إعداد بالموجات فوق الصوتية لعينات C. elegans
C. elegans ، دودة الديدان الخيطية ، هي كائن نموذجي يستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء. يتطلب تحضير العينة قبل التحليل التحلل واستخراج البروتين والدهون بالإضافة إلى تجزئة الحمض النووي الريبي ، والتي يمكن إجراؤها بشكل موثوق عن طريق الصوتنة. أجهزة تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية هي أجهزة موثوقة ومتطورة وسهلة الاستخدام للتحضير السريع لعينات C. elegans.
إعداد بالموجات فوق الصوتية لعينات C. elegans
C. elegans هي ديدان مستديرة ، والتي تستخدم على نطاق واسع في مختبرات الأبحاث للتحقيق في علم الجينوم ، وعلم الأحياء التنموي ، والأمراض. العديد من الجينات في جينوم C. elegans لها نظائر وظيفية في البشر. وبالتالي ، فإن دودة الديدان الخيطية هي نموذج مفيد للغاية للأمراض البشرية. المزايا الأخرى للاستخدام الواسع ل C. elegans هي زراعتها السهلة والرخيصة على ألواح تحتوي على بكتيريا (مثل الإشريكية القولونية) ، وشفافيتها ، والتعامل المريح معها ، فضلا عن إمكانية تجميد الديدان وتخزينها لفترة أطول.
تحليل البروتين والدهون هي إجراءات منتظمة في المختبرات وإعداد العينات بالموجات فوق الصوتية هو الطريقة المعمول بها لتحلل الديدان الخيطية C. elegans في كل مرحلة من مراحل النمو (أي الأجنة واليرقات L1-L4 والبالغين). نظرا لأن C. elegans يستخدم أيضا كنظام تعبير عن البروتين للتعبير المفرط عن البروتينات المستهدفة ، يلزم وجود طريقة تحلل واستخراج بروتين موثوقة وقابلة للتكرار ، والتي تعطي غلات عالية من البروتين. تتوفر أنظمة تعطيل واستخراج الخلايا بالموجات فوق الصوتية كمجانسات من نوع المسبار وكأجهزة بالموجات فوق الصوتية متعددة العينات. تلبية لإعداد عينة مريحة وجميع أنواع أرقام أحجام العينات، Hielscher الفوق صوتيات لديه تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية المثالية لإجراء المختبر الخاص بك.
- تحضير مجانسات الدودة
- استخراج البروتين
- استخراج الدهون
- قياس كمية البروتين
- الترسيب المناعي
- النشاف الغربي
- استخراج الحمض النووي الريبي
- المقايسات الأنزيمية
بروتوكولات الموجات فوق الصوتية لاضطراب C. elegans والتحلل
يمكن إجراء التجانس بالموجات فوق الصوتية وتحلل C. elegans واستخراج البروتين والدهون اللاحق باستخدام إجراءات مختلفة باستخدام مخازن التجانس والتحلل المختلفة وما إلى ذلك. تشترك جميع بروتوكولات التحلل في أنه يجب الاحتفاظ بالعينات باستمرار على الجليد لمنع تدهور البروتين. أدناه ، نقدم لك بعض بروتوكولات التحلل والاستخراج بالموجات فوق الصوتية الموثوقة والسريعة لإعداد عينات C. elegans عالية الجودة التي تحتوي على البروتين أو الدهون.
مزايا بالموجات فوق الصوتية C. ايليجانس تحلل
- مصدق
- استنساخه
- يتم التحكم في درجة الحرارة بدقة
- تحكم موثوق في العملية
- طريقة لطيفة
- سهل التطبيق
- آمن
استخراج البروتين بالموجات فوق الصوتية من عينات C. elegans
يمكن إجراء التحلل بالموجات فوق الصوتية واستخراج البروتين من ديدان C. elegans باستخدام بروتوكولات مختلفة. نقدم لك أدناه بعض بروتوكولات التحلل الموثوقة والسريعة لنتائج استخراج البروتين القابلة للتكرار.
التحضير السريع للمستخلص الخلوي من ديدان C. elegans عن طريق الصوتنة
باستخدام البروتوكول التالي ، يمكنك تحضير C. elegans lysates في أقل من 30 دقيقة.
مجموعة من C. ايليجانس
اختر ديدان C. elegans المرغوبة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات سعة 1.5 مل (PBS) أو اغسلها من طبق يحتوي على 1.5 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في لمدة 1 دقيقة عند 2000 دورة في الدقيقة إلى بيليه. احتفظ بالعينات في جميع الأوقات على الجليد.
ثم اغسل الديدان مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.
بعد ذلك ، اغسل الديدان مرتين باستخدام ddH2O.
أعد تعليق الديدان في 500ul على الأقل من المخزن المؤقت للتجانس (HB). عينات الدودة جاهزة الآن للتحلل بالموجات فوق الصوتية.
للحصول على جودة أعلى لمستخلص البروتين ، قد ترغب في تقليل التلوث البكتيري عن طريق غسل الديدان لمدة 5 دقائق لكل منها في برنامج تلفزيوني وماء معقم فائق النقاء (ddH2O) أو إجراء تعويم السكروز. احتفظ بعينات الدودة باستمرار على الجليد.
بالموجات فوق الصوتية C. ايليجانس تحلل بروتوكول
- تأكد من إعداد الموجات فوق الصوتية مقدما بحيث يكون الخالط بالموجات فوق الصوتية جاهزا للاستخدام (مسبار مثبت ، برنامج صوتنة محدد مسبقا).
- بالنسبة لتحلل C. elegans مع UP200St أو UP200Ht ، يجب إجراء الموجات فوق الصوتية باستخدام microtip (على سبيل المثال ، مسبار 2 مم S26d2 ؛ انظر الصورة اليسرى) بسعة 40٪ لمدة 1 ثانية مع توقف مؤقت لمدة 30 ثانية بينهما. 5 دورات صوتنة لكل 1 ثانية مع توقف مؤقت 30sec مثالية لتحلل C. elegans. إذا قمت بإجراء التحلل لأول مرة ، يمكنك التحقق من تقدم التحلل في حصص صغيرة من العينة بعد كل نبضة باستخدام المجهر.
- اكتمال التحلل بنجاح عندما تتعطل الديدان. يؤدي الإفراط في الصوتنة إلى كسر النوى ويصبح مرئيا عندما تصبح العينة لزجة أو رغوة. لمنع تدهور العينة، استخدم المزيد من النبضات إذا لزم الأمر. لا تزيد وقت كل دورة نبضة بالموجات فوق الصوتية للحصول على مستخلصات بروتين عالية الجودة.
- تحلل الخلايا الصافية عن طريق الطرد المركزي للديدان المحللة بالموجات فوق الصوتية عند 14000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد واستعد للترسيب المناعي أو المقايسات الأخرى.
إذا كان جهاز الموجات فوق الصوتية الخاص بك مثبتا على حامل ، فضع حمام الثلج مع أنابيب العينة الخاصة بك تحت مسبار الموجات فوق الصوتية وأدخل مسبار الموجات فوق الصوتية في أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة للمخزن المؤقت للتجانس: قم بإعداد المخزن المؤقت للتجانس لبروتوكول التحلل بالموجات فوق الصوتية أعلاه على النحو التالي:
- 15 مللي متر Hepes درجة الحموضة 7.6 – 15 مل من 0.5 م
- 10 مللي متر كيلوكل – 2.5 مل من 2 م
- 1.5 مللي متر MgCl2 – 0.75 مل من 1 م
- 0.1 مللي متر EDTA – 100 ul من 0.5 M
- 0.5 مللي متر EGTA – 2.5 مل من 0.1 متر
- 44 مللي متر سكروز – 14.7 مل من 50٪
- أضف مباشرة قبل الاستخدام: 1mM DTT – 1000x من 1M
- بالإضافة إلى مثبط الأنزيم البروتيني
تحلل عالي الإنتاجية ل C. elegans في 96 لوحة بئر باستخدام سونيكاتور لوحة UIP400MTP
C. ايليجانس تحلل (الديدان الخيطية الكبار)
سعة UIP400MTP 80٪ ، 20 دورة (كل دورة صوتنة: 30 ثانية تشغيل ، 30 ثانية إيقاف)
المخزن المؤقت للتحلل:
- الخيار 1) 4٪ SDS ، 0.1 م Tris / HCl pH 8.0 ، 1 mM EDTA
- الخيار 2) للترسيب المناعي المشترك (co-IP): 10 مللي مول تريس هيدروكلورايد (درجة الحموضة 7.5) ، 150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 0.5 مللي مول EDTA ، 0.5٪ NP-40 (كوكتيل مثبط البروتين الكامل)
تجزئة الحمض النووي عالية الإنتاجية
C. elegans (الديدان الخيطية البالغة) الحمض النووي 200-300bp: صوتنة لوحة UIP400MTP – ضبط سعة 80٪ ، 30 نبضة – كل 30 ثانية قيد التشغيل ، 30 ثانية إيقاف
تحلل بالموجات فوق الصوتية من C. elegans لمقايسات تنقية التقارب الكمي
تم حصاد أجنة C. elegans (∼2 مليون لكل تكرار) حديثا في ثلاث نسخ بيولوجية عن طريق تبييض خنثى الجاذب الصغير وصوتنة على الجليد (الدورة: 0.5 ثانية ، السعة: 40-45٪ ، 5 ضربات / جلسة ، 5 جلسات ، الفاصل الزمني بين الجلسات: 30 ثانية ؛ معالج بالموجات فوق الصوتية UP200S مع طرف صغير S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) في المخزن المؤقت للتحلل (الحجم الإجمالي: ∼600 ميكرولتر ؛ 50 مم Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4 ، 100 مم KCl ، 1 مم MgCl2 ، 1 مم EGTA ، 1 مم DTT ، 10٪ جلسرين ، خليط مثبطات الأنزيم البروتيني ، 0.1٪ Nonidet P-40 بديل). بعد صوتنة ، تمت إضافة Nonidet P-40 Alternative حتى 1٪ وتم تحضين المحللين بدوران الرأس فوق الذيل عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ، يليه الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثم تم استنشاق المحللة التي تم تطهيرها دون الإخلال بطبقة الدهون العليا وتقسيمها إلى نصفين إما إلى حبات الأغاروز المضادة ل GFP أو حبات التحكم المسدودة (40-50 ميكرولتر). بعد دوران الرأس فوق الذيل عند 4 درجات مئوية لمدة 60-90 دقيقة ، تم غسل الخرز مرة واحدة باستخدام محلول تحلل يحتوي على 0.1٪ Nonidet P-40 بديل ، متبوعا بمرتين من الغسيل إما في المخزن المؤقت I (25 مم Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4 ، 300 مم كلوريد الصوديوم ، 1 مم MgCl2) أو المخزن المؤقت II (1 مم Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، 1 مم MgCl2) أو كليهما. بالنسبة إلى القوائم المنسدلة GFP: MBK-2 ، تم إجراء تجربتين منفصلتين باستخدام ظروف غسيل مختلفة. تم استخلاص البروتينات عن طريق الاهتزاز المداري في 50 ميكرولتر من 6 م يوريا / 2 م ثيوريا في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة لتجارب السحب MBK-1::GFP ، تم استخلاص البروتينات مرتين عن طريق اهتزاز 50 ميكرولتر من كلوريد الغوانيدينيوم 8 أمتار عند 90 درجة مئوية ، متبوعا بترسيب الإيثانول. ثم تم هضم عينات البروتين الملطخ في المحلول.
(راجع تشين وآخرون ، 2016)
تجانس الدودة بالموجات فوق الصوتية والتحلل
بالنسبة لتحلل C.elegans وإجراء استخراج البروتين ، تم جمع 30000 نيموتودا من المرحلة ذات الصلة لكل عينة وغسلها في S-basal بارد الجليد ، مركزة عن طريق الطرد المركزي عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة ، وغسلها ست مرات باستخدام S-basal البارد لإزالة البكتيريا المتبقية ، ثم تخزينها على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستخدام. لاستخراج البروتين ، سمح للديدان البالغة الجاذبية بتكوين حبيبات مدمجة بعد آخر غسل S-basal. ثم تم إعادة تعليق كريات الدودة في 1 مل من محلول الاستخراج المثلج [20 mM فوسفات البوتاسيوم ، درجة الحموضة 7.4 ، 2mM EDTA ، 1٪ Triton-X-100 ، مثبطات الأنزيم البروتيني (Sigma P2714)] ومعالجتها على الفور.
∼30000 دودة بالغة (تقابل ∼100 ملغ من الوزن الرطب) ، تم صوتنة على الجليد باستخدام الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار (على سبيل المثال UP50H مع microtip MS2) بسعة 40٪ لمدة 10 دورات من 3 ثوان ، 30 ثانية ، في 1 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الجليد البارد. (راجع بسخران وآخرون 2012)
استخراج الدهون بالموجات فوق الصوتية من C. elegans
في علم الدهون ، وهو فرع من الأيض ، يتم تمييز وتحليل مكمل الدهون للأنظمة البيولوجية. تستخدم C. elegans على نطاق واسع في علم الدهون للتحقيق في تفاعل الدهون الأيضية وآثارها على الصحة والعمر.
يستخدم التحلل والاستخراج بالموجات فوق الصوتية لإطلاق الدهون مثل الدهون السفينغولية من أجنة C. elegans واليرقات والديدان البالغة. يستخدم Ultrasonication لإعداد متجانسات دودة وبعد ذلك لاستخراج الدهون من العينة.
بروتوكول لاستخراج الدهون بالموجات فوق الصوتية من C. elegans
قم بإذابة حبيبات C. elegans على الثلج وأعد تعليقها باستخدام 0.5 مل من الماء الفائق.
قم بتقطيع عينات C. elegans في أنابيب اختبار سعة 1,5 مل ، مع الاحتفاظ بالعينات بشكل مستمر على الجليد.
يمكن إجراء Sonication باستخدام مسبار بالموجات فوق الصوتية مثل UP200Ht، وحدة إعداد العينة بالموجات فوق الصوتية VialTweeter (صوتنة متزامنة من 10 عينات) أو UIP400MTP (لصوتنة لوحات متعددة الآبار مثل لوحات 96 بئر). للتحلل بالموجات فوق الصوتية مع UP200Ht ، استخدم الطرف الصغير S26d2. اضبط مسبقا وضع دورة الموجات فوق الصوتية في القائمة الرقمية. ضبط السعة على 10٪ ووضع دورة صوتنة من نبضات 2 ثانية من 20 دورة مع وقفة لمدة 30 ثانية بين كل انفجار نبض بالموجات فوق الصوتية.
نقل المواد الطافية إلى أنابيب زجاجية مع غطاء المسمار.
قم بإجراء استخراج Folch بإضافة 1 مل من الماء الفائق إلى كل أنبوب زجاجي ، متبوعا بإضافة 6 مل من خليط الكلوروفورم / الميثانول (النسبة = 2: 1) إلى كل أنبوب زجاجي.
دوامة كل أنبوب زجاجي لمدة 30 ثانية لمدة 4 مرات.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب عند 1258 × جم لمدة 15 دقيقة (Eppendorf ، 5810 R) لزيادة تعزيز فصل الطور.
انقل الجزء السفلي الكارهة للماء إلى أنبوب زجاجي نظيف بواسطة ماصة باستور زجاجية.
تجفيف الجزء السفلي مسعور تحت تدفق النيتروجين في مبخر النيتروجين.
قم بتخزين الحبيبات المجففة في فريزر -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
إعداد بالموجات فوق الصوتية من محللات دودة
تحلل الدودة: تم حصاد ديدان المرحلة L4 وغسلها ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت M9 (42.26 mM Na2هبو4، 22.04 مللي متر KH2بو4، و85.56 ملليمتر كلوريد الصوديوم، و0.87 ملليمتر مغسول4) من أجل إزالة جميع البكتيريا. بعد إزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت M9 ، تم إعادة تعليق الديدان في محلول التحلل: 50 mM HEPES ، 50 mM KCl ، 1mM EDTA ، 1mM EGTA ، 5 mM فوسفات β-glycerol ، 0.1٪ (v / v) Triton X-100 ، 50 mM فلوريد الصوديوم ، 1 mM orthovanadate الصوديوم ، 5 mM بيروفوسفات الصوديوم ، 0.2 mM فينيل ميثان سلفونيل فلوريد ومثبط الأنزيم البروتيني. تم تجميد الديدان في النيتروجين السائل وإذابتها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث مرات ، ثم تم صوتنة الديدان على الثلج الجاف باستخدام وحدة VialTweeter بالموجات فوق الصوتية للتحضير المتزامن لأنابيب 10 عينات. تم تنفيذ Sonication بسعة 50٪ في 10 دورات من 2 ثانية مع توقف مؤقت لمدة 30 ثانية بين رشقات الصوتنة. بعد ذلك ، تم طرد العينات بالطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تم جمع المادة الطافية وتخزينها عند -70 درجة مئوية. تم استخدام الحصة لقياس كمية البروتين بواسطة مقايسة برادفورد.
تحديد الجلوتاثيون الكلي ، GSH ، و GSSG: بالنسبة لقياس كمية الجلوتاثيون ، تم إجراء المحللات والتحديد في نفس اليوم. تم حصاد يرقات L4 التي تتغذى على الجلوكوز والسيطرة عليها وغسلها باستخدام M9 buffer ثلاث مرات. بعد إزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت M9 ، تم إعادة تعليق الديدان في حمض الميتافوسفوريك البارد المثلج (5٪ وزن / حجم) ، ثم تم صوتنة الديدان في الجليد باستخدام VialTweeter بالموجات فوق الصوتية بسعة 50٪ في عشر دورات صوتنة مدتها 2 ثانية مع توقف مؤقت لمدة 30 ثانية بين كل دورة. بعد ذلك ، يتم الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
(راجع ألكانتار فرنانديز وآخرون ، 2018)
C. elegans تحضير العينة قبل الترسيب المناعي والنشاف الغربي
باختصار ، بالنسبة للمستخلصات الجنينية ، نمت يرقات C. elegans L1 في ثقافات S-متوسطة سائلة واسعة النطاق حتى مرحلة البلوغ. تم جمع الأجنة باستخدام طريقة التبييض القياسية وتعليقها في محلول التحلل (50 mM Tris ، درجة الحموضة 7.5 ، 100 mM KCl ، 1 mM EDTA ، 1 mM MgCl2 ، 8.7٪ جلسرين ، 0.05٪ NP-40 ، 100 كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، و 1tape� كوكتيل مثبط الفوسفاتيز الأول والثاني) ، تم تجميده بسرعة في النيتروجين السائل ، وتم تحليله بواسطة تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية مع microtip مثل UP200Ht مع S26d2 لمدة 10 نبضات تزيد عن 10 ثوان بسعة 30٪. إذا كان يجب إعداد عدد أكبر من العينات بالموجات فوق الصوتية VialTweeter أو يوصى باستخدام UIP400MTP MultiSample-Ultrasonicator للوحات البئر. بعد صوتنة ، تم مسح المستخلصات مسبقا عن طريق الطرد المركزي عند 30000 جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم تحضين المستخلص الذي تم تطهيره مسبقا (300 ميكروغرام من البروتين الكلي) ب 40μSiberia �� g من الأجسام المضادة المنقاة المضادة ل CDC-25.1 (هذه الدراسة) المرتبطة ببروتين A-agarose ، أو كعنصر تحكم ، تم استخدام كمية مماثلة من الغلوبولين المناعي للأرانب (Ig) G المرتبط بالبروتين A-agarose في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر من محلول التحلل الذي يحتوي على 1٪ NP-40 ، والذي أدى إدراجه إلى تقليل الارتباط غير النوعي للبروتينات بالمصفوفة. تم تدوير العينات لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية ، وتم غسل الخرزات ثلاث مرات بمحلول تحلل ، واستخلصت ب 30 ميكرولتر من الجلايسين / حمض الهيدروكلوريك و 200 مللي مول كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 2.2. بعد الترسيب المناعي ، تم تخفيف الشطف في 30μSiberia ⏰ l من المخزن المؤقت لعينة SDS ، وتسخينه إلى 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، وعادة ما يتم تطبيق 3٪ من الإجمالي للمدخلات و 30٪ للشطف على SDS-PAGE متبوعا بالنشاف الغربي بمضادات CDC-25.1 (1: 400) ، أو مضاد LIN-23 (1: 750) ، أو مضاد يوبيكويتين (1: 1000) ، أو مضاد GSK3 (1: 500) ، أو الأجسام المضادة للجراحة β-أكتين (1: 2000). عندما لم تتعرض المستخلصات للترسيب المناعي ، تم إعادة تعليق نفس الكمية من البروتين الكلي المشتق من تلك المستخلصات في محلول عينة SDS ، وتسخينها إلى 95 درجة مئوية ، ثم تطبيقها مباشرة على SDS-PAGE وتحليلها بواسطة النشاف الغربي. (راجع Segref et al. 2020)
تحلل بالموجات فوق الصوتية تحت التحكم في درجة الحرارة Prescise
يعد التحكم الدقيق والموثوق في درجة الحرارة أمرا بالغ الأهمية عند التعامل مع العينات البيولوجية. تؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى تدهور البروتين الناجم عن الحرارة في العينات.
مثل جميع تقنيات تحضير العينات الميكانيكية ، فإن صوتنة يخلق الحرارة. ومع ذلك ، يمكن التحكم في درجة حرارة العينات بشكل جيد عند استخدام VialTweeter. نقدم لك خيارات متنوعة لمراقبة درجة حرارة عيناتك والتحكم فيها أثناء إعدادها باستخدام VialTweeter و VialPress للتحليل.
- مراقبة درجة حرارة العينة: تم تجهيز المعالج بالموجات فوق الصوتية UP200St ، الذي يقود VialTweeter ، ببرنامج ذكي ومستشعر درجة حرارة قابل للتوصيل. قم بتوصيل مستشعر درجة الحرارة ب UP200St وأدخل طرف مستشعر درجة الحرارة في أحد أنابيب العينة. عبر شاشة رقمية ملونة تعمل باللمس ، يمكنك ضبط نطاق درجة حرارة محدد في قائمة UP200St لصوتنة عينتك. سيتوقف جهاز الموجات فوق الصوتية تلقائيا عند الوصول إلى درجة الحرارة القصوى ويتوقف مؤقتا حتى تنخفض درجة حرارة العينة إلى القيمة الأقل ل ∆ درجة الحرارة المحددة. ثم يبدأ صوتنة تلقائيا مرة أخرى. تمنع هذه الميزة الذكية التدهور الناجم عن الحرارة.
- يمكن تبريد كتلة VialTweeter مسبقا. ضع كتلة VialTweeter (فقط sonotrode بدون محول الطاقة!) في الثلاجة أو الفريزر لتبريد كتلة التيتانيوم مسبقا يساعد على تأجيل ارتفاع درجة الحرارة في العينة. إذا أمكن ، يمكن تبريد العينة نفسها مسبقا أيضا.
- استخدم الثلج الجاف ليبرد أثناء صوتنة. استخدم صينية ضحلة مملوءة بالثلج الجاف وضع VialTweeter على الثلج الجاف حتى تتبدد الحرارة بسرعة.
العثور على المعطل الأمثل للخلايا بالموجات فوق الصوتية لتطبيق Lysis الخاص بك
Hielscher Ultrasonics هي الشركة المصنعة ذات الخبرة منذ فترة طويلة من المعرقلين الخلايا بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء والمجانسات للمختبرات ، مقاعد البدلاء وأنظمة النطاق الصناعي. يعد حجم زراعة الخلايا البكتيرية وهدف البحث أو الإنتاج وحجم الخلية المراد معالجتها في الساعة أو اليوم من العوامل الأساسية للعثور على معطل الخلايا بالموجات فوق الصوتية المناسب لتطبيقك.
Hielscher Ultrasonics تقدم حلولا مختلفة لصوتنة في وقت واحد من عينات متعددة (ما يصل إلى 10 قوارير) وكذلك عينات الكتلة (أي لوحات microtiter / لوحات 96 جيدا)، والموجات فوق الصوتية مختبر نوع التحقيق الكلاسيكية مع مستويات الطاقة المختلفة من 50 إلى 400 واط إلى المعالجات بالموجات فوق الصوتية الصناعية بالكامل مع ما يصل إلى 16000watts لكل وحدة لتعطيل الخلايا التجارية واستخراج البروتين في الإنتاج الكبير. تم بناء جميع الموجات فوق الصوتية Hielscher لعملية 24/7/365 تحت حمولة كاملة. المتانة والموثوقية هي السمات الأساسية لأجهزتنا بالموجات فوق الصوتية.
تم تجهيز جميع المجانسات الرقمية بالموجات فوق الصوتية ببرامج ذكية وشاشة ملونة تعمل باللمس وبروتوكول تلقائي للبيانات ، مما يجعل جهاز الموجات فوق الصوتية أداة عمل مريحة في مرافق المختبر والإنتاج.
أخبرنا ، أي نوع من الخلايا ، ما الحجم ، بأي تردد وبأي هدف لديك لمعالجة عيناتك البيولوجية. سوف نوصيك بأنسب معطل للخلايا بالموجات فوق الصوتية لمتطلبات العملية الخاصة بك.
يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأنظمتنا بالموجات فوق الصوتية من المجانسات المدمجة المحمولة باليد وأجهزة الموجات فوق الصوتية متعددة العينات إلى المعالجات بالموجات فوق الصوتية الصناعية للتطبيقات التجارية:
حجم الدفعة | معدل التدفق | الأجهزة الموصى بها |
---|---|---|
96 بئر / لوحات عيار دقيق | ن.أ. | UIP400MTP |
10 قوارير à 0.5 إلى 1.5 مل | ن.أ. | VialTweeter في UP200St |
0.01 إلى 250 مل | 5 إلى 100 مل / دقيقة | UP50H |
0.01 إلى 500 مل | 10 إلى 200 مل / دقيقة | UP100H |
10 إلى 2000 مل | 20 إلى 400 مل / دقيقة | UP200Ht, UP400St |
0.1 إلى 20 لتر | 0.2 إلى 4 لتر / دقيقة | UIP2000hdT |
10 إلى 100 لتر | 2 إلى 10 لتر / دقيقة | UIP4000hdT |
ن.أ. | 10 إلى 100 لتر / دقيقة | UIP16000 |
ن.أ. | أكبر | مجموعة من UIP16000 |
اتصل بنا! / اسألنا!
الأدب / المراجع
- Chen J.-X; Cipriani P.G.; Mecenas D.; Polanowska J.; Piano F.; Gunsalus K.C.; Selbach M. (2016): In Vivo Interaction Proteomics in Caenorhabditis elegans Embryos Provides New Insights into P Granule Dynamics. Molecular & Cellular Proteomics 15.5; 2016. 1642-1657.
- Jonathan Alcántar-Fernández, Rosa E. Navarro, Ana María Salazar-Martínez, Martha Elva Pérez-Andrade, Juan Miranda-Ríos (2018): Caenorhabditis elegans respond to high-glucose diets through a network of stress-responsive transcription factors. PLoS One 13(7); 2018.
- Segref, A.; Cabello, J.; Clucas, C.; Schnabel, R.; Johnstone I.L. (2010): Fate Specification and Tissue-specific Cell Cycle Control of the Caenorhabditis elegans Intestine. Molecular Biology of the Cell Vol. 21, 2010. 725–738.
- Henderson S.T., Bonafe M., Johnson T.E. (2006): daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2006; 61:444–60.
حقائق تستحق المعرفة
كاينورهابديتيس ايليجانس
C. elegans هي نيماتودا شفافة تعيش بحرية (دودة مستديرة) يبلغ طولها حوالي 1 مم ، والتي تتغذى على البكتيريا (مثل الإشريكية القولونية) ولها دورة حياة قصيرة نسبيا. عند 20 درجة مئوية ، يبلغ متوسط عمر السلالة المختبرية من C. elegans (N2) حوالي 2-3 أسابيع ووقت جيل من 3 إلى 4 أيام. عندما تزرع C. elegans بأعداد كبيرة ، والتي يمكن القيام بها بسهولة في ظل ظروف معملية يتم التحكم فيها بدقة ، يمكن فحصها بسهولة بحثا عن مبدأ عمل الأدوية الجديدة بالإضافة إلى آثارها وتفاعلها ضمن العمليات الجزيئية المعقدة في الأمراض البشرية. إن الجينوم القصير ودورة الحياة القصيرة والمعالجة البسيطة في البيئات المختبرية تجعل من C. elegans كائنا نموذجيا مثاليا للبحث مثل علم الجينوم والبروتينات وعلم الأحياء التنموي وأبحاث الأمراض وتطوير الأدوية وما إلى ذلك.
يمكن أن تكون ديدان Caenorhabditis elegans إما ذكرا أو خنثى. الخنثى لها أعضاء تناسلية من الذكور والإناث. ومع ذلك ، لا توجد ديدان الإناث. يمكن للخنثى إما الإخصاب الذاتي أو يمكن أن تتكاثر أيضا مع الديدان الذكور. يمكن أن تنتج C. elegans أكثر من 1000 بيضة كل يوم.
نظرا لأن C. elegans هي واحدة من أبسط الكائنات الحية ذات الجهاز العصبي ، فإن دودة الديدان الخيطية تستخدم منذ عام 1963 ككائن نموذجي للبحث. لا تطلق الخلايا العصبية إمكانات الفعل ، ولا تعبر عن أي قنوات صوديوم ذات جهد كهربائي. في الخنثى ، يتكون هذا النظام من 302 خلية عصبية تم تعيين نمطها بشكل شامل ، فيما يعرف باسم الشبكة العصبية.
العديد من الجينات في جينوم C. elegans لها نظائر وظيفية في البشر مما يجعلها نموذجا مفيدا للغاية للأمراض البشرية وتستخدم على سبيل المثال لدراسة علم الأحياء التنموي والشيخوخة والعوامل التي تؤثر على طول العمر. علاوة على ذلك ، توفر طفرات C. elegans نماذج للعديد من الأمراض البشرية بما في ذلك الاضطرابات العصبية (مثل مرض الزهايمر) وأمراض القلب الخلقية وأمراض الكلى.
جعلت هذه العوامل C. elegans نموذجا قيما للغاية للعديد من مجالات البحث. وبالتالي ، كان C. elegans أول كائن حي متعدد الخلايا يتم تسلسل جينومه بالكامل. يحتوي الجينوم على ما يقدر بنحو 20,470 جينا مشفرا للبروتين. حوالي 35 ٪ من جينات C. elegans لها متجانسات بشرية. ومن اللافت للنظر أن الجينات البشرية قد أظهرت مرارا وتكرارا أنها تحل محل متجانسات C. elegans عند إدخالها في C. elegans. على العكس من ذلك ، يمكن أن تعمل العديد من جينات C. elegans بشكل مشابه لجينات الثدييات.
يبلغ عمر C. elegans حوالي 3 أسابيع ويتكون من ست مراحل حياة: التطور الجنيني (مرحلة البويضة) ، وأربع مراحل يرقية (L1 إلى L4) ، ومرحلة البلوغ. تفقس الديدان الخيطية من البيض على شكل يرقات L1 تتكون من 560 خلية. يحدث النمو خلال كل مرحلة من مراحل اليرقات عن طريق انقسام الخلايا وتضخم الخلايا. يتخلل الانسلاخ الجلدي كل مرحلة من مراحل اليرقات. إذا كانت الظروف البيئية القاسية تشير إلى الدودة النامية أنه من غير المرجح أن تدعم الظروف خصوبة البالغين ، يمكن ل C. elegans تغيير تطورها وتشكيل مرحلة يرقية بديلة L3 ، حيث تدخل اليرقات في مرحلة dauer. في هذه الحالة ، تكون متسامحة بشكل غير عادي مع الإجهاد وطويلة العمر ويمكنها البقاء على قيد الحياة من ثلاثة إلى تسعة أشهر. تعزل يرقات Dauer نفسها عن الشدائد عن طريق إغلاق كل من تجاويفها الشدقية والشرجية ، وتقليص أمعائها ، وتشغيل برنامج وراثي يعتمد على daf-16 / FOXO يؤدي ، من بين أمور أخرى ، إلى التعبير عن بشرة خاصة بالدوار. (راجع هندرسون وآخرون ، 2006)
C. ايليجانس يرقات داور
يرقات Dauer هو مصطلح يرقات الديدان الخيطية ، التي دخلت مرحلة نمو بديلة. يستخدم مصطلح "يرقات Dauer" بشكل خاص للديدان من عائلة rhabditids بما في ذلك Caenorhabditis elegans. كلمة "Dauer" هي من أصل ألماني وتعني "المدة” في معنى “فترة من الزمن". تدخل يرقات Dauer في نوع من الركود ويمكنها البقاء على قيد الحياة في ظروف قاسية. إذا وعندما تدخل اليرقة مرحلة dauer يعتمد على الظروف البيئية. تتم دراسة يرقات Dauer على نطاق واسع في علم الأحياء لأن laravae تظهر قدرة غير عادية على البقاء على قيد الحياة في البيئات القاسية والعيش لفترات طويلة من الزمن. على سبيل المثال ، يمكن ليرقات C. elegans dauer البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى أربعة أشهر ، وهي أطول بكثير من متوسط عمرها البالغ حوالي ثلاثة أسابيع أثناء النمو التناسلي الطبيعي.
نظرة عامة على دورة حياة C. elegans
C. ايليجانس التنمية في بيئات مواتية:
يظهر Caenorhabditis elegans (C. elegans) تقدما تنمويا مختلفا في ظل ظروف بيئية مواتية وغير مواتية.
استجابة C. elegans للظروف المواتية:
في ظروف مواتية ، تتبع الدودة المستديرة المجهرية Caenorhabditis elegans (C. elegans) مسارا تنمويا محددا جيدا. عادة ما تمر الديدان الخيطية بدورة حياتها بسرعة كبيرة عندما تكون الظروف البيئية مثالية ، عادة في درجات حرارة تتراوح بين 15 درجة مئوية إلى 20 درجة مئوية.
- التنمية الإنجابية: تبدأ C. elegans دورة حياتها كجنين. ثم يتقدم عبر أربع مراحل يرقية متميزة ، يتم اختصارها من L1 إلى L4.
- مرحلة الكبار: بعد الانتهاء من مراحل اليرقات الأربع ، تصل C. elegans إلى مرحلة البلوغ في غضون 3 إلى 5 أيام فقط. في هذه المرحلة ، يكونون قادرين على التكاثر والاستمرار في العيش لمدة 2 إلى 3 أسابيع أخرى ، اعتمادا على العوامل البيئية.
استجابة C. elegans للظروف غير المواتية:
ومع ذلك ، فإن C. elegans هو كائن مرن ويمكنه التكيف مع الظروف غير المواتية من خلال عملية تسمى تكوين dauer.
- تشكيل داور: عندما تصبح الظروف البيئية غير مواتية ، مثل الاكتظاظ أو محدودية الإمدادات الغذائية أو ارتفاع درجات الحرارة ، يمكن أن تدخل C. elegans مرحلة يرقية ثالثة غير عادية تسمى “داور,” يختصر ك L3d.
- بقاء داوير: يتم تكييف يرقات Dauer خصيصا للبقاء على قيد الحياة في ظروف قاسية. يمكنهم العيش لعدة أشهر في هذه المرحلة ، والحفاظ على الطاقة وتحمل البيئات الصعبة.
الانتعاش في البيئات المواتية:
الجانب الرائع ل C. elegans هو قدرته على العودة إلى دورة الحياة الطبيعية عندما تتحسن الظروف.
- العودة إلى الظروف المواتية: عندما تواجه يرقات C. elegans dauer ظروفا مواتية مرة أخرى ، مثل الغذاء الوفير ، وانخفاض الكثافة السكانية ، ودرجات الحرارة المناسبة ، فإنها تشعر بالتغير في البيئة.
- الاسترداد والتكاثر: استجابة لهذه الظروف المحسنة ، تخضع يرقات dauer لعملية تسمى “الانتعاش.” أثناء الشفاء ، ينتقلون مرة أخرى إلى مراحل اليرقات ويصبحون في النهاية بالغين إنجابيين مع عمر طبيعي.
هذه القدرة على التبديل بين مراحل النمو استجابة للظروف البيئية هي جانب خاص من بيولوجيا C. elegans. إنه يسمح لهم بالبقاء على قيد الحياة والتكاثر بفعالية في مجموعة واسعة من الظروف ، مما يجعلهم كائنا نموذجيا قيما للبحث العلمي ، لا سيما في دراسة التنمية وعلم الوراثة والشيخوخة.