التحلل بالموجات فوق الصوتية لإجراء اللطخ الغربي

• اللطخ الغربي إجراء تحليلي للكشف عن بروتينات محددة في عينة من مجانس نسيجي أو مستخلص خلوي.
• لإجراء اللطخ الغربي أو قياس نشاط الإنزيمات، تتطلب العديد من الاختبارات الوصول إلى المواد المحتجزة داخل الخلية (مثل البروتينات وDNA والأجزاء تحت الخلوية).
• المعالجة بالموجات فوق الصوتية طريقة موثوقة وسهلة الاستخدام لتفكيك الخلايا وتحليلها على نحو مضبوط.

تفكيك الخلايا بالموجات فوق الصوتية

استخلاص البروتينات من الأنسجة والخلايا المستزرعة هو الخطوة الأولى في العديد من التقنيات البيولوجية والكيميائية الحيوية والتحليلية (PAGE واللطخ الغربي وELISA ومطيافية الكتلة وغيرها) أو في تنقية البروتينات. وللحصول على مردود مرتفع من البروتينات، يجب تفكيك/ تحليل المادة الخلوية والأنسجة بكفاءة. سواء أكانت العينة خلايا نباتية أم أنسجة حيوانية، فإن المعالجة بالموجات فوق الصوتية هي الطريقة التي تتيح تحضير محلول التحلل الخلوي بسهولة وسرعة.

مزايا المعالجة بالموجات فوق الصوتية

• سريعة وفعالة
• سهولة التشغيل
• مردود مرتفع من البروتينات
• قابلة لإعادة الإنتاج/ التكرار
• قابلة للتحكم الدقيق
• قابلة لتوسيع النطاق

بروتوكول الترسيب المناعي لإجراء اللطخ المناعي الغربي

A. الكواشف

لتحضير المحاليل، استخدم ماءً منقى مثل Milli-Q.

• محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) بتركيز 1X
• محلول منظم لتحلل الخلايا بتركيز 1X: ‏20 mM Tris ‏(pH 7.5)، ‏150 mM NaCl، ‏1 mM EDTA، ‏1 mM EGTA، ‏1% Triton X-100، ‏2.5 mM بيروفوسفات الصوديوم، ‏1 mM β-غليسيروفوسفات، ‏1 mM Na3VO4، ‏1 μg/ml ليوبيبتين
  مهم: أضف 1 mM PMSF مباشرة قبل الاستخدام.
• تكفي كمية 15 μl من البروتين A+15 μl من البروتين G لإجراء الترسيب المناعي (IP)، لكن ذلك قد يعتمد على الجسم المضاد الأولي وحجم العينة. يمكنك أيضًا استخدام أغاروز البروتين A/ G المخلوط مسبقًا (مثل البروتين A للاستخلاص بالارتباط لـIgG الأرنب والبروتين G للاستخلاص بالارتباط لـIgG الفأر)
• محلول منظم للعينات يحتوي على SDS بتركيز 3X: ‏187.5 mM Tris-HCl ‏(pH 6.8 عند 25°C)، ‏6% w/v SDS، ‏30% غليسرول، ‏150 mM DTT، ‏0.03% w/v أزرق البروموفينول

B. تحضير محاليل التحلل الخلوي

• اجمع الخلايا. لجمع الخلايا في ظروف لا تسبب تمسخها، أزل الأوساط واشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS بارد كالثلج.
• أزل PBS وأضف 0.5 ml من المحلول المنظم لتحلل الخلايا بتركيز 1X والبارد كالثلج إلى كل طبق (10 cm)، ثم احضن الأطباق على الثلج لمدة 5 دقائق.
• اكشط الخلايا من الأطباق وانقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق. أبقها على الثلج.
• عالج بالموجات فوق الصوتية مرتين لمدة 10 ثوانٍ في محلول منظم للترسيب المناعي بارد كالثلج (المحلول المنظم IP: ‏50 mM Tris-HCl [pH 7.4]، ‏150 mM NaCl، ‏5 mM EDTA، ‏0.1% NP-40 ومزيج مثبطات البروتياز). وللمعالجة بالموجات فوق الصوتية، يُعد VialTweeter أو جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية مزود بمسبار، مثل UP100H أو UP200Ht من أنسب الخيارات.
• أجرِ الطرد المركزي لمحاليل التحلل عند 15,000 g لمدة 10 دقائق عند 4°C.
• انقل السائل الفوقاني إلى أنبوب جديد. (يمكن تخزين محلول التحلل عند –80°C إذا لزم الأمر.)
• أضف الجسم المضاد الأولي إلى السائل الفوقاني. يُحضن السائل الفوقاني مع الجسم المضاد الأولي لمدة 1 h عند 4°C مع تحريك خفيف. يُضاف الجسم المضاد الأولي عادةً بتركيز أعلى بمقدار 10x من التركيز المستخدم في اللطخ الغربي. (يمكنك البدء بكمية 1μg لكل 100μL.)
• يُحضن السائل الفوقاني بعد ذلك مع مزيج من كميات متساوية من أغاروز البروتين A ‏(Invitrogen) وأغاروز البروتين G لمدة 1 h إضافية.
• اغسل رواسب الأغاروز ثلاث مرات بالمحلول المنظم IP. بعد ذلك، استخلص البروتينات المرتبطة باستخدام محلول التحميل المنظم لـSDS-PAGE بالتسخين عند 95°C لمدة 5 دقائق.

C. الترسيب المناعي

• خذ 200 μl من محلول التحلل الخلوي وأضف الجسم المضاد الأولي. احضن مع التأرجح اللطيف طوال الليل عند 4°C.
• أضف خرز أغاروز البروتين A أو G ‏(20 μl من معلق الخرز بتركيز 50%). احضن مع التأرجح اللطيف لمدة 1–3 ساعات عند 4°C.
• أجرِ الطرد المركزي الدقيق لمدة 30 ثانية عند 4°C. اغسل الراسب خمس مرات باستخدام 500 µl من المحلول المنظم لتحلل الخلايا بتركيز 1X. أبقه على الثلج أثناء الغسل.
• أعد تعليق الراسب باستخدام 20 μl من المحلول المنظم للعينات المحتوي على SDS بتركيز 3X. امزج بالخلاط الدوامي، ثم أجرِ الطرد المركزي الدقيق لمدة 30 ثانية.
• سخّن العينة إلى 95–100°C لمدة 2–5 دقائق، ثم أجرِ الطرد المركزي الدقيق لمدة 1 دقيقة عند 14,000 X g.
• حمّل العينة (15–30 μl) على هلام SDS-PAGE ‏(12–15%).
• حلّل العينة باستخدام اللطخ الغربي.

تحليل اللطخ الغربي باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UP50H

استُخدم البروتوكول التالي، الذي يعتمد على جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية المزود بمسبار UP50H، في دراسة Kriebisch وآخرين (2011):
عُزل البروتين الكلي من خلايا MC3T3-E1 المعالجة بـ1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) أو بالمادة الحاملة. حُللت الخلايا باستخدام محلول منظم يحتوي على 50 mM Tris HCl، ‏pH 8 ‏(Sigma-Aldrich)؛ ‏150 mM NaCl ‏(Fisher Scientific)؛ ‏0.1% دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) ‏(Fisher Scientific)؛ ‏1% IGEPAL CA-630 ‏(Sigma-Aldrich) و0.5% ديوكسيكولات الصوديوم (Merck). عولج محلول التحلل الخلوي بالموجات فوق الصوتية لمدة 2 × 10 s عند إعداد الدورة 1 والسعة 80 باستخدام المعالج بالموجات فوق الصوتية UP50H (Hielscher، تكنولوجيا الموجات فوق الصوتية، تلتو، ألمانيا). بعد ذلك، أُجري الطرد المركزي للمادة لمدة 10 min عند 14,000 rpm، واستُخدم السائل الفوقاني في اللطخ الغربي. غُليت كمية مقدارها خمسة وعشرون μg من البروتين في محلول منظم للعينات وعامل مختزل (Invitrogen)، ثم فُصلت بواسطة SDS-PAGE باستخدام هلام بولي أكريلاميد بتركيز 4–12% ‏(Invitrogen)، ونُقلت إلى غشاء نيتروسليلوز (GE health care). حُجبت مواقع الارتباط غير النوعية على الغشاء لمدة 1 h باستخدام TBS ‏(10 mM Tris-HCl؛ ‏pH 7.6؛ ‏150 mM NaCl) يحتوي على 1% كازين (Sigma-Aldrich) و1% Tris ‏(1 M). بعد الحجب، حُضن الغشاء مع تحريك خفيف طوال الليل عند 4°C مع الجسم المضاد الأولي (جسم مضاد لـCBS البشري منتج في الأرنب، بتخفيف 1/500، طُوّر في مختبر الأستاذ R. Banerjee، آن آربر، MI، الولايات المتحدة الأمريكية). أُجري التحضين مع جسم مضاد ثانوي مقترن ببيروكسيداز الفجل الحار (HPR) ‏(Dako) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. أُظهرت جميع اللطخات باستخدام التلألؤ الكيميائي المعزز (Perkin Elmer).
 

انقر هنا لقراءة المزيد عن أفضل الممارسات لتحلل الخلايا واستخلاص محتوياتها بالموجات فوق الصوتية، وتحضير محاليل التحلل، والتوصيات لتحسين العملية!
 
يعطيك الجدول أدناه مؤشرًا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزتنا المختبرية للمعالجة بالموجات فوق الصوتية:

المؤلفات / المراجع

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.