تحلل بالموجات فوق الصوتية للنشاف الغربي

• اللطخة الغربية هي إجراء تحليلي للكشف عن بروتينات معينة في عينة من تجانس الأنسجة أو مستخلص الخلية.
• لتشغيل لطخة غربية أو لقياس نشاط الإنزيم ، تتطلب العديد من المقايسات الوصول إلى المواد (مثل البروتينات والحمض النووي والشظايا تحت الخلوية) المحاصرة في الخلية.
• Sonication هي طريقة موثوقة وسهلة التعامل مع اضطراب الخلايا وتحللها المتحكم فيه.

تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية

يعد استخراج البروتين من الأنسجة والخلايا المستزرعة الخطوة الأولى للعديد من التقنيات البيولوجية والكيميائية الحيوية والتحليلية (PAGE ، النشاف الغربي ، ELISA ، قياس الطيف الكتلي ، إلخ) أو تنقية البروتين. للحصول على غلة عالية من البروتين ، يجب تعطيل / تحلل مادة الخلية والأنسجة بكفاءة. سواء كانت خلية نباتية أو أنسجة حيوانية ، فإن صوتنة هي الطريقة لإعداد تحلل الخلايا الخاصة بك بسهولة وسرعة.

مزايا سونيكيشن

• صوم & كفاءه
• عملية سهلة
• غلة عالية من البروتين
• قابلة للتكرار / قابلة للتكرار
• يتم التحكم فيه بدقة
• قابله

بروتوكول الترسيب المناعي للنشاف المناعي الغربي

ألف - الكواشف

لإعداد المحاليل ، استخدم المياه النقية مثل Milli-Q.

• 1X محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)
• 1X خلية تحلل العازلة: 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5) ، 150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 1 مللي متر EDTA ، 1 مللي متر EGTA ، 1٪ Triton X-100 ، 2.5 مللي متر بيروفوسفات الصوديوم ، 1 مللي متر β-جليسيروفوسفات ، 1 مللي مول Na3VO4 ، 1 ميكروغرام / مل ليوببتين
  هام: أضف 1 مللي مول PMSF مباشرة قبل الاستخدام.
• 15 ميكرولتر بروتين أ + 15 ميكرولتر البروتين G كاف ل IP ، لكنه قد يعتمد على الجسم المضاد الأساسي وحجم العينة. يمكنك أيضا استخدام بروتين A / G المخلوط مسبقا (على سبيل المثال البروتين A للأرنب IgG المنسدلة لأسفل والبروتين G للفأر IgG المنسدل لأسفل)
• 3X SDS عينة عازلة: 187.5 مللي متر Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8 عند 25 درجة مئوية) ، 6٪ وزن / في SDS ، 30٪ جلسرين ، 150 مللي متر DTT ، 0.03٪ وزن / وزن أزرق بروموفينول

ب. تحضير محللات الخلية

• حصاد الخلايا. لحصاد الخلايا في ظل ظروف غير طبيعية ، قم بإزالة الوسائط وشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني بارد مثلج.
• قم بإزالة PBS وأضف 0.5 مل من محلول تحلل الخلايا المثلج 1X إلى كل لوحة (10 سم) واحتضان الألواح على الثلج لمدة 5 دقائق.
• كشط الخلايا من الألواح ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. ابق على الجليد.
• Sonicate مرتين لمدة 10 ثوان في المخزن المؤقت للترسيب المناعي البارد (المخزن المؤقت IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4] ، 150 mM NaCl ، 5 mM EDTA ، 0.1٪ NP-40 ومزيج مثبطات الأنزيم البروتيني). للصوتنة ، فإن VialTweeter أو مسبار بالموجات فوق الصوتية مثل UP100H أو UP200Ht هي الأنسب.
• أجهزة الطرد المركزي المحللة عند 15000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
• نقل طاف إلى أنبوب جديد. (إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين المحللة في -80 درجة مئوية.)
• أضف الجسم المضاد الأساسي إلى المادة الطافية. يتم تحضين المادة الطافية مع الجسم المضاد الأساسي لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية تحت التحريك الخفيف. عادة ما يضاف الجسم المضاد الأساسي بكمية أكثر تركيزا بمقدار 10 أضعاف مما هو مستخدم في النشاف الغربي. (يمكنك البدء ب 1 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر.)
• ثم يتم تحضين المادة الطافية بشكل أكبر بمزيج من كميات متساوية من بروتين أغاروز (Invitrogen) وبروتين G agarose لمدة 1 ساعة أخرى.
• اغسل كريات الأغاروز ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت IP. بعد ذلك ، استخرج البروتينات المرتبطة باستخدام مخزن التحميل SDS-PAGE عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

جيم - الترسيب المناعي

• خذ 200 ميكرولتر خلية محللة وأضف الجسم المضاد الأساسي. احتضان مع هزاز لطيف طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
• أضف إما حبات أغاروز البروتين A أو G (20 ميكرولتر من ملاط الخرز بنسبة 50٪). احتضان مع هزاز لطيف لمدة 1-3 ساعات عند 4 درجات مئوية.
• جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. اغسل الحبيبات خمس مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا 1X. الحفاظ على الجليد أثناء الغسيل.
• أعد تعليق الحبيبات بمخزن مؤقت لعينة 20 ميكرولتر 3X SDS. دوامة ، ثم أجهزة الطرد المركزي الدقيقة لمدة 30 ثانية.
• سخني العينة إلى 95-100 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة لمدة دقيقة واحدة عند 14000 × جم.
• قم بتحميل العينة (15-30 ميكرولتر) على جل SDS-PAGE (12-15٪).
• تحليل العينة عن طريق النشاف الغربي.

تحليل اللطخة الغربية مع سونياتور UP50H

تم استخدام البروتوكول التالي باستخدام جهاز صوتي من نوع المسبار UP50H في دراسة Kriebisch et al. (2011):
تم عزل البروتين الكلي من خلايا MC3T3-E1 المعالجة ب 1،25 (OH)₂D₃ (10⁻⁸ م) أو مركبة. تم تحليل الخلايا بمخزن مؤقت يحتوي على 50 mM Tris HCl ، درجة الحموضة 8 (Sigma-Aldrich) ؛ 150 mM كلوريد الصوديوم (فيشر العلمية) ؛ 0.1 ٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) (فيشر العلمية) ؛ 1٪ IGEPAL CA-630 (سيغما ألدريتش) و 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم (ميرك). تم صوتنة محللة الخلية لمدة 2 × 10 ثوان في الدورة 1 والسعة 80 مع معالج UP50H بالموجات فوق الصوتية (Hielscher ، تكنولوجيا الموجات فوق الصوتية ، Teltow ، ألمانيا). بعد ذلك تم طرد المادة بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 14000 دورة في الدقيقة وتم استخدام المادة الطافية في النشاف الغربي. تم غلي خمسة وعشرين ميكروغرام من البروتين في عينة عازلة وعامل اختزال (Invitrogen) ثم فصلها بواسطة SDS-PAGE باستخدام 4-12٪ من المواد الهلامية بولي أكريلاميد (Invitrogen) ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز (GE Health Care). تم حظر الغشاء لمدة ساعة واحدة مع TBS (10 mM Tris-HCl ؛ درجة الحموضة 7.6 ؛ 150 mM NaCl) التي تحتوي على 1٪ كازين (Sigma-Aldrich) و 1٪ Tris (1 M). بعد الحجب ، تم تحضين الغشاء بإثارة طفيفة طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الجسم المضاد الأساسي (أرنب مضاد للإنسان CBS 1/500 ، تم تطويره في مختبر البروفيسور R. Banerjee ، آن أربور ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء الحضانة باستخدام الجسم المضاد الثانوي المترافق للفجل (HPR) (Dako) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم تطوير جميع البقع عن طريق التلألؤ الكيميائي المحسن (Perkin Elmer).
 

انقر هنا لقراءة المزيد حول أفضل الممارسات لتحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها ، وإعداد المحللة والتوصيات لتحسين العملية!
 
يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزة الموجات فوق الصوتية بحجم المختبر:

الأدب / المراجع