تحلل بالموجات فوق الصوتية للنشاف الغربي
- اللطخة الغربية هي إجراء تحليلي للكشف عن بروتينات معينة في عينة من تجانس الأنسجة أو مستخلص الخلية.
- لتشغيل لطخة غربية أو لقياس نشاط الإنزيم ، تتطلب العديد من المقايسات الوصول إلى المواد (مثل البروتينات والحمض النووي والشظايا تحت الخلوية) المحاصرة في الخلية.
- Sonication هي طريقة موثوقة وسهلة التعامل مع اضطراب الخلايا وتحللها المتحكم فيه.
تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية
يعد استخراج البروتين من الأنسجة والخلايا المستزرعة الخطوة الأولى للعديد من التقنيات البيولوجية والكيميائية الحيوية والتحليلية (PAGE ، النشاف الغربي ، ELISA ، قياس الطيف الكتلي ، إلخ) أو تنقية البروتين. للحصول على غلة عالية من البروتين ، يجب تعطيل / تحلل مادة الخلية والأنسجة بكفاءة. سواء كانت خلية نباتية أو أنسجة حيوانية ، فإن صوتنة هي الطريقة لإعداد تحلل الخلايا الخاصة بك بسهولة وسرعة.
مزايا سونيكيشن
- صوم & كفاءه
- عملية سهلة
- غلة عالية من البروتين
- قابلة للتكرار / قابلة للتكرار
- يتم التحكم فيه بدقة
- قابله

فيال تويتر سونيكاتور لإعداد العينات بالموجات فوق الصوتية مثل اضطراب الخلايا وعزل البروتين
بروتوكول الترسيب المناعي للنشاف المناعي الغربي
ألف - الكواشف
لإعداد المحاليل ، استخدم المياه النقية مثل Milli-Q.
- 1X محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)
- 1X خلية تحلل العازلة: 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5) ، 150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 1 مللي متر EDTA ، 1 مللي متر EGTA ، 1٪ Triton X-100 ، 2.5 مللي متر بيروفوسفات الصوديوم ، 1 مللي متر β-جليسيروفوسفات ، 1 مللي مول Na3VO4 ، 1 ميكروغرام / مل ليوببتين
هام: أضف 1 مللي مول PMSF مباشرة قبل الاستخدام. - 15 ميكرولتر بروتين أ + 15 ميكرولتر البروتين G كاف ل IP ، لكنه قد يعتمد على الجسم المضاد الأساسي وحجم العينة. يمكنك أيضا استخدام بروتين A / G المخلوط مسبقا (على سبيل المثال البروتين A للأرنب IgG المنسدلة لأسفل والبروتين G للفأر IgG المنسدل لأسفل)
- 3X SDS عينة عازلة: 187.5 مللي متر Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8 عند 25 درجة مئوية) ، 6٪ وزن / في SDS ، 30٪ جلسرين ، 150 مللي متر DTT ، 0.03٪ وزن / وزن أزرق بروموفينول
ب. تحضير محللات الخلية
- حصاد الخلايا. لحصاد الخلايا في ظل ظروف غير طبيعية ، قم بإزالة الوسائط وشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني بارد مثلج.
- قم بإزالة PBS وأضف 0.5 مل من محلول تحلل الخلايا المثلج 1X إلى كل لوحة (10 سم) واحتضان الألواح على الثلج لمدة 5 دقائق.
- كشط الخلايا من الألواح ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. ابق على الجليد.
- Sonicate مرتين لمدة 10 ثوان في المخزن المؤقت للترسيب المناعي البارد (المخزن المؤقت IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4] ، 150 mM NaCl ، 5 mM EDTA ، 0.1٪ NP-40 ومزيج مثبطات الأنزيم البروتيني). للصوتنة ، فإن VialTweeter أو مسبار بالموجات فوق الصوتية مثل UP100H أو UP200Ht هي الأنسب.
- أجهزة الطرد المركزي المحللة عند 15000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نقل طاف إلى أنبوب جديد. (إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين المحللة في -80 درجة مئوية.)
- أضف الجسم المضاد الأساسي إلى المادة الطافية. يتم تحضين المادة الطافية مع الجسم المضاد الأساسي لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية تحت التحريك الخفيف. عادة ما يضاف الجسم المضاد الأساسي بكمية أكثر تركيزا بمقدار 10 أضعاف مما هو مستخدم في النشاف الغربي. (يمكنك البدء ب 1 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر.)
- ثم يتم تحضين المادة الطافية بشكل أكبر بمزيج من كميات متساوية من بروتين أغاروز (Invitrogen) وبروتين G agarose لمدة 1 ساعة أخرى.
- اغسل كريات الأغاروز ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت IP. بعد ذلك ، استخرج البروتينات المرتبطة باستخدام مخزن التحميل SDS-PAGE عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
جيم - الترسيب المناعي
- خذ 200 ميكرولتر خلية محللة وأضف الجسم المضاد الأساسي. احتضان مع هزاز لطيف طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- أضف إما حبات أغاروز البروتين A أو G (20 ميكرولتر من ملاط الخرز بنسبة 50٪). احتضان مع هزاز لطيف لمدة 1-3 ساعات عند 4 درجات مئوية.
- جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. اغسل الحبيبات خمس مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا 1X. الحفاظ على الجليد أثناء الغسيل.
- أعد تعليق الحبيبات بمخزن مؤقت لعينة 20 ميكرولتر 3X SDS. دوامة ، ثم أجهزة الطرد المركزي الدقيقة لمدة 30 ثانية.
- سخني العينة إلى 95-100 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة لمدة دقيقة واحدة عند 14000 × جم.
- قم بتحميل العينة (15-30 ميكرولتر) على جل SDS-PAGE (12-15٪).
- تحليل العينة عن طريق النشاف الغربي.
تحليل اللطخة الغربية مع سونياتور UP50H
تم استخدام البروتوكول التالي باستخدام جهاز صوتي من نوع المسبار UP50H في دراسة Kriebisch et al. (2011):
تم عزل البروتين الكلي من خلايا MC3T3-E1 المعالجة ب 1،25 (OH)2D3 (10−8 م) أو مركبة. تم تحليل الخلايا بمخزن مؤقت يحتوي على 50 mM Tris HCl ، درجة الحموضة 8 (Sigma-Aldrich) ؛ 150 mM كلوريد الصوديوم (فيشر العلمية) ؛ 0.1 ٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) (فيشر العلمية) ؛ 1٪ IGEPAL CA-630 (سيغما ألدريتش) و 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم (ميرك). تم صوتنة محللة الخلية لمدة 2 × 10 ثوان في الدورة 1 والسعة 80 مع معالج UP50H بالموجات فوق الصوتية (Hielscher ، تكنولوجيا الموجات فوق الصوتية ، Teltow ، ألمانيا). بعد ذلك تم طرد المادة بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 14000 دورة في الدقيقة وتم استخدام المادة الطافية في النشاف الغربي. تم غلي خمسة وعشرين ميكروغرام من البروتين في عينة عازلة وعامل اختزال (Invitrogen) ثم فصلها بواسطة SDS-PAGE باستخدام 4-12٪ من المواد الهلامية بولي أكريلاميد (Invitrogen) ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز (GE Health Care). تم حظر الغشاء لمدة ساعة واحدة مع TBS (10 mM Tris-HCl ؛ درجة الحموضة 7.6 ؛ 150 mM NaCl) التي تحتوي على 1٪ كازين (Sigma-Aldrich) و 1٪ Tris (1 M). بعد الحجب ، تم تحضين الغشاء بإثارة طفيفة طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الجسم المضاد الأساسي (أرنب مضاد للإنسان CBS 1/500 ، تم تطويره في مختبر البروفيسور R. Banerjee ، آن أربور ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء الحضانة باستخدام الجسم المضاد الثانوي المترافق للفجل (HPR) (Dako) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم تطوير جميع البقع عن طريق التلألؤ الكيميائي المحسن (Perkin Elmer).
انقر هنا لقراءة المزيد حول أفضل الممارسات لتحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها ، وإعداد المحللة والتوصيات لتحسين العملية!
يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزة الموجات فوق الصوتية بحجم المختبر:
الأجهزة الموصى بها | حجم الدفعة | معدل التدفق |
---|---|---|
UIP400MTP 96-Well لوحة سونيكاتور | لوحات متعددة الآبار / microtiter | ن.أ. |
كوب بالموجات فوق الصوتيةهورن | CupHorn للقوارير أو الدورق | ن.أ. |
جي دي ميني2 | مفاعل التدفق الجزئي بالموجات فوق الصوتية | ن.أ. |
VialTweeter | 0.5 إلى 1.5 مل | ن.أ. |
UP100H | 1 إلى 500 مل | 10 إلى 200 مل / دقيقة |
UP200Ht, UP200St | 10 إلى 1000 مل | 20 إلى 200 مل / دقيقة |
UP400St | 10 إلى 2000 مل | 20 إلى 400 مل / دقيقة |
المنخل بالموجات فوق الصوتية شاكر | ن.أ. | ن.أ. |
اتصل بنا! / اسألنا!

UIP400MTP لوحة صوتي لصوتنة عالية الإنتاجية من لوحات 96 بئر
حول النشاف الغربي
البقع هي إجراءات تحليلية حيث يتم نقل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات إلى حامل بحيث يمكن فصلها.
تستخدم اللطخة الجنوبية للكشف عن الحمض النووي ، واللطخة الشمالية للحمض النووي الريبي واللطخة الغربية للبروتينات.
يطلق على النشاف الغربي أيضا النشاف المناعي للبروتين لأنه يستخدم الجسم المضاد للكشف عن مولد الضد الخاص به على وجه التحديد. النشاف الغربي هو واحد من أهم طرق التحليل للكشف عن بروتينات معينة في العينة. في اللطخة الغربية ، يتم تجميد البروتينات على الأغشية لاكتشافها باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو متعددة النسيلة.
بواسطة SDS-polyacrylamide هلام الكهربائي (SDS-PAGE) يتم فصل البروتينات الأصلية عن طريق هيكل 3-D أو البروتينات المشوهة بطول الببتيد. ثم يتم نقل البروتينات إلى غشاء (عادة النيتروسليلوز أو PVDF) ، حيث يتم تلطيخها بأجسام مضادة خاصة بالبروتين المستهدف. يتم تضمين خطوة الرحلان الكهربائي للهلام في تحليل اللطخة الغربية لحل مشكلة التفاعل المتبادل للأجسام المضادة.
بعد ذلك ، يتم مسح البروتينات المنفصلة على مصفوفة (معظمها على غشاء نيتروسليلوز أو PVDF) ، حيث يتم تلطيخها بالأجسام المضادة. تعمل الأجسام المضادة كمسبار ويتم اختيارها خصيصا للبروتين المستهدف. يكشف تحليل موقع التفاعل المحدد وشدته عن تفاصيل التعبير عن البروتينات المستهدفة في العينة المعطاة. يمكن أن يكتشف النشاف الغربي البروتين المستهدف الذي يصل إلى 1 نانوغرام بسبب الدقة العالية للهلام الكهربائي والنوعية القوية والحساسية العالية للمقايسة المناعية. تستخدم طريقة اللطخة الغربية في البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية وعلم الوراثة المناعية ومجالات البحث الجزيئي الأخرى.
تشمل التقنيات الأخرى ذات الصلة تحليل اللطخة النقطية والكيمياء الهيستولوجية المناعية والكيمياء المناعية حيث تستخدم الأجسام المضادة للكشف عن البروتينات في الأنسجة والخلايا عن طريق التلوين المناعي ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
الأدب / المراجع
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

فيال تويتر سونيكاتور لإعداد عينة متزامنة من قوارير متعددة