية. وتتوفر أجهزة تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية بأحجام تتراوح من المختبرية إلى الصناعية، ويمكن توسيع نطاق العمليات بصورة خطية تمامًا.
Hielscher Ultrasonics شريككم المتخصص في أجهزة التفكيك بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء، وتتمتع بخبرة طويلة في تركيب الأنظمة فوق الصوتية في التجهيزات المنضدية والبيئات الصناعية.
فيما يتعلق بالأجهزة والبرمجيات المتطورة، تلبي أنظمة تفكيك الخلايا من Hielscher Ultrasonics جميع المتطلبات لتحقيق التحكم الأمثل في العمليات وسهولة التشغيل والاستخدام. ويقدّر عملاء ومستخدمو أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher ميزة إتاحة أجهزة تفكيك الخلايا والاستخلاص بالموجات فوق الصوتية من Hielscher للمراقبة والتحكم الدقيقين في العمليات – عبر شاشة لمس رقمية والتحكم عن بُعد من خلال المتصفح. وتُخزَّن جميع بيانات المعالجة بالموجات فوق الصوتية المهمة (مثل صافي الطاقة والطاقة الإجمالية وسعة الاهتزاز والمدة ودرجة الحرارة والضغط) تلقائيًا في ملف CSV على بطاقة SD مدمجة. ويساعد ذلك على الحصول على نتائج قابلة لإعادة الإنتاج والتكرار، ويسهّل توحيد العمليات وكذلك استيفاء ممارسات التصنيع الجيدة (cGMP).
وبالطبع، صُممت معالجات Hielscher بالموجات فوق الصوتية للعمل بنظام 24/7 تحت الحمل الكامل، ولذلك يمكن تشغيلها بموثوقية في بيئات الإنتاج الصناعي. وبفضل متانتها العالية ومتطلبات صيانتها المنخفضة، يكون زمن توقف المعدات فوق الصوتية منخفضًا جدًا. وتقلل ميزتا CIP (التنظيف في المكان) وSIP (التعقيم في المكان) من أعمال التنظيف المرهقة، ولا سيما أن جميع الأجزاء الملامسة للسائل ذات أسطح معدنية ملساء (دون فتحات أو فوهات مخفية).

يوضح الجدول أدناه القدرة التقريبية على المعالجة لأجهزتنا للمعالجة بالموجات فوق الصوتية: