Hielscher Ultrasonics
يسعدنا مناقشة عمليتك.
اتصل بنا: +49 3328 437-420
راسلنا بالبريد الإلكتروني: [email protected]

تحضير عينات C. Elegans بالموجات فوق الصوتية

تُعد C. elegans، وهي دودة خيطية، كائنًا نموذجيًا يُستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء. يتطلب تحضير العينات قبل التحليل التحلل واستخلاص البروتينات والدهون، وكذلك تجزئة RNA، وهي عمليات يمكن إجراؤها بموثوقية عبر المعالجة بالموجات فوق الصوتية. أجهزة تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية أجهزة موثوقة ومتطورة وسهلة الاستخدام لتحضير عينات C. elegans بسرعة.

تحضير عينات C. elegans بالموجات فوق الصوتية

Caenorhabditis elegans ديدان أسطوانية تُستخدم على نطاق واسع في مختبرات البحث لدراسة علم الجينوم وعلم الأحياء النمائي والأمراض. للعديد من الجينات في جينوم C. elegans نظائر وظيفية لدى البشر. لذلك، تُعد هذه الدودة الخيطية نموذجًا مفيدًا للغاية لدراسة الأمراض البشرية. ومن المزايا الأخرى التي تفسر الاستخدام الواسع لـ C. elegans سهولة استزراعها وانخفاض تكلفته على أطباق تحتوي على بكتيريا (مثل E. coli)، وشفافيتها وسهولة التعامل معها، وكذلك إمكانية تجميد الديدان وتخزينها لفترة أطول.
يُعد تحليل البروتينات والدهون من الإجراءات المعتادة في المختبرات، ويُعد تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية الطريقة المعتمدة لإحداث تحلل ديدان C. elegans الخيطية في جميع مراحل نموها (أي الأجنة واليرقات L1-L4 والديدان البالغة). ونظرًا إلى استخدام C. elegans أيضًا كنظام للتعبير البروتيني بهدف زيادة التعبير عن بروتينات مستهدفة، يلزم استخدام طريقة موثوقة وقابلة للتكرار للتحلل واستخلاص البروتينات، توفر مردودًا مرتفعًا من البروتين. تتوفر أنظمة تفكيك الخلايا والاستخلاص بالموجات فوق الصوتية في صورة مجانسات من نوع المسبار وأجهزة معالجة بالموجات فوق الصوتية لعينات متعددة. ولتلبية متطلبات التحضير المريح للعينات مهما كانت أحجامها وأعدادها، توفر Hielscher Ultrasonics جهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية المثالي لإجراءات مختبرك.
تُعد C. elegans كائنًا نموذجيًا يُستخدم على نطاق واسع في الأبحاث البيولوجية. التحلل بالموجات فوق الصوتية تقنية متطورة وموثوقة وقابلة للتكرار وسريعة لتحضير مستخلصات بروتينية عالية الجودة من C. elegans.

تحلل C. elegans بالموجات فوق الصوتية من أجل

  • تحضير متجانسات الديدان
  • استخلاص البروتينات
  • استخلاص الدهون
  • التقدير الكمي للبروتينات
  • الترسيب المناعي
  • اللطخ الغربي
  • استخلاص RNA
  • المقايسات الإنزيمية
VialTweeter مع معالج الموجات فوق الصوتية UP200ST

جهاز VialTweeter لمعالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية من أجل التحضير المتزامن لـ 10 أنابيب اختبار.

طلب معلومات



بروتوكولات تفكيك C. Elegans وتحللها بالموجات فوق الصوتية

يمكن إجراء تجانس C. elegans وتحللها بالموجات فوق الصوتية، ثم استخلاص البروتينات والدهون، باستخدام إجراءات متنوعة ومحاليل منظمة مختلفة للتجانس والتحلل وغيرها. تشترك جميع بروتوكولات التحلل في ضرورة إبقاء العينات على الثلج باستمرار لمنع تدهور البروتينات. نقدم فيما يلي بعض بروتوكولات التحلل والاستخلاص بالموجات فوق الصوتية الموثوقة والسريعة لتحضير عينات C. elegans عالية الجودة المحتوية على البروتينات أو الدهون.

مزايا تحلل C. elegans بالموجات فوق الصوتية

  • موثوق
  • قابل للتكرار
  • تُضبط درجة حرارته بدقة
  • تحكم موثوق في العملية
  • طريقة لطيفة
  • سهل التطبيق
  • آمن

استخلاص البروتينات من عينات C. elegans بالموجات فوق الصوتية

يمكن إجراء تحلل ديدان C. elegans واستخلاص البروتينات منها بالموجات فوق الصوتية باستخدام بروتوكولات مختلفة. نقدم فيما يلي بعض بروتوكولات التحلل الموثوقة والسريعة للحصول على نتائج قابلة للتكرار لاستخلاص البروتينات.

التحضير السريع لمستخلص سيتوسولي من ديدان C. elegans بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية

باستخدام البروتوكول التالي، يمكنك تحضير نواتج تحلل C. elegans في أقل من 30 دقيقة.
جمع C. elegans
انقل ديدان C. elegans المطلوبة إلى أنبوب 1.5ml يحتوي على محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، أو اغسلها من طبق باستخدام 1.5ml من PBS. أجرِ الطرد المركزي لمدة 1min عند 2000rpm لتكوين راسب. أبقِ العينات على الثلج طوال الوقت.
ثم اغسل الديدان مرتين باستخدام PBS.
بعد ذلك، اغسل الديدان مرتين باستخدام ddH2O.
أعد تعليق الديدان في ما لا يقل عن 500ul من المحلول المنظم للتجانس (HB). أصبحت عينات الديدان الآن جاهزة للتحلل بالموجات فوق الصوتية.
للحصول على مستخلص بروتيني أعلى جودة، قد ترغب في تقليل التلوث البكتيري بغسل الديدان لمدة 5min في كل من PBS والماء المعقم فائق النقاء (ddH2O)، أو إجراء التعويم بالسكروز. أبقِ عينات الديدان على الثلج باستمرار.

بروتوكول تحلل C. elegans بالموجات فوق الصوتية

  • تأكد من إعداد جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية مسبقًا، بحيث يكون المجانس بالموجات فوق الصوتية جاهزًا للاستخدام (المسبار مركب وبرنامج المعالجة بالموجات فوق الصوتية مضبوط مسبقًا). 
  • جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UP200Ht‏ (200 واط، 26kHz) مع الطرف الدقيق S26d2 لتحضير العينات البيولوجيةإذا كان جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية مثبتًا على حامل، فضع الحمام الثلجي الذي يحتوي على أنابيب العينات تحت مسبار الموجات فوق الصوتية، وأدخل المسبار في أنبوب 1.5ml.

  • لتحلل C. elegans باستخدام UP200St أو UP200Ht، ينبغي إجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام طرف دقيق (مثل المسبار S26d2 بقياس 2mm؛ انظر الصورة على اليسار)، عند سعة اهتزاز 40% لمدة 1sec مع فترات توقف مقدارها 30sec بين النبضات. تُعد 5 دورات من المعالجة بالموجات فوق الصوتية، مدة كل منها 1 ثانية مع فترات توقف مقدارها 30sec، مثالية لتحلل C. elegans. إذا كنت تُجري التحلل للمرة الأولى، يمكنك التحقق من تقدمه في أجزاء صغيرة من العينة بعد كل نبضة باستخدام المجهر.
  • يكتمل التحلل بنجاح عندما تتفكك الديدان. تؤدي المعالجة المفرطة بالموجات فوق الصوتية إلى تكسر النوى، ويظهر ذلك عندما تصبح العينة لزجة أو تُكوّن رغوة. لمنع تدهور العينة، استخدم مزيدًا من النبضات عند الحاجة. لا تزِد مدة كل دورة نبضية بالموجات فوق الصوتية، للحصول على مستخلصات بروتينية عالية الجودة.
  • روِّق ناتج تحلل الخلايا بالطرد المركزي للديدان المحللة بالموجات فوق الصوتية عند 14,000rpm لمدة 10min عند 4ºC.
  • ثم انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد وجهّزه للترسيب المناعي أو للمقايسات الأخرى.

ملاحظة بشأن المحلول المنظم للتجانس: حضّر المحلول المنظم للتجانس الخاص ببروتوكول التحلل بالموجات فوق الصوتية أعلاه كما يلي:

  • 15 mM Hepes عند pH 7.6 – 15 ml من 0.5 M
  • 10 mM KCl – 2.5 ml من 2 M
  • 1.5 mM MgCl2 – 0.75 ml من 1 M
  • 0.1 mM EDTA – 100 ul من 0.5 M
  • 0.5 mM EGTA – 2.5 ml من 0.1 M
  • 44 mM سكروز – 14.7 ml من 50 %
  • أضف قبل الاستخدام مباشرة: 1mM DTT – 1000x من 1M
  • بالإضافة إلى مثبط للبروتياز

 

كيفية اختيار جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية الأمثل لتفكيك الخلايا واستخلاص البروتينات في العلوم والتحليليشرح هذا الدرس نوع جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية الأنسب لمهام تحضير العينات، مثل التحلل الخلوي وتفكيك الخلايا وعزل البروتينات وتجزئة DNA وRNA في المختبرات والتحليل والبحث. اختر نوع الجهاز المثالي لتطبيقك وحجم العينات وعددها ومعدل معالجة العينات. لدى Hielscher Ultrasonics المجانس بالموجات فوق الصوتية المثالي لك!
يشرح هذا الدرس نوع جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية الأنسب لمهام تحضير العينات، مثل التحلل الخلوي وتفكيك الخلايا وعزل البروتينات وتجزئة DNA وRNA في المختبرات والتحليل والبحث. اختر نوع الجهاز المثالي لتطبيقك وحجم العينات وعددها ومعدل معالجة العينات. لدى Hielscher Ultrasonics المجانس بالموجات فوق الصوتية المثالي لك!

 

تحلل C. elegans بمعدل معالجة مرتفع في أطباق ذات 96 بئرًا باستخدام جهاز معالجة الأطباق بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP

تحلل C. elegans (الديدان الخيطية البالغة)
UIP400MTP بسعة اهتزاز 80%، و20 دورة (كل دورة معالجة بالموجات فوق الصوتية: 30 sec تشغيل، 30 sec توقف)
المحلول المنظم للتحلل:

  • الخيار 1) 4% SDS، و0.1 M Tris/HCl عند pH 8.0، و1 mM EDTA
  • الخيار 2) للترسيب المناعي المشترك (co-IP): 10 mM Tris HCl عند (pH 7.5)، و150 mM NaCl، و0.5 mM EDTA، و0.5 % NP-40 (مزيج مثبطات البروتيناز Complete)

تجزئة DNA بمعدل معالجة مرتفع
DNA من C. elegans (الديدان الخيطية البالغة) بطول 200–300bp: جهاز معالجة الأطباق بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP – اضبط سعة الاهتزاز على 80%، و30 نبضة – لكل منها 30sec تشغيل و30sec توقف

جهاز معالجة الأطباق بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP لتحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع: يعالج UIP400MTP العينات بالموجات فوق الصوتية بصورة متجانسة في الأطباق متعددة الآبار وأطباق المعايرة الدقيقة والأطباق ذات 96 بئرًا، مما يفكك الخلايا ويستخلص البروتينات ويجزئ DNA وRNA ولييفات ألفا-سينوكلين.

جهاز معالجة الأطباق بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP لتحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع، يعالج العينات بالموجات فوق الصوتية بصورة متجانسة في الأطباق متعددة الآبار وأطباق المعايرة الدقيقة والأطباق ذات 96 بئرًا

تحلل C. elegans بالموجات فوق الصوتية لمقايسات التنقية بالألفة الكمية

جُمعت أجنة C. elegans حديثًا (∼2 مليون لكل مكرر) في ثلاثة مكررات بيولوجية، باستخدام التبييض للخناثى اليافعة الحاملة للبيض، وعولجت بالموجات فوق الصوتية على الثلج (الدورة: 0.5 s، سعة الاهتزاز: 40–45%، 5 نبضات/جلسة، 5 جلسات، الفاصل بين الجلسات: 30 s؛ معالج الموجات فوق الصوتية UP200S مع الطرف الدقيق S26d2‏ (Hielscher Ultrasonics GmbH)) في محلول منظم للتحلل (الحجم الكلي: ∼600 μl؛ و50 mm Tris-HCl عند pH 7.4، و100 mm KCl، و1 mm MgCl2، و1 mm EGTA، و1 mm DTT، و10% غليسرول، ومزيج مثبطات البروتياز، و0.1% Nonidet P-40 Substitute). بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية، أُضيف Nonidet P-40 Substitute حتى 1%، وحُضنت نواتج التحلل مع التدوير من طرف إلى طرف عند 4°C لمدة 30 min، ثم أُجري الطرد المركزي عند 20,000 × g لمدة 20 min عند 4°C. ثم سُحب ناتج التحلل المروّق دون الإخلال بطبقة الدهون العلوية، وقُسّم إلى نصفين وُزِّعا على خرز الأغاروز المضاد لـ GFP أو خرز الضبط المحجوب (40–50 μl). بعد التدوير من طرف إلى طرف عند 4°C لمدة 60–90 min، غُسل الخرز مرة واحدة بمحلول منظم للتحلل يحتوي على 0.1% Nonidet P-40 Substitute، ثم غُسل مرتين إما بالمحلول المنظم I‏ (25 mm Tris-HCl عند pH 7.4، و300 mm NaCl، و1 mm MgCl2)، أو بالمحلول المنظم II‏ (1 mm Tris-HCl عند pH 7.4، و150 mm NaCl، و1 mm MgCl2)، أو بكليهما. لأغراض السحب بالألفة لـ GFP:MBK-2، أُجريت تجربتان منفصلتان باستخدام شروط غسل مختلفة. أُزيحت البروتينات بالرج المداري في 50 μl من 6 m يوريا/2 M ثيويوريا عند درجة حرارة الغرفة. وفي تجارب السحب بالألفة لـ MBK-1::GFP، أُزيحت البروتينات مرتين بالرج في 50μl من 8 m كلوريد الغوانيدينيوم عند 90°C، ثم أُجري الترسيب بالإيثانول. ثم هُضمت عينات البروتين المُزاحة في المحلول.
(راجع Chen et al., 2016)

يحتوي السونوترود MTP-24-8-96 على ثمانية مسابير للموجات فوق الصوتية لمعالجة آبار أطباق المعايرة الدقيقة بالموجات فوق الصوتية.

يحتوي السونوترود MTP-24-8-96 على ثمانية مسابير للموجات فوق الصوتية لمعالجة آبار أطباق المعايرة الدقيقة بالموجات فوق الصوتية.

تجانس الديدان وتحللها بالموجات فوق الصوتية

لإجراء تحلل C.elegans واستخلاص البروتينات منها، جُمعت 30,000 دودة خيطية من المرحلة المعنية لكل عينة، وغُسلت بمحلول S-basal مبرد بالثلج، ثم رُكّزت بالطرد المركزي عند 1500 rpm لمدة 2 min. وغُسلت ست مرات بمحلول S-basal مبرد بالثلج لإزالة البكتيريا المتبقية، ثم حُفظت على الثلج حتى أصبحت جاهزة للاستخدام. لاستخلاص البروتينات، تُركت الديدان البالغة الحاملة للبيض لتكوّن راسبًا متراصًا بعد الغسل الأخير بمحلول S-basal. ثم أُعيد تعليق رواسب الديدان في 1 ml من المحلول المنظم للاستخلاص المبرد بالثلج [20 mM فوسفات البوتاسيوم عند pH 7.4، و2mM EDTA، و1% Triton-X-100، ومثبطات البروتياز (Sigma P2714)]، وعولجت فورًا.
عولجت ∼30,000 دودة بالغة حاملة للبيض (ما يعادل ∼100 mg من الوزن الرطب) بالموجات فوق الصوتية على الثلج، باستخدام جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار (مثل UP50H مع الطرف الدقيق MS2)، بسعة اهتزاز 40% لمدة 10 دورات من 3 sec تشغيل و30 sec توقف، في 1 ml من المحلول المنظم للاستخلاص المبرد بالثلج. (راجع Baskharan et al. 2012)

استخلاص الدهون من C. elegans بالموجات فوق الصوتية

في علم الدهون، وهو فرع من علم المستقلبات، تُوصَّف المجموعة الكاملة للدهون في الأنظمة البيولوجية وتُحلَّل. تُستخدم C. elegans على نطاق واسع في علم الدهون لدراسة تفاعل الدهون الأيضية وتأثيراتها في الصحة ومدة الحياة.
يُستخدم التحلل والاستخلاص بالموجات فوق الصوتية لتحرير الدهون، مثل الدهون السفينغولية، من أجنة C. elegans ويرقاتها وديدانها البالغة. وتُستخدم المعالجة بالموجات فوق الصوتية لتحضير متجانسات الديدان ثم استخلاص الدهون من العينة.
بروتوكول استخلاص الدهون من C. elegans بالموجات فوق الصوتية
أذِب راسب C. elegans على الثلج وأعد تعليقه باستخدام 0.5 ml من ultrawater. عالج عينات C. elegans بالموجات فوق الصوتية في أنابيب اختبار 1.5mL، مع إبقاء العينات على الثلج باستمرار.
يمكن إجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار مثل UP200Ht، أو وحدة تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية VialTweeter (للمعالجة المتزامنة لـ 10 عينات بالموجات فوق الصوتية)، أو UIP400MTP (لمعالجة الأطباق متعددة الآبار، مثل الأطباق ذات 96 بئرًا، بالموجات فوق الصوتية). للتحلل بالموجات فوق الصوتية باستخدام UP200Ht، استخدم الطرف الدقيق S26d2. اضبط وضع دورات الموجات فوق الصوتية مسبقًا في القائمة الرقمية. اضبط سعة الاهتزاز على 10% ووضع دورات المعالجة بالموجات فوق الصوتية على 20 دورة من نبضات مدتها 2 sec، مع فترة توقف مقدارها 30 sec. بين كل دفعة نبضية بالموجات فوق الصوتية.
انقل السوائل الطافية إلى أنابيب زجاجية ذات أغطية لولبية. أجرِ استخلاص Folch بإضافة 1 ml من ultrawater إلى كل أنبوب زجاجي، ثم إضافة 6 ml من مزيج الكلوروفورم/الميثانول (النسبة = 2:1) إلى كل أنبوب زجاجي.
اخلط كل أنبوب زجاجي باستخدام الخلاط الدوامي لمدة 30 sec، وكرر ذلك 4 مرات. أجرِ الطرد المركزي للأنابيب عند 1,258 x g لمدة 15 min‏ (Eppendorf, 5810 R) لتعزيز فصل الأطوار. انقل الجزء السفلي الكاره للماء إلى أنبوب زجاجي نظيف باستخدام ماصة Pasteur زجاجية. جفف الجزء السفلي الكاره للماء تحت تيار من النيتروجين في مبخر نيتروجيني. خزّن الراسب المجفف في مجمد عند -80 °C حتى الاستخدام. 


تحضير نواتج تحلل الديدان بالموجات فوق الصوتية

ناتج تحلل الديدان: جُمعت الديدان في المرحلة L4 وغُسلت ثلاث مرات بالمحلول المنظم M9‏ (42.26 mM Na2HPO4، و22.04 mM KH2PO4، و85.56 mM NaCl، و0.87 mM MgSO4) لإزالة جميع البكتيريا. بعد إزالة أكبر قدر ممكن من المحلول المنظم M9، أُعيد تعليق الديدان في محلول منظم للتحلل: 50 mM HEPES، و50 mM KCl، و1mM EDTA، و1mM EGTA، و5 mM فوسفات β-غليسرول، و0.1% (v/v) Triton X-100، و50 mM فلوريد الصوديوم، و1 mM أورثوفانادات الصوديوم، و5 mM بيروفوسفات الصوديوم، و0.2 mM فلوريد فينيل ميثان سلفونيل، ومثبط للبروتياز. جُمّدت الديدان في النيتروجين السائل وأُذيبت عند 37°C ثلاث مرات، ثم عولجت بالموجات فوق الصوتية على الثلج الجاف باستخدام وحدة VialTweeter للمعالجة بالموجات فوق الصوتية من أجل التحضير المتزامن لـ 10 أنابيب عينات. أُجريت المعالجة بالموجات فوق الصوتية بسعة اهتزاز 50% في 10 دورات مدة كل منها 2 sec. مع فترة توقف مقدارها 30 sec بين دفعات المعالجة بالموجات فوق الصوتية. بعد ذلك، أُجري الطرد المركزي للعينات عند 12,000 rpm عند 4°C لمدة 15 min. جُمع السائل الطافي وخُزّن عند -70°C. استُخدم جزء منه للتقدير الكمي للبروتينات بواسطة مقايسة Bradford.
تحديد الغلوتاثيون الكلي وGSH وGSSG: للتقدير الكمي للغلوتاثيون، أُعدّت نواتج التحلل وأُجري التحديد في اليوم نفسه. جُمعت يرقات L4 المُغذّاة بالغلوكوز ويرقات الضبط، وغُسلت بالمحلول المنظم M9 ثلاث مرات. بعد إزالة أكبر قدر ممكن من المحلول المنظم M9، أُعيد تعليق الديدان في حمض الميتافوسفوريك المبرد بالثلج (5% w/v)، ثم عولجت الديدان بالموجات فوق الصوتية في الثلج باستخدام VialTweeter بسعة اهتزاز 50% في عشر دورات معالجة بالموجات فوق الصوتية مدة كل منها 2 sec. مع فترة توقف مقدارها 30 sec. بين كل دورة. بعد ذلك، أُجري الطرد المركزي عند 12,000 rpm عند 4 ̊C لمدة 15 min.
(راجع Alcántar-Fernández et al., 2018)

تحضير عينات C. elegans قبل الترسيب المناعي واللطخ الغربي

باختصار، لتحضير المستخلصات الجنينية، نُمّيت يرقات C. elegans في المرحلة L1 في مزارع سائلة واسعة النطاق من الوسط S حتى مرحلة البلوغ. جُمعت الأجنة باستخدام طريقة التبييض القياسية وعُلّقت في محلول منظم للتحلل (50 mM Tris عند pH 7.5، و100 mM KCl، و1 mM EDTA، و1 mM MgCl2، و8.7% غليسرول، و0.05% NP-40، و1􏰅 من مزيج مثبطات البروتياز، و1􏰅 من مزيج مثبطات الفوسفاتاز I وII)، ثم جُمّدت سريعًا في النيتروجين السائل وحُلّلت بتفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية ذي طرف دقيق مثل UP200Ht مع S26d2 لمدة 10 نبضات على مدى 10 s بسعة اهتزاز 30%. إذا كان يلزم تحضير عدد أكبر من العينات، يُوصى باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية VialTweeter أو جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية لعينات متعددة UIP400MTP المخصص لأطباق الآبار. بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية، رُوّقت المستخلصات مسبقًا بالطرد المركزي عند 30,000g لمدة 20 min عند 4°C. حُضن المستخلص المروّق مسبقًا (300µg من البروتين الكلي) مع 40µ􏰂g من الجسم المضاد anti-CDC-25.1 المنقى بالألفة (هذه الدراسة) والمربوط تشابكيًا بأغاروز البروتين A، أو استُخدمت، كضبط، كمية مماثلة من الغلوبولين المناعي للأرنب (Ig)G المربوط تشابكيًا بأغاروز البروتين A، في حجم كلي مقداره 200µl من المحلول المنظم للتحلل المحتوي على 1% NP-40، الذي قللت إضافته من الارتباط غير النوعي للبروتينات بالمصفوفة. دُوّرت العينات لمدة 1 h عند 4°C، وغُسل الخرز ثلاث مرات بالمحلول المنظم للتحلل، وأُزيحت المواد المرتبطة باستخدام 30µl من الغليسين/HCl و200 mM NaCl عند pH 2.2. بعد الترسيب المناعي، خُففت محاليل الإزاحة في 30µ􏰂l من المحلول المنظم لعينات SDS، وسُخّنت إلى 95°C لمدة 4 min، وعادةً ما حُمّل 3% من الإجمالي لعينة الإدخال و30% لمحاليل الإزاحة على SDS-PAGE، ثم أُجري اللطخ الغربي باستخدام الأجسام المضادة anti-CDC-25.1‏ (1:400)، أو anti-LIN-23‏ (1:750)، أو المضادة لليوبيكويتين (1:1000)، أو anti-GSK3􏰁‏ (1:500)، أو anti-􏰁β-actin‏ (1:2000). وفي الحالات التي لم تخضع فيها المستخلصات للترسيب المناعي، أُعيد تعليق الكمية نفسها من البروتين الكلي المستمد من تلك المستخلصات في المحلول المنظم لعينات SDS، وسُخّنت إلى 95°C، ثم حُمّلت مباشرة على SDS-PAGE وحُلّلت باللطخ الغربي. (راجع Segref et al. 2020)

جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار UP200St للتحلل

جهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية UP200St مع الطرف الدقيق S26d2 للتحلل واستخلاص البروتينات

التحلل بالموجات فوق الصوتية مع التحكم الدقيق في درجة الحرارة

VialTweeter جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية لعينات متعددة يتيح تحضير العينات بموثوقية في ظروف تضبط فيها درجة الحرارة بدقة.يُعد التحكم الدقيق والموثوق في درجة الحرارة أمرًا بالغ الأهمية عند التعامل مع العينات البيولوجية. تبدأ درجات الحرارة المرتفعة تدهور البروتينات الناجم عن الحرارة في العينات.
كما هو الحال في جميع تقنيات تحضير العينات الميكانيكية، تُولّد المعالجة بالموجات فوق الصوتية حرارة. ومع ذلك، يمكن التحكم جيدًا في درجة حرارة العينات عند استخدام VialTweeter. نقدم لك خيارات متنوعة لمراقبة درجة حرارة عيناتك والتحكم فيها أثناء تحضيرها للتحليل باستخدام VialTweeter وVialPress.

  1. مراقبة درجة حرارة العينة: معالج الموجات فوق الصوتية UP200St، الذي يشغّل VialTweeter، مزود ببرنامج ذكي ومستشعر درجة حرارة قابل للتوصيل. صِل مستشعر درجة الحرارة بجهاز UP200St، وأدخل طرف المستشعر في أحد أنابيب العينات. عبر شاشة اللمس الرقمية الملونة، يمكنك ضبط نطاق محدد لدرجة الحرارة في قائمة UP200St لمعالجة عينتك بالموجات فوق الصوتية. يتوقف جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية تلقائيًا عند بلوغ درجة الحرارة القصوى، ويظل متوقفًا حتى تنخفض درجة حرارة العينة إلى القيمة الدنيا لفارق درجة الحرارة المحدد ∆. ثم تُستأنف المعالجة بالموجات فوق الصوتية تلقائيًا. تمنع هذه الميزة الذكية التدهور الناجم عن الحرارة.
  2. يمكن تبريد كتلة VialTweeter مسبقًا. ضع كتلة VialTweeter (السونوترود فقط دون المحوّل!) في الثلاجة أو المجمد؛ فالتبريد المسبق لكتلة التيتانيوم يساعد على تأخير ارتفاع درجة حرارة العينة. ويمكن أيضًا تبريد العينة نفسها مسبقًا، إن أمكن.
  3. استخدم الثلج الجاف للتبريد أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية. استخدم صينية ضحلة مملوءة بالثلج الجاف وضع VialTweeter على الثلج الجاف لتبديد الحرارة بسرعة.

اعثر على جهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية الأمثل لتطبيق التحلل لديك

تتمتع Hielscher Ultrasonics بخبرة طويلة في تصنيع أجهزة تفكيك الخلايا والمجانسات عالية الأداء بالموجات فوق الصوتية للمختبرات والأنظمة المكتبية والأنظمة على النطاق الصناعي. يُعد حجم مزرعة الخلايا البكتيرية لديك، وهدف البحث أو الإنتاج، وحجم الخلايا المطلوب معالجتها في الساعة أو اليوم، عوامل أساسية لاختيار جهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية المناسب لتطبيقك.
تقدم Hielscher Ultrasonics حلولًا متنوعة للمعالجة المتزامنة لعينات متعددة بالموجات فوق الصوتية (حتى 10 قوارير)، وكذلك لأعداد كبيرة من العينات (أي أطباق المعايرة الدقيقة / الأطباق ذات 96 بئرًا)، بدءًا من جهاز المعالجة المختبري التقليدي بالموجات فوق الصوتية من نوع المسبار، بمستويات قدرة مختلفة من 50 إلى 400 واط، وصولًا إلى معالجات الموجات فوق الصوتية الصناعية بالكامل بقدرة تصل إلى 16,000واط لكل وحدة، لتفكيك الخلايا واستخلاص البروتينات تجاريًا في الإنتاج واسع النطاق. صُمّمت جميع أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher للتشغيل 24/7/365 تحت الحمل الكامل. تُعد المتانة والموثوقية من السمات الأساسية لأجهزتنا للموجات فوق الصوتية.
جميع المجانسات الرقمية بالموجات فوق الصوتية مزودة ببرنامج ذكي وشاشة لمس ملونة وتسجيل تلقائي للبيانات، مما يجعل جهاز الموجات فوق الصوتية أداة عمل مريحة في المختبر ومنشآت الإنتاج.
أخبرنا بنوع الخلايا وحجمها وتواتر المعالجة والهدف الذي تحتاج من أجله إلى معالجة عيناتك البيولوجية. سنوصي لك بجهاز تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية الأنسب لمتطلبات عمليتك.

يقدم الجدول أدناه مؤشرًا على سعة المعالجة التقريبية لأنظمتنا للموجات فوق الصوتية، بدءًا من المجانسات المدمجة المحمولة باليد وأجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية لعينات متعددة، وصولًا إلى معالجات الموجات فوق الصوتية الصناعية للتطبيقات التجارية:

حجم الدفعة معدل التدفق الأجهزة الموصى بها
أطباق ذات 96 بئرًا / أطباق المعايرة الدقيقة n.a. UIP400MTP
10 قوارير، سعة كل منها من 0.5 إلى 1.5mL n.a. VialTweeter مع UP200St
من 0.01 إلى 250mL من 5 إلى 100mL/min UP50H
من 0.01 إلى 500mL من 10 إلى 200mL/min UP100H
من 10 إلى 2000mL من 20 إلى 400mL/min UP200Ht, UP400St
من 0.1 إلى 20L من 0.2 إلى 4L/min UIP2000hdT
من 10 إلى 100L من 2 إلى 10L/min UIP4000hdT
n.a. من 10 إلى 100L/min UIP16000
n.a. أكبر مجموعة من UIP16000

اتصل بنا! / اسألنا!

اطلب مزيدًا من المعلومات

يرجى استخدام النموذج أدناه لطلب معلومات إضافية حول أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية والتطبيقات والسعر. يسعدنا مناقشة عمليتكم معكم وتقديم نظام بالموجات فوق الصوتية يلبي متطلباتكم!





تُستخدم المجانسات بالموجات فوق الصوتية ذات القص العالي في المعالجة المختبرية والمكتبية والتجريبية والصناعية.

تصنّع Hielscher Ultrasonics مجانسات عالية الأداء بالموجات فوق الصوتية لتطبيقات الخلط والتشتيت والاستحلاب والاستخلاص على النطاق المختبري والتجريبي والصناعي.

المؤلفات / المراجع



حقائق جديرة بالمعرفة

Caenorhabditis elegans

C. elegans دودة خيطية شفافة حرة المعيشة (دودة أسطوانية)، يبلغ طولها نحو 1 mm، وتتغذى على البكتيريا (مثل E. coli)، ولها دورة حياة قصيرة نسبيًا. عند 20 °C، يبلغ متوسط مدة حياة السلالة المختبرية من C. elegans‏ (N2) نحو 2–3 أسابيع، ويبلغ زمن الجيل من 3 إلى 4 أيام. عند استزراع C. elegans بأعداد كبيرة، وهو ما يمكن إجراؤه بسهولة تحت ظروف مختبرية مضبوطة بدقة، يمكن استخدامها بسهولة في الفحص لدراسة آلية عمل الأدوية الجديدة، وكذلك تأثيراتها وتفاعلاتها ضمن العمليات الجزيئية المعقدة في الأمراض البشرية. يجعل الجينوم القصير ودورة الحياة القصيرة وسهولة التعامل معها في البيئات المختبرية C. elegans كائنًا نموذجيًا مثاليًا لأبحاث مثل علم الجينوم وعلم البروتيوم وعلم الأحياء النمائي وأبحاث الأمراض وتطوير الأدوية وغيرها.
يمكن أن تكون ديدان Caenorhabditis elegans ذكورًا أو خناثى. تمتلك الخناثى أعضاء تناسلية ذكرية وأنثوية معًا. ومع ذلك، لا توجد ديدان أنثوية. يمكن للخناثى الإخصاب ذاتيًا أو التزاوج أيضًا مع الديدان الذكرية. ويمكن لـ C. elegans إنتاج أكثر من 1,000 بيضة كل يوم.
نظرًا إلى أن C. elegans من أبسط الكائنات التي تمتلك جهازًا عصبيًا، تُستخدم هذه الدودة الخيطية منذ 1963 ككائن نموذجي للبحث. لا تُطلِق العصبونات جهود فعل، ولا تُعبّر عن أي قنوات صوديوم مبوبة بالجهد. في الخنثى، يتألف هذا الجهاز من 302 عصبون، وقد رُسمت خريطة نمط اتصالاتها بالكامل فيما يُعرف بخريطة الاتصالات العصبية.
للعديد من الجينات في جينوم C. elegans نظائر وظيفية لدى البشر، مما يجعلها نموذجًا مفيدًا للغاية للأمراض البشرية، وتُستخدم، على سبيل المثال، لدراسة علم الأحياء النمائي والشيخوخة والعوامل المؤثرة في طول العمر. علاوة على ذلك، توفر طافرات C. elegans نماذج للعديد من الأمراض البشرية، بما فيها الاضطرابات العصبية (مثل ألزهايمر) وأمراض القلب الخلقية وأمراض الكلى.
جعلت هذه العوامل C. elegans نموذجًا بالغ القيمة للعديد من مجالات البحث. ونتيجة لذلك، كانت C. elegans أول كائن متعدد الخلايا يُحدَّد تسلسل جينومه كاملًا. يحتوي الجينوم على ما يُقدّر بنحو 20,470 جينًا مشفّرًا للبروتين. ولحوالي 35% من جينات C. elegans جينات متماثلة لدى البشر. ومن اللافت أن الجينات البشرية ثبت مرارًا أنها تحل محل نظائرها في C. elegans عند إدخالها في C. elegans. وبالمقابل، يمكن للعديد من جينات C. elegans أن تؤدي وظائف مماثلة لجينات الثدييات.

تبلغ مدة حياة C. elegans نحو 3 أسابيع، وتتألف من ست مراحل حياتية: التكوين الجنيني (مرحلة البيضة)، وأربع مراحل يرقية (L1 إلى L4)، ومرحلة البلوغ. تفقس الديدان الخيطية من البيض كيرقات L1 تتألف من 560 خلية. يحدث النمو خلال كل مرحلة يرقية عن طريق انقسام الخلايا وتضخمها. ويتخلل كل مرحلة يرقية انسلاخ الجليدة. إذا أشارت الظروف البيئية القاسية إلى الدودة النامية إلى أن الظروف لا يُرجح أن تدعم خصوبة الديدان البالغة، يمكن لـ C. elegans تعديل نموها وتكوين مرحلة يرقية بديلة من L3، تدخل فيها اليرقات طور dauer. في هذه الحالة، تكون الحيوانات شديدة التحمل للإجهاد وطويلة العمر على نحو استثنائي، ويمكن أن تبقى حية من ثلاثة إلى تسعة أشهر. تعزل يرقات dauer نفسها عن الظروف القاسية بإغلاق تجويفيها الفموي والشرجي، وتقليص أمعائها، وتفعيل برنامج جيني يعتمد على daf-16/FOXO، يؤدي، من بين أمور أخرى، إلى التعبير عن جليدة خاصة بطور dauer. (راجع Henderson et al., 2006)

يرقات dauer لدى C. elegans

يرقات dauer مصطلح يشير إلى يرقات الديدان الخيطية التي دخلت مرحلة نمائية بديلة. ويُستخدم مصطلح «يرقات dauer» خصوصًا لديدان فصيلة الرابديتيدات، بما فيها Caenorhabditis elegans. كلمة «Dauer» ألمانية الأصل وتعني «المدة» بمعنى «فترة من الزمن». تدخل يرقات dauer نوعًا من السكون ويمكنها البقاء حية في ظروف قاسية. ويتوقف دخول اليرقة طور dauer وتوقيت ذلك على الظروف البيئية. تُدرس يرقات dauer على نطاق واسع في علم الأحياء، لأنها تُظهر قدرة استثنائية على البقاء في بيئات قاسية والعيش لفترات طويلة. فعلى سبيل المثال، يمكن ليرقات dauer لدى C. elegans البقاء حية لمدة تصل إلى أربعة أشهر، وهي أطول بكثير من متوسط مدة حياتها البالغ نحو ثلاثة أسابيع أثناء النمو التكاثري الطبيعي.

نظرة عامة على دورة حياة C. elegans

نمو C. elegans في البيئات الملائمة:
تُظهر Caenorhabditis elegans‏ (C. elegans) مسارات نمو مختلفة في الظروف البيئية الملائمة وغير الملائمة.
استجابة C. elegans للظروف الملائمة:
في الظروف الملائمة، تتبع الدودة الأسطوانية المجهرية Caenorhabditis elegans‏ (C. elegans) مسارًا نمائيًا محددًا بوضوح. وعادةً ما تمر الدودة الخيطية بدورة حياتها بسرعة كبيرة عندما تكون الظروف البيئية مثالية، وعادةً عند درجات حرارة بين 15°C و20°C.

  1. النمو التكاثري: تبدأ C. elegans دورة حياتها كجنين. ثم تمر بأربع مراحل يرقية متميزة، يُشار إليها اختصارًا بـ L1 إلى L4.
  2. مرحلة البلوغ: بعد إتمام المراحل اليرقية الأربع، تصل C. elegans إلى مرحلة البلوغ خلال 3 إلى 5 أيام فقط. وفي هذه المرحلة، تكون قادرة على التكاثر وتستمر في العيش لمدة 2 إلى 3 أسابيع أخرى، تبعًا للعوامل البيئية.

 
استجابة C. elegans للظروف غير الملائمة:

ومع ذلك، تُعد C. elegans كائنًا قادرًا على التحمل، ويمكنها التكيف مع الظروف غير الملائمة من خلال عملية تُسمى تكوّن طور dauer.

  1. تكوّن طور dauer: عندما تصبح الظروف البيئية غير ملائمة، مثل الاكتظاظ أو محدودية الإمداد الغذائي أو ارتفاع درجات الحرارة، يمكن لـ C. elegans دخول مرحلة يرقية ثالثة استثنائية تُسمى «dauer»، ويُشار إليها اختصارًا بـ L3d.
  2. البقاء في طور dauer: تتكيف يرقات dauer تكيفًا خاصًا للبقاء في الظروف القاسية. ويمكنها العيش لعدة أشهر في هذه المرحلة، مع الحفاظ على الطاقة وتحمل البيئات الصعبة.

 

التعافي في البيئات الملائمة:
الجانب اللافت في C. elegans هو قدرتها على العودة إلى دورة حياة طبيعية عندما تتحسن الظروف.

  1. العودة إلى الظروف الملائمة: عندما تواجه يرقات dauer لدى C. elegans ظروفًا ملائمة مرة أخرى، مثل وفرة الغذاء وانخفاض الكثافة السكانية ودرجات الحرارة المناسبة، فإنها تستشعر التغير في البيئة.
  2. التعافي والتكاثر: استجابةً لهذه الظروف المحسّنة، تخضع يرقات dauer لعملية تُسمى «التعافي». أثناء التعافي، تعود إلى المراحل اليرقية وتصبح في النهاية ديدانًا بالغة قادرة على التكاثر وبمدة حياة طبيعية.

تُعد هذه القدرة على الانتقال بين المراحل النمائية استجابةً للظروف البيئية جانبًا مميزًا من بيولوجيا C. elegans. فهي تتيح لها البقاء والتكاثر بفعالية في نطاق واسع من الظروف، مما يجعلها كائنًا نموذجيًا قيّمًا للبحث العلمي، ولا سيما في دراسة النمو وعلم الوراثة والشيخوخة.

يسعدنا مناقشة عمليتك.

✕