Hielscher تكنولوجيا الموجات فوق الصوتية

بالموجات فوق الصوتية استخراج البروتين من الأنسجة والخلايا الثقافات

  • استخراج البروتين هو خطوة تحضير العينة الأساسية في البروتينات.
  • البروتينات يمكن استخلاصها من الأنسجة النباتية والحيوانية، الخميرة والكائنات الدقيقة.
  • صوتنة هو موثوقة وفعالة طريقة استخراج البروتين يعطي عوائد عالية من البروتين في غضون فترة زمنية قصيرة استخراج.

 

استخراج البروتين من الأنسجة والخلايا

استخراج البروتين من الأنسجة والخلايا المستزرعة خطوة إعداد العينات الأساسية التي يتم تنفيذها خلال العديد من التقنيات الحيوية والتحليلية مثل ELISA، PAGE، النشاف الغربي، مطياف الكتلة، أو تنقية البروتين. فوق صوتي تمزق خلية، تحلل والاستخراج هي تقنية التحكم بدقة لضمان عوائد عالية من البروتينات.

استخراج البروتين من الأنسجة الحيوانية

لإعداد الأنسجة كاملة الحجم (مثل الكلى والقلب والرئة والعضلات ، إلخ) ، يجب تشريح الأنسجة إلى قطع صغيرة جدًا بأدوات نظيفة ، على الجليد بشكل مفضل ، وبأسرع وقت ممكن لمنع تدهور البروتياز (على سبيل المثال تحلل العازلة مثل RIPA أو تحلل المخزن المؤقت تحلل التي تحتوي على البروتيني ومثبط انزيم الفوسفاتيز. بعد تشريح ، يتم غمر العينة في النيتروجين السائل لتجميد المفاجئة. يمكن تخزين العينة في درجة حرارة -80 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق أو أن يكون على الجليد على التجانس الفوري. مباشرة قبل الاستخراج بالموجات فوق الصوتية ، يتم تحفيز عازلة الجليد الباردة (مع مثبطات الأنزيم البروتيني DTT ، leupeptin و aprotinin) بسرعة في أنبوب عينة (~ 10 ملغ من الأنسجة تقريبا. يوصى ~ 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت). تقريبا. ينصح 20-60mg من الأنسجة في أنبوب عينة.
يتم تنفيذ التجانس بالموجات فوق الصوتية، تحلل والاستخراج مع الخالط بالموجات فوق الصوتية مثل Uf200 ः ر أو UP200St، مجهزة sonotrode طرف الصغيرة. مدة صوتنة هي 60-90 ثانية. في واسطة دورة بالموجات فوق الصوتية من 15 ثانية. صوتنة و 10 ثانية. وقت الراحة. يجب أن تبقى العينة في الجليد طوال الوقت.
بعد بالموجات فوق الصوتية التجانس / الاستخراج، ويتم طرد المحللة في 27،000g تقريبا. 20 دقيقة. بعد ذلك يتم جمع supernatent، بحيث تركيز البروتين يمكن تحديده من خلال فحص البروتين مثل بيرس البروتين مقايسة BCA.

سونيكيشن البروتين هو وسيلة هامة لإعداد العينة

استخراج البروتين بالموجات فوق الصوتية من الخلايا مع UP200St

طلب معلومات





استخراج البروتين من مصل الدم

للحصول على خليط متجانس من المصل والمخزن الفوسفاتي ، يتم دودة العينة أولا قبل تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية. لتحلل بالموجات فوق الصوتية ، sonicated العينة مع الخالط مختبر الموجات فوق الصوتية مثل UP100H لمدة 8 دورات في 20٪ السعة، فيما يتعلق بدورات كل 5 ثوان على و 15 ثانية من المباراة. ويتم Sonocation بها sonicationg في دورات ووضع العينة على الجليد بحيث يتم تجنب وقوع الانهاك وتدهور الحراري للعينة. منذ مصل يحتوي على كمية كبيرة من ارتفاع البروتينات الجزيئية الوزن (مثل الزلال، α1-انتيتريبسين، ترانسفيرين، haptoglobulin، الغلوبولين المناعي G والغلوبولين المناعي A)، التي تتداخل مع فصل منخفضة البروتينات الوزن الجزيئي خلال منتدى الطاقة الدولي، فمن المستحسن أن تستنفد منها من المصل باستخدام عمود استنزاف.

استخراج البروتين من الأنسجة النباتية

طازجة، لينة الأنسجة النباتية، على سبيل المثال الطحلب وما إلى ذلك، يمكن أن تتعطل بسهولة ببساطة عن طريق وضع مادة العينة المفروم في تحلل العازلة لصوتنة. صعبة، والأنسجة النباتية ligenous، مثل البذور، والتنوب الإبر وما إلى ذلك، يجب أن تكون الأرض جافة. يجب تجميد بعض، المواد النباتية الخشبية الصلبة والأرض في النيتروجين السائل المستخرج قبل صوتنة. للتعليق زراعة الخلايا النباتية، والعلاج بالموجات فوق الصوتية ما بين 30 و 150 ثانية في تحلل العازلة هي في معظمها كافية. المواد أكثر صرامة مثل بذور اليقطين تتطلب صوتنة أكثر كثافة كما هو موضح أدناه.

بروتوكول لاستخراج بالموجات فوق الصوتية من الزلال من بذور اليقطين

بالموجات فوق الصوتية الخالط الأنسجة UP400St مع S24d40 - لاستخراج البروتين من النباتات والأنسجة الحيوانية (انقر للتكبير!)لاستخراج البروتين بالموجات فوق الصوتية من الزلال من مسحوق بذور اليقطين الأرض غرامة، تضاف 10 غرام من مسحوق بذور القرع منزوع الدهن و 100 مل من الماء منزوع الأيونات كمذيب في كوب زجاج 250ML. يتكون استخراج البروتين في خطوتين: أولا، sonicated العينة مع التحقيق الذي تجريه من نوع ultrasonicator UP400St (400W، 24kHz و) مع sonotrode شنت S24d7. يوضع الدورق الزجاجي في حمام الماء البارد خلال التجانس بالموجات فوق الصوتية. والإعداد للultrasonicator UP400St مع استشعار درجة الحرارة للتوصيل ضمان أن درجة حرارة العينة دائما تحت 30 درجة مئوية. من خلال التحكم الدقيق في درجة الحرارة أثناء الصوتنة ، يتم تجنب تمويه الألبومين. ثانيا ، تم إجراء الاستخراج مع خلاط بسرعة 200 دورة في الدقيقة وعند 30 درجة مئوية. بعد ذلك يتم نقل الكأس إلى شاكر الحراري. يتم إزالة الجلوبيولين عن طريق غسيل الكلى بالماء المقطر. بعد إزالة الجلوبيولين ، يمكن أخذ عينات من خلاصة البروتين لتحديد شكل الألبومين ويتم تعديله لاحقًا إلى pI = 3.0 باستخدام HCl 0.1 مولار لتخثر الألبومين. يتم فصل الطور الصلب بالطرد المركزي عند 5000 جم ، 20 درجة مئوية والماء الأحمر منزوع الأيونات. يتم إجراء تخثر الألبومين مرتين لزيادة نسبة البروتين في تركيز الألبومين.

بالموجات فوق الصوتية استخراج البروتين القلوية لإعداد تركيز البروتين من نخالة الأرز ويظهر أن نتائج العلاج بالموجات فوق الصوتية في عائد أعلى من البروتين في وقت أقصر بكثير استخراج – مقارنة أساليب الاستخراج التقليدية.

بالموجات فوق الصوتية VialTweeter جهاز لاستخراج البروتين من عينات الأنسجة (انقر للتكبير!)

VialTweeter لصوتنة غير مباشر.

مزايا

  • سريعون
  • عائدات مرتفعه
  • كفاءة عالية
  • مراقبة دقيقة على المعلمات
  • نتائج يمكن استنساخه
  • قابلية الخطية

بروتوكول إعداد نموذج لانزيم iNOS وظيفية

للحصول على انزيم iNOS وظيفية بالكامل (على سبيل المثال لفحص المخدرات)، وأوصى بروتوكول التالية: يجب وضع تعليق خلية على الجليد ويصوتن مع UP100H في السعة 10μm في وضع حلقة 5 ثانية. صوتنة و 25 ثانية. راحة على الجليد. وينبغي تكرار الإجراء تقريبا. ثلاث مرات. الوقت يستريح في بين دورات صوتنة يقلل من ارتفاع درجة الحرارة وبالتالي سوف يقلل من خطر تمسخ.

بالموجات فوق الصوتية البروتين الإذابة

صوتنة قد يسرع عملية ذوبان البروتين، الأمر الذي يتطلب عادة عدة ساعات. لكي لا ارتفاع درجة حرارة العينة ومنع تدهور البروتين والتعديلات في المحاليل المحتوية على اليوريا، ينبغي أن رشقات نارية فوق الصوتية لا تستمر لفترة أطول من بضع ثوان.

إرشادات عامة

التحكم في درجة الحرارة: لضمان العائد نسبة عالية من البروتين دون تمسخ الحرارية، ودرجة الحرارة أثناء استخراج يجب السيطرة عليها. HIELSCHER للدولة من بين الفن المجانسة بالموجات فوق الصوتية – وتسمى أيضا منحل بالموجات فوق الصوتية أو sonificator – يمكن التحكم بدقة. أنها تأتي مع جهاز استشعار درجة الحرارة plugable. في خيارات وضع الخالط بالموجات فوق الصوتية، كحد أقصى يمكن ضبط درجة الحرارة. عندما يتم التوصل إلى هذا الحد درجة الحرارة، وتوقف ultrasonicator تلقائيا حتى تبرد العينة إلى أسفل.
متعادل: كويس منطقة عازلة مناسبة وحجم الصحيح من المخزن يختلف من الأنسجة إلى الأنسجة ويجب أن يكون، برزت من خلال اختبار التجربة والخطأ.
العزلة / تنقية: لست] البروتين يمكن أن تحتوي على وجود فائض من الجزيئات الحيوية مثل DNA أو الكربوهيدرات، والتي يمكن إزالتها عن طريق البروتين هطول الأمطار (حمض الخليك ثلاثي الكلور deoxycholate) أو المخزن المؤقت الصرف.

ذكرت Chittapalo وNoomhorm (2009) أن العائد من البروتين زادت باستخدام صوتنة وأن التجانس الأنسجة وتحلل عملية بالموجات فوق الصوتية يمكن أن تعزز عمليات الاستخراج الحالية بشكل كبير – مؤاتية لفرص استخراج تجارية جديدة.

حماية سليمة مع الضميمة الصوت HIELSCHER في SPB-L وجهاز الموجات فوق الصوتية UP200St. (اضغط للتكبير!)

بالموجات فوق الصوتية الخالط الأنسجة UP200St لاستخراج البروتين الفعال

مراقبة دقيقة من العلاج بالموجات فوق الصوتية (انقر للتكبير!)

تحكم مستعرض لعملية دقيقة ورصد عملية صوتنة

معدات الموجات فوق الصوتية لاستخراج البروتين

HIELSCHER الفوق نقدم مجموعة واسعة من المجانسة بالموجات فوق الصوتية للتفكك الخلايا والأنسجة، والبكتيريا والكائنات الدقيقة، والخميرة، والجراثيم.
ultrasonicators مختبر HIELSCHER هي قوية وسهلة التشغيل. بنيت ل24/7 العملية، وهي مصممة كأجهزة المختبر والمقعد العلوي قوية وفعالة. لجميع الأجهزة، وانتاج الطاقة والسعة يمكن التحكم بدقة. مجموعة واسعة من مستلزمات يفتح المزيد من خيارات الإعداد. الأجهزة الرقمية مثل VialTweeter، Uf200 ः ر، UP200Stو UP400St لها التحكم في درجة الحرارة متكاملة ومدمجة في بطاقة SD للتسجيل التلقائي للبيانات.
للغير مباشر، عبر خالية من التلوث وصوتنة وقت واحد من عينات متعددة، ونحن نقدم VialTweeter أو ال cuphorn بالموجات فوق الصوتية.
اعتمادا على التطبيق، المادة، وحجم العينة الخاصة بك، فإننا ننصح الإعداد الأنسب لعينة الإعدادية الخاص. اتصل بنا اليوم!

اتصل بنا! / اسألنا!

يرجى استخدام النموذج أدناه، إذا كنت ترغب في طلب معلومات إضافية حول التجانس بالموجات فوق الصوتية. سنكون سعداء لنقدم لكم نظام الموجات فوق الصوتية تلبية الاحتياجات الخاصة بك.









يرجى ملاحظة لدينا سياسة الخصوصية.


مراجع الادب

  • Chittapalo T، Noomhorm ألف (2009): بالموجات فوق الصوتية بمساعدة استخراج القلوي من البروتين من نخالة الأرز منزوع الدهن وخصائص مركزات البروتين. الباحث J علوم الأغذية TECHNOL 44: 1843-1849.
  • سيموس، أندريه E.S:. بيريرا، ديان M؛ أمارال، جوان؛ نونيز، آنا M؛ جوميز، صوفيا E؛ روبرتس، بيتر M؛ لو ادريان C؛ D'Hooge، رودي. ستير، كليفورد J؛ ثيبوديو، ستيفن C؛ Borralho، بيتر M؛ رودريغز، سيسيليا M. P. (2013): الانتعاش كفاءة من البروتينات من مصدر عينات متعددة بعد Trizol أو Trizol LS استخراج الحمض النووي الريبي والتخزين على المدى الطويل. BMC علم الجينوم، 2013، 14: 181.


حقائق تستحق العلم

البروتينات

البروتينات هي مجال الأبحاث أن يحقق البروتينات وبروتيوم. البروتينات تليفونية مجموعة واسعة من الوظائف الحيوية في الكائنات الحية. بروتيوم هو مجموعة كاملة من البروتينات التي أعرب عنها الجينوم، الخلية، الأنسجة، أو كائن في وقت معين. بروتيوم يختلف مع متطلبات الوقت ومتميزة، أو الضغوط، أن خلية أو كائن حي يخضع. وبشكل أكثر تحديدا، هو مجموعة من البروتينات التي أعرب عنها في نوع معين من الخلايا أو الكائن الحي، في وقت معين، في ظل ظروف محددة. على المدى هو مزيج من البروتينات والجينوم. البروتينات هي دراسة بروتيوم.

بروتين

البروتينات هي هي الجزيئات الحيوية الكبيرة، ما يسمى الجزيئات – التي تتكون من واحدة أو أكثر من سلاسل طويلة من بقايا الأحماض الأمينية. توجد البروتينات في جميع الكائنات الحية من الأصل النباتي والحيواني على حدٍّ سواء ، وهي حاسمة بالنسبة لمعظم الوظائف البيولوجية. بما أن البروتينات تحتوي على الكثير من المعلومات البيولوجية ، يتم استخراجها لغرض تحليلي ، على سبيل المثال للبحوث البروتينية. وتشمل أهم وظيفة تقوم بها البروتينات تحفيز التفاعلات الأيضية ، وتكرار الحمض النووي ، والاستجابة للمنبهات ، ونقل الجزيئات من موقع إلى آخر. تختلف البروتينات عن بعضها البعض في المقام الأول في تسلسلها من الأحماض الأمينية ، التي تمليها تسلسل النوكليوتيدات من جيناتها ، والتي عادة ما ينتج عنها طي البروتين في بنية محددة ثلاثية الأبعاد تحدد نشاطها. البروتينات – إلى جانب الببتيدات – واحدة من المكونات الرئيسية للغذاء. ولذلك، البروتينات هو أداة قوية في علوم الأغذية لتحسين العمليات وسلامة الأغذية والتقييم الغذائي.

هلام الكهربائي

هلام الكهربائي هو الأسلوب الرئيسي للانفصال وتحليل الجزيئات مثل DNA، RNA والبروتينات وكذلك أجزائها، على أساس حجمها والاتهام. فهو يستخدم في الكيمياء السريرية لفصل البروتينات عن طريق تهمة و / أو حجم (IEF الاغاروز، أساسا حجم مستقل) وفي الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية وعلم البروتينات لفصل السكان المختلطين من DNA و RNA شظايا من طول، لتقدير حجم DNA وشظايا RNA أو لفصل البروتينات عن طريق الاتهام.

مزارع الخلايا

زراعة الخلايا هي عملية المتزايدة التي تسيطر عليها والتي تزرع الخلايا تحت ظروف خاضعة للرقابة. تختلف ظروف زراعة الخلايا لكل نوع من الخلايا. بشكل عام، والبيئة ثقافة خلية تتكون من سفينة مناسبة (مثل طبق بيتري) مع الركيزة أو المتوسطة التي تزود العناصر الغذائية الأساسية (الأحماض الأمينية والكربوهيدرات والفيتامينات والمعادن)، عوامل النمو والهرمونات والغازات (CO2إن2)، وينظم البيئة الفيزيائية والكيميائية (درجة الحموضة عازلة، الضغط الاسموزي، ودرجة الحرارة). معظم الخلايا تحتاج إلى السطح أو الركيزة الاصطناعية، في حين الثقافات خلية أخرى يمكن زراعة الحرة العائمة في مستنبت (ثقافة تعليق، تعليق الخلية).
تستخدم الثقافات الجماعية من خطوط الخلايا الحيوانية في الإنتاج الصناعي من اللقاحات الفيروسية وغيرها من المنتجات المشتقة بالتكنولوجيا الأحيائية. الخلايا الجذعية البشرية يتم تربيتها لزيادة عدد الخلايا والتفريق بين الخلايا في مختلف أنواع الخلايا الجسدية لأغراض الزرع.

عينات الأنسجة

الأنسجة مصطلح يصف سيطة الخلوية، حيث المواد الخلية على المستوى التنظيمي بين الخلايا والجهاز كامل. في أنسجة وخلايا مماثلة، من نفس الأصل التي تحمل معا خارج وظيفة محددة، يتم تجميعها. من جانب التجمع الوظيفي للأنسجة متعددة، يتم تشكيل هياكل معقدة من الأجهزة.
وأخذ عينات من الأنسجة للبحث في علم الأحياء، علم الأنسجة / التشريح، علم الطفيليات، والكيمياء الحيوية، المناعية وكذلك لزراعة واستخراج الحمض النووي. ويمكن تمييزها بين الحيوانات (التقسيم: أنسجة الثدييات) والأنسجة النباتية. يتم تجميع الأنسجة الحيوانية إلى أربعة أنواع أساسية من الضام والعضلات والجهاز العصبي، والأنسجة الطلائية. تنقسم الأنسجة النباتية في ثلاثة أنظمة التالية الأنسجة: البشرة، والأنسجة الأرض، والأنسجة الوعائية.
عينات الأنسجة يمكن أن تكون مستعدة من حيوان أو نبات أجزاء، على سبيل المثال العظام والعضلات، وأوراق، الخ

سوائل الجسم

الدم والمصل والبلازما، السائل النخاعي واللعاب والسائل الزليلي وسوائل الجسم، والتي توفر مصدرا كبيرا من المعلومات ذات الصلة في التشخيص. ولذلك، فإن إعداد متطورة من عينات السوائل في الجسم لتحليل مهم. ويرتبط الصعوبة الأولى مع مجموعة ديناميكية واسعة من المكونات الموجودة في سوائل الجسم.

تحديد تركيز البروتين

برادفورد الفحص، لوري فحص وحمض bicinchoninic (BCA) فحص وفحوصات مشتركة لتحديد تركيز البروتينات. ألبومين المصل البقري (BSA) هو واحد من مستوى البروتين الأكثر استخداما.

تحلل العازلة

يجب أن اخترت تحلل العازلة وفقا لهذه المادة الخلايا او الانسجة (زراعة الأنسجة، والنباتات والبكتيريا والفطريات، الخ)، وعما إذا كانت الخلايا في بنية ونوع الهيكل. وهناك مجموعة واسعة من تحلل مخازن لاستخراج البروتينات، والأغشية، وتصاغ العضيات مع واحد أو أكثر من المنظفات. يتم اختيار المنظفات عادة عن طريق اختبارات التجربة والخطأ أو – إذا كان متوفرا – وفقا لبروتوكول استخراج البروتين الموجودة. يجب أن يكون المنظفات متوافق مع مصدر الأنسجة والبروتينات. بشكل عام، أخف المنظفات التي تعمل في النسيج / بروتين معين، يتم اختيار من أجل الحفاظ على وظائف القصوى للاستخراج. وعلاوة على ذلك، في حالة استخراج الأغشية وعضيات، المنظفات معتدل يحافظ على غشاء سليمة. المنظفات التي تستخدم عادة في مخازن تحلل هي في معظمها غير أيوني أو zwitterionic، على سبيل المثال CHAPS، deoxycholate، تريتون ™ X-100، NP40، وتوين 20.
على سبيل المثال، الأنسجة مثل المخ والكبد والأمعاء والكلى والطحال وما يمكن أن مخزنة ببساطة مع RIPA – ولكن ينبغي أن تدرج مثبطات الأنزيم البروتيني وDTT (على سبيل المثال، لالكهربائي للهلام).
تحلل العازلة للالهيكل العظمي الأنسجة العضلية (الجليد الباردة): 20 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.8)، 137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 1 ملم MgCl2، 1٪ تريتون X-100، و 10٪ (ث / ت) الجلسرين، 1 ملم EDTA ، dithiothreitol 1 ملم تستكمل مع البروتيني ومثبط الفوسفاتيز كوكتيل
جدول مخازن المشتركة ومدى درجة الحموضة بها. بشكل عام، يتم استخدام هذه المخازن عادة في تركيزات 20-50 ملم.

متعادل نطاق درجة الحموضة
حمض الستريك – هيدروكسيد الصوديوم 2-2 – 6.5
سترات الصوديوم – حمض الستريك 3.0 – 6.2
أسيتات الصوديوم – حمض الاسيتيك 3.6 – 5.6
حمض الكاكوديليك ملح الصوديوم – حمض الهيدروكلوريك 5.0 – 7.4
MY – هيدروكسيد الصوديوم 5.6 – 6.8
الصوديوم هيدروجين فوسفات – فوسفات الصوديوم الهيدروجينية 5.8 – ثمانية
ايميدازول – حمض الهيدروكلوريك 6.2 – 7.8
مُموَزات – كوه 6.6 – 7.8
ترايثولامين هيدروكلوريد – هيدروكسيد الصوديوم 6.8 – 8.8
تريس – حمض الهيدروكلوريك 7.0 – تسعة
HEPES – هيدروكسيد الصوديوم 7.2 – 8.2
تريسين – هيدروكسيد الصوديوم 7.6 – 8.6
بورات ثنائي الصوديوم – حمض البوريك 7.6 – 9.2
بيسين – هيدروكسيد الصوديوم 7.7 – 8.9
الجلايسين – هيدروكسيد الصوديوم 8.6 – 10.6

وتشير معظم مخازن درجة الحموضة الاعتماد مع درجة الحرارة. هذا ينطبق بشكل خاص للمخازن تريس هذا. يغير الباكاف الحمضية من 8.06 في درجة حرارة 25 درجة مئوية إلى 8.85 في 0 درجة مئوية.
(الرقم الهيدروجيني والباكاف الحمضية المخزن المؤقت: درجة الحموضة يقيس تركيز أيونات الهيدروجين في محلول مائي الباكاف الحمضية (= التفكك الحمضي ثابت) هو مقياس ذات الصلة، ولكن أكثر تحديدا، لأنه يساعد على التنبؤ كيف يمكن لجزيء ستعمل على التفاصيل. قيمه الحامضيه.)

TRIzol

TRIzol هو الحل الكيميائية تستخدم لاستخراج RNA / DNA / البروتين خلال استخراج guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم. استخدام بمساعدة بالموجات فوق الصوتية النتائج استخراج TRIzol في DNA عالية، RNA، وعوائد البروتين من نفس العينة وتتفوق أساليب الاستخراج وبالتالي الأخرى.