التحلل بالموجات فوق الصوتية من الخلايا المهندسة بيولوجيا في الإنتاج الصناعي
وتستخدم أنواع البكتيريا المعدلة بيولوجيا مثل الإشريكية القولونية وكذلك أنواع الثدييات المعدلة وراثيا والخلايا النباتية على نطاق واسع في التكنولوجيا الحيوية للتعبير عن الجزيئات. من أجل إطلاق هذه الجزيئات الحيوية المركبة ، هناك حاجة إلى تقنية موثوقة لتعطيل الخلايا. Ultrasonication عالية الأداء هو أسلوب ثبت لتحلل الخلية كفاءة وموثوق بها – قابلة للتحجيم بسهولة إلى الإنتاجية الكبيرة. Hielscher Ultrasonics يقدم لك معدات عالية الأداء بالموجات فوق الصوتية لتحلل الخلايا فعالة من أجل إنتاج كميات كبيرة من الجزيئات الحيوية عالية الجودة.
استخراج جزيئات من مصانع الخلايا
لإنتاج مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية، يمكن استخدام الميكروبات والخلايا النباتية المختلفة المهندسة كمصانع خلايا ميكروبية ، بما في ذلك الإشريكية القولونية ، عصيات subtilis ، Pseudomonas putida ، Streptomyces ، Corynebacterium glutamicum ، لاكتوكوكوس لاكتي ، سيانوباكتيريا ، Saccharomyces cerevisiae ، بيشيا باستوريس ، يارويا ليبوليتيكا ، نيكوتيانا بنثاميانا والطحالب ، من بين أمور أخرى كثيرة. يمكن أن تنتج هذه المصانع الخلية البروتينات والدهون والمواد الكيميائية الحيوية والبوليمرات والوقود الحيوي والمواد الكيميائية الأولية، والتي تستخدم كغذاء أو مواد خام للتطبيقات الصناعية. يتم استزراع الخلايا المستخدمة كمصانع خلايا في المفاعلات الحيوية المغلقة ، حيث يمكنها تحقيق كفاءة عالية وخصوصية ومتطلبات منخفضة للطاقة.
لعزل الجزيئات المستهدفة من ثقافات الخلايا المهندسة بيولوجيا ، يجب تعطيل الخلايا بحيث يتم إطلاق المواد داخل الخلايا. الموجات فوق الصوتية معطلات الخلية راسخة وتقنية موثوقة للغاية وفعالة لتفكك الخلية وإطلاق مركب.
تفكك الخلايا بالموجات فوق الصوتية مثل UIP2000hdT تستخدم لعزل المركبات من مصانع الخلايا الميكروبية.
مصانع الخلايا الميكروبية هي خلايا هندسية استقلابية تستخدم لتركيب مختلف المركبات القيمة. انقطاع الخلية بالموجات فوق الصوتية هو وسيلة فعالة وموثوق بها للافراج عن مركبات قيمة من الداخل الخلية.
دراسة ورسوم بيانية: ©فيلافيردي، 2010.
مزايا الموجات فوق الصوتية الخلايا المعطلون
كما غير الحرارية، خفيفة، ولكن التكنولوجيا ذات الكفاءة العالية، وتستخدم المعطلات بالموجات فوق الصوتية في المختبر والصناعة لlyse الخلايا وإنتاج مقتطفات عالية الجودة، على سبيل المثال تستخدم لعزل جزيئات من مصانع الخلايا.
- كفاءة عالية
- غير حراري، مثالي للمواد الحساسة لدرجة الحرارة
- نتائج موثوقة وقابلة للتكرار
- تحكم معالجة دقيق
- خطي قابل للتحجيم إلى إنتاجية أكبر
- متوفر لقدرات الإنتاج الصناعي
الطاقة بالموجات فوق الصوتية لتعطيل كفاءة مصانع الخلايا الميكروبية
آلية وآثار الموجات فوق الصوتية الخلايا المعطلون:
استخدام انقطاع الخلية بالموجات فوق الصوتية قوة الموجات فوق الصوتية. وقد تم تجهيز المتجانس بالموجات فوق الصوتية / تعطيل الخلية مع التحقيق (الملقب سونوترودي) مصنوعة من سبيكة التيتانيوم التي تتأرجح على تردد عال من حوالي 20 كيلوهرتز. وهذا يعني أن الأزواج التحقيق بالموجات فوق الصوتية 20،000 الاهتزازات في الثانية الواحدة في السائل سونيكاتيد. وتتميز موجات الموجات فوق الصوتية مقرونة في السائل بالتناوب دورات الضغط العالي / الضغط المنخفض. خلال دورة الضغط المنخفض ، يتوسع السائل وتنشأ فقاعات فراغ دقيقة. تنمو هذه الفقاعات الصغيرة جدا على مدى عدة دورات ضغط متناوبة حتى لا تتمكن من امتصاص أي طاقة أخرى. عند هذه النقطة، تنهار فقاعات التجويف بعنف وتخلق محليا بيئة غير عادية كثيفة الطاقة. وتعرف هذه الظاهرة باسم التجويف الصوتي وتتميز بدرجات حرارة عالية جدا محليا، وضغوط عالية جدا، وقوات القص. هذه الضغوط القص كسر جدران الخلايا بكفاءة وزيادة نقل الكتلة بين الداخلية الخلية والمذيبات المحيطة بها. كتقنية ميكانيكية بحتة، وتستخدم على نطاق واسع قوات القص ولدت بالموجات فوق الصوتية والإجراء الموصى به لتعطيل الخلايا البكتيرية، وكذلك لعزل البروتين. كطريقة بسيطة وسريعة لتعطيل الخلية ، سونيكيشن مثالية لعزل أحجام صغيرة ومتوسطة وكبيرة الحجم. Hielscher الرقمية ultrasonicators مجهزة قائمة واضحة من الإعدادات للتحكم سونيكيشن دقيقة. يتم تخزين جميع بيانات sonication تلقائيا على بطاقة SD مدمجة ويمكن الوصول إليها ببساطة. خيارات متطورة من تبديد الحرارة مثل التبريد الخارجي، سونيكيشن في وضع النبض الخ خلال عملية التفكك بالموجات فوق الصوتية ضمان الحفاظ على درجة حرارة العملية المثالية، وبالتالي سلامة المركبات الحساسة للحرارة المستخرجة.
البحوث تؤكد على نقاط القوة في انقطاع الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراج
يستأنف البروفيسور شيمات وآخرون (2017) دراستهم أن "الاستخراج بمساعدة الموجات فوق الصوتية هو بديل أخضر وقابل للتطبيق اقتصاديا للتقنيات التقليدية للأغذية والمنتجات الطبيعية. الفوائد الرئيسية هي انخفاض وقت الاستخراج والمعالجة ، وكمية الطاقة والمذيبات المستخدمة ، وعمليات الوحدة ، و CO2 الانبعاثات".
استخدم غابيج-سيمينسكا وآخرون (2014) متجانسا عالي الضغط وdsintegrator بالموجات فوق الصوتية في دراستهما لتحلل الجراثيم من أجل إطلاق الحمض النووي. وبمقارنة طريقتي تعطيل الخلية، يخلص فريق البحث إلى أنه فيما يتعلق بتحلل الخلية للحمض النووي البوغ، "تم إجراء التحليل باستخدام تحللات الخلايا من تجانس الضغط العالي. بعد ذلك ، أدركنا أن انقطاع الخلية بالموجات فوق الصوتية له مزايا متميزة لهذا الغرض. بل هو سريع ويمكن معالجتها لأحجام عينة صغيرة." (غابيج- سيمينسكا وآخرون، 2014)
الصناعية الموجات فوق الصوتية الخلية المتفكك UIP4000hdT (4000W, 20 كيلو هرتز) لعزل مضمن مستمر وتنقية المركبات المركبة من مصانع الخلايا الميكروبية.
الجزيئات الحيوية من مصانع الخلايا لإنتاج الأغذية
مصانع الخلايا الميكروبية هي منهجية إنتاج قابلة للتطبيق وفعالة باستخدام الكائنات الميكروبية لإنتاج غلة عالية من الأيض الأصلي وغير الأصلي عن طريق الهندسة الحيوية الأيضية للكائنات الحية الدقيقة الميكروبية مثل البكتيريا والخمائر والفطريات وما إلى ذلك. يتم إنتاج الإنزيمات السائبة على سبيل المثال باستخدام الكائنات الحية الدقيقة أوتش مثل أسبيرغيلوس أوريزاي والفطريات والبكتيريا. وتستخدم هذه الإنزيمات السائبة لإنتاج الأغذية والمشروبات، وكذلك في الزراعة والطاقة الحيوية والرعاية المنزلية.
تنتج بعض البكتيريا مثل أسيتوباكتر إكسيلينوم وجلوكوناسيتوباكتر زيلينوس السليلوز أثناء عملية التخمير، حيث يتم تصنيع ألياف النانو في عملية من أسفل إلى أعلى. السليلوز البكتيري (المعروف أيضا باسم السليلوز الميكروبي) يعادل كيميائيا السليلوز النباتي ، ولكنه يحتوي على درجة عالية من البلورة والنقاء العالي (خال من اللجنين والهيميسليلوز والبكتين والمكونات الحيوية الأخرى) بالإضافة إلى بنية فريدة من السليلوز النانوية المنسوجة ثلاثية الأبعاد (3D) الشبكة الشبكية. (راجع تشونغ، 2020) بالمقارنة مع السليلوز المشتقة من النبات ، السليلوز البكتيري هو أكثر استدامة والسليلوز المنتجة نقية لا تتطلب خطوات تنقية معقدة. Ultrasonication واستخراج المذيبات باستخدام NaOH أو SDS (كبريتات دودسيل الصوديوم) فعالة جدا لعزل السليلوز البكتيري من الخلايا البكتيرية.
الجزيئات الحيوية من مصانع الخلايا لإنتاج الأدوية واللقاحات
واحدة من أبرز المنتجات الصيدلانية المستمدة من مصانع الخلايا هو الأنسولين البشري. لإنتاج الأنسولين المهندسة بيولوجيا، وتستخدم في الغالب كولاي وSaccharomyces cerevisiae. وبما أن الجزيئات النانوية الحجم المركبة بيولوجيا توفر توافقا حيويا عاليا، فإن الجسيمات النانوية البيولوجية مثل الفيريتين مفيدة للعديد من تطبيقات تصنيع الكتلة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الإنتاج في الميكروبات المهندسة التمثيل الغذائي غالبا ما يكون أكثر فعالية بكثير في الغلة التي تم الحصول عليها. فعلى سبيل المثال، زاد إنتاج حمض الأرتيميسينيك والريسفيراترول والليكوبين عشرة أضعاف إلى عدة مئات من الأوجه، وهو بالفعل قيد التطوير لإنتاج على نطاق صناعي. (راجع ليو وآخرون؛ (ميكروب) حقيقة الخلية. 2017)
فعلى سبيل المثال، الجزيئات الحيوية ذات الحجم النانوي القائمة على البروتين وذات خصائص التجميع الذاتي مثل الفيريتين والجسيمات الشبيهة بالفيروسات مثيرة للاهتمام بشكل خاص لتطوير اللقاح لأنها تحاكي حجم وبنية مسببات الأمراض وقابلة للتحواض السطحي للمضادات لتعزيز التفاعل مع الخلايا المناعية. يتم التعبير عن هذه الجزيئات في ما يسمى مصانع الخلايا (على سبيل المثال، سلالات الإشريكية القولونية المهندسة)، والتي تنتج جزيء مستهدف معين.
بروتوكول للتحلل بالموجات فوق الصوتية وE. القولونية BL21 لإطلاق سراح فيريتين
الفيريتين هو بروتين، والذي وظيفة أساسية هو تخزين الحديد. يظهر فيريتين قدرات واعدة كجسيمات نانوية ذاتية التجميع في اللقاحات، حيث يتم استخدامها كوسيلة لتوصيل اللقاحات (مثل بروتينات ارتفاع السارس-كوف-2). البحث العلمي للشمس وآخرون. al. (2016) يظهر أنه يمكن إطلاق الفريتين المؤتلف كشكل قابل للذوبان من الإشريكية القولونية بتركيزات NaCl منخفضة (≤50 ملليمول /لتر). من أجل التعبير عن الفيريتين في E. coli BL21 والإفراج عن الحديديتين ، تم تطبيق البروتوكول التالي بنجاح. تم تحويل pET-28a/ferritin plasmid المؤتلف إلى سلالة E coli BL21 (DE3). تم استزراع خلايا فيريتين إي كولاي BL21 (DE3) في وسائل نمو LB مع 0.5٪ كاناميسين عند 37 درجة مئوية وتم تحريضها على OD600 من 0.6 مع 0.4٪ isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية. ثم تم حصاد الثقافة النهائية عن طريق الطرد المركزي في 8000g لمدة 10 دقائق في 4°C، وتم جمع بيليه. ثم، تم إعادة إنفاق بيليه في LB المتوسطة (1٪ NaCl، 1٪ Typone، 0.5٪ استخراج الخميرة)/تحلل العازلة (20 ملليمول / لتر تريس، 50 ملليمول / لتر NaCl، 1 مليمول / لتر EDTA، درجة الحموضة 7.6) وتركيزات مختلفة من محلول NaCl (0، 50، 100، 170، و 300 ملليمول / لتر)، على التوالي. بالنسبة لتحلل الخلايا البكتيرية ، تم تطبيق sonication في وضع النبض: على سبيل المثال ، باستخدام الموجات فوق الصوتية UP400St في 100٪ السعة مع دورة واجب من 5 ثوان على، 10 ثانية قبالة، لمدة 40 دورة) ومن ثم طرد مركزي في 10 000g لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. تم تحليل الناموست والراسب بواسطة الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (SDS-PAGE). تم مسح جميع المواد الهلامية الملطخة بكبريتات الصوديوم باستخدام ماسح ضوئي عالي الدقة. تم تحليل الصور هلام باستخدام برنامج ماجيك تشيمي 1D. للوضوح الأمثل، تم الكشف عن نطاقات البروتين عن طريق ضبط المعلمات. تم إنشاء البيانات الخاصة بالنطاقات من ثلاثية التقنية. (راجع: صن وآخرون، 2016)
الموجات فوق الصوتية الخلايا المعطلات للتحلل الصناعي للمصانع الخلية
التحلل بالموجات فوق الصوتية واستخراج هو وسيلة موثوقة ومريحة للافراج عن الأيض من مصانع الخلايا مما يساعد على إنتاج فعال من الجزيئات المستهدفة. يمكن تحجيم أجهزة تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية من المختبر إلى الحجم الصناعي والعمليات خطية تماما.
Hielscher Ultrasonics هو شريكك المختصة لاضطرابات الموجات فوق الصوتية عالية الأداء ولديه خبرة طويلة الأمد في مجال زرع أنظمة الموجات فوق الصوتية في مقاعد البدلاء أعلى والإعدادات الصناعية.
عندما يتعلق الأمر الأجهزة والبرمجيات المتطورة، Hielscher الفوق صوتيات أنظمة تعطل الخلية يفي بجميع المتطلبات للتحكم في العملية الأمثل، وسهولة التشغيل وسهولة الاستخدام. العملاء ومستخدم Hielscher ultrasonicators قيمة الفائدة التي Hielscher الموجات فوق الصوتية الخلايا المعطلين والمستخرجات تسمح لمراقبة عملية دقيقة والسيطرة – عبر شاشة اللمس الرقمية والتحكم عن بعد المتصفح. يتم تخزين جميع بيانات سونيكيشن الهامة (مثل صافي الطاقة، الطاقة الإجمالية، السعة، المدة، درجة الحرارة، الضغط) تلقائيا كملف CSV على بطاقة SD متكاملة. وهذا يساعد على الحصول على نتائج قابلة للاستنساخ وتكرارها ويسهل توحيد العمليات وكذلك الوفاء بالممارسات الصناعية الجيدة (cGMP).
وبطبيعة الحال، يتم بناء Hielscher المعالجات بالموجات فوق الصوتية لعملية 24/7 تحت حمولة كاملة، وبالتالي يمكن تشغيلها بشكل موثوق في إعدادات الإنتاج الصناعي. نظرا لارتفاع قوة وصيانة منخفضة، والتوقف عن المعدات بالموجات فوق الصوتية منخفضة حقا. CIP (نظيفة في المكان) وS SIP (تعقيم في مكان) ميزات تقليل التنظيف شاقة، لا سيما وأن جميع الأجزاء الرطبة هي أسطح معدنية ناعمة (لا فتحات خفية أو فوهات).
الجدول أدناه يعطيك مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لultrasonicators لدينا:
| دفعة حجم | معدل المد و الجزر | الأجهزة الموصى بها |
|---|---|---|
| 1 إلى 500ML | 10 إلى 200ML / دقيقة | UP100H |
| 10 إلى 2000ML | 20 إلى 400ML / دقيقة | Uf200 ः ر، UP400St |
| 00.1 إلى 20L | 00.2 إلى 4L / دقيقة | UIP2000hdT |
| 10 إلى 100L | 2 إلى 10L / دقيقة | UIP4000hdT |
| زمالة المدمنين المجهولين | 10 إلى 100L / دقيقة | UIP16000 |
| زمالة المدمنين المجهولين | أكبر | مجموعة من UIP16000 |
اتصل بنا! / اسألنا!
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع عالية الأداء المجانسة بالموجات فوق الصوتية لخلط التطبيقات، تشتت، استحلاب واستخراج على المختبر، والطيارية ومقياس الصناعية.
الأدب / المراجع
- Sun, W., Jiao, C., Xiao, Y., Wang, L., Yu, C., Liu, J., Yu, Y., Wang, L. (2016):Salt-Dependent Aggregation and Assembly of E Coli-Expressed Ferritin. Dose-Response, March 2016.
- Rodrigues, M.Q.; Alves, P.M.; Roldão, A. (2021): Functionalizing Ferritin Nanoparticles for Vaccine Development. Pharmaceutics 2021, 13, 1621.
- Farid Chemat, Natacha Rombaut, Anne-Gaëlle Sicaire, Alice Meullemiestre, Anne-Sylvie Fabiano-Tixier, Maryline Abert-Vian (2017): Ultrasound assisted extraction of food and natural products. Mechanisms, techniques, combinations, protocols and applications. A review. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 34, 2017. 540-560.
- Villaverde, Antonio (2010): Nanotechnology, bionanotechnology and microbial cell factories. Microbial Cell Factories 2010 9:53.
حقائق تستحق العلم
سونو-المفاعلات الحيوية
يستخدم الموجات فوق الصوتية من ناحية لتعطيل الخلايا من أجل الإفراج عن المركبات داخل الخلايا، ولكن تطبيقها مع السعة أخف و / أو كما رشقات نارية الموجات فوق الصوتية النابضة، سونيكيشن يمكن أن تعزز إلى حد كبير الإنتاجية الأيضية من الخلايا الميكروبية والنباتية والحيوانية في المفاعلات الحيوية وبالتالي تعزيز عمليات التكنولوجيا الحيوية. يمكن ببساطة دمج المسابير بالموجات فوق الصوتية في المفاعلات الحيوية (ما يسمى المفاعلات الحيوية سونو) من أجل تكثيف كفاءة المفاعلات الحيوية الحية. Hielscher ultrasonicators تسمح لظروف الموجات فوق الصوتية التي تسيطر عليها بدقة، والتي يمكن ضبطها على النحو الأمثل لتحويل الحفاز عالية من الخلايا الحية. معرفة المزيد عن Hielscher مسابير الموجات فوق الصوتية لsonobioreactors وآثار الحفز البيولوجي المحسن بالموجات فوق الصوتية!
مصانع الخلية وتركيب الأيض
يمكن للكائنات الحية الدقيقة المختلفة توليف الأيض مماثلة, على سبيل المثال, لإنتاج الأحماض الأمينية Corynebacterium, وقد استخدمت بريبكتريا, وEscherichia القولونية بنجاح; الفيتامينات هاي تم توليفها باستخدام بروبيونيباكتيريوم و Pseudomonas; الأحماض العضوية مشتقة من أسبيرغيلوس، لاكتوباكيلوس، ريزوبوس. في حين يمكن أن تصنع الانزيمات من قبل أسبيرغيلوس وعصيات; يمكن إنتاج المضادات الحيوية من قبل Streptomyces وPenicillium. بينما لإنتاج biosurfactants شكلت عادة Pseudomonas، عصيات، وLactobacillus تستخدم كمصانع الخلية.
E. القولونية ومصانع الخلايا الميكروبية
البكتيريا E. القولونية وسلالاتها العديدة تستخدم على نطاق واسع البيولوجيا الجزيئية ANS أصبحت واحدة من نماذج الخلايا كفاءة الأولى المستخدمة مصانع الخلايا الميكروبيال لإنتاج البروتينات المؤتلفة, الوقود الحيوي, ومختلف المواد الكيميائية الأخرى. يتميز الإشريكية القولونية بقدرة طبيعية على إنتاج العديد من المركبات، والتي تم تحسينها من خلال الهندسة الحيوية والتعديلات الوراثية. على سبيل المثال، من خلال نقل إنزيمات heterologous، تم تعديل قدرة الإشريكية القولونية على إنتاج العديد من المنتجات من أجل تطوير مسارات جديدة التركيب الحيوي.
(Antonio Valle, Jorge Bolívar: Chapter 8 – Escherichia coli, the workhorse cell factory for the production of chemicals. In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 115-137.)
العقديات ومصانع الخلايا الميكروبية
العقديات هي أكبر مجموعة من الشعيات. تنتشر أنواع العقديات على نطاق واسع في النظم الإيكولوجية المائية والأرضية. أعضاء جنس Streptomyces لهم أهمية تجارية بسبب قدرتهم على إنتاج عدد هائل من الجزيئات الحيوية والأيضات الثانوية النشطة بيولوجيا. وتنتج مضادات حيوية مفيدة سريريا مثل التتراسيكلين والأمينوغليكوزيدات والماكروليدات والكلورامفينيكول والريفاميسين. بالإضافة إلى المضادات الحيوية ، تنتج Streptomyces أيضا منتجات صيدلانية أخرى ذات قيمة عالية بما في ذلك مضادات السرطان ، والمحفزات المناعية ، والعوامل المثبطة للمناعة ، والمضادة للأكسدة ، والمبيدات الحشرية ، والأدوية المضادة للطفيليات ، والتي لها تطبيقات طبية وزراعية واسعة.
تنتج أنواع العقديات مجموعة من الإنزيمات المهمة طبيا، بما في ذلك L-asparaginase، وuricase، وأوكسيديز الكوليسترول. يمكن أن تنتج العديد من actinomycetes الإنزيمات الهامة صناعيا مثل السيلولاز، chitinases، chitosanases، α-الأميليز، البروتياز، وليباز. يمكن أن تنتج العديد من actinomycetes أصباغ مختلفة التي يحتمل أن تكون بديلا جيدا من الألوان الاصطناعية. الأنواع العقدية لديها قدرة كبيرة على إنتاج الجزيئات الحيوية السطحية النشطة بما في ذلك المولزيفيات الحيوية والمواد الحيوية السطحية. تم إنتاج أكاربوس مضاد للديابيديا من سلالات من العقديات عن طريق التخمير الميكروبي. وقد أظهرت أنواع من Streptomyces القدرة على توليف مثبطات تخليق الكوليسترول، مثل برافاستاتين. في الآونة الأخيرة ، يمكن استخدام أنواع Streptomyces ك "مصانع نانوية" صديقة للبيئة لتركيب الجسيمات النانوية. بعض أنواع العقديات واعدة لإنتاج فيتامين B12.
(Noura El-Ahmady El-Naggar: Chapter 11 – Streptomyces-based cell factories for production of biomolecules and bioactive metabolites, In: Editor(s): Vijai Singh, Microbial Cell Factories Engineering for Production of Biomolecules, Academic Press, 2021. 183-234.)
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع عالية الأداء المجانسة بالموجات فوق الصوتية من مختبر إلى حجم الصناعية.