بالموجات فوق الصوتية تحلل لالغربية التنشيف

• وصمة عار الغربية هو الإجراء التحليلي للكشف عن بروتينات معينة في عينة من الأنسجة جناسة أو استخراج الخلايا.
• لتشغيل وصمة عار الغربية أو لقياس نشاط انزيم، وتتطلب العديد من فحوصات الحصول على المواد (مثل البروتينات والحمض النووي، وشظايا التحت خلوية) شرك في الخلية.
• صوتنة هو طريقة موثوق بها وسهلة للتعامل مع لتمزق خلية للرقابة وتحلل.

بالموجات فوق الصوتية تعطيل خلية

استخراج البروتين من الأنسجة والخلايا المستزرعة هي الخطوة الأولى للعديد من التقنيات البيولوجية والكيميائية الحيوية والتحليلية (PAGE، غرب النشاف، ELISA، مطياف الكتلة، الخ) أو تنقية البروتين. للحصول على العائد نسبة عالية من البروتين، والمواد الخلايا والأنسجة يجب أن عطلت بكفاءة / هي lysed. سواء الخلية النباتية أو الأنسجة الحيوانية، صوتنة هو طريقة لإعداد المحللة الخليوي الخاص بك سهلة وسريعة.

مزايا صوتنة

• بسرعة & فعالة
• عملية سهلة
• العائد نسبة عالية من البروتين
• استنساخه / تكرارها
• تسيطر على وجه التحديد
• القابلة للتطوير

بروتوكول مناعي لImmunoblotting الغربي

A. الكواشف

لإعداد الحلول، واستخدام الماء المنقى مثل ميلي-Q.

• 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
• 1X خلية الاحتياطي تحلل: 20 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 ملي EGTA، 1٪ تريتون X-100، 2.5 ملم الصوديوم بيروفوسفات، 1 ملم β-سكرولي، 1 ملم Na3VO4، 1 ميكروغرام / مل Leupeptin
  هام: إضافة 1 ملم PMSF مباشرة قبل الاستعمال.
• 15 ميكرولتر البروتين A + 15 ميكرولتر بروتين G كافية لIP، ولكن قد تعتمد على والأجسام المضادة وعينة حجم الابتدائي. يمكنك أيضا استخدام ما قبل مختلطة بروتين A / G الاغاروز (مثل البروتين وللأرنب مفتش هدم والبروتين G للماوس مفتش هدم)
• 3X SDS العازلة عينة: 187.5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6.8 عند 25 درجة مئوية)، و 6٪ ث / ت SDS، و 30٪ الجلسرين، و 150 ملي DTT، 0.03٪ ث / ت برموفينول الأزرق

B. إعداد الخلية لست]

• حصاد الخلايا. حصاد الخلايا تحت الظروف nondenaturing، وإزالة وسائل الإعلام وشطف خلايا مرة واحدة مع الثلج الباردة PBS.
• إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1X عازلة خلية تحلل 0.5 مل الجليد الباردة إلى كل لوحة (10 سم)، واحتضان لوحات على الجليد لمدة 5 دقائق.
• تتخلص الخلايا من لوحات ونقل إلى أنابيب microcentrifuge. الحفاظ على الجليد.
• يصوتن مرتين لمدة 10 ثانية في المخزن مناعي المثلج (عازلة IP: 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.4 درجة الحموضة]، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA، 0.1٪ NP-40 ومزيج مثبط البروتياز). لصوتنة، و VialTweeter أو ultrasonicator تحقيق مثل UP100H أو Uf200 ः ر هي الأكثر مناسبة.
• الطرد المركزي لست] في 15000 ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
• نقل طاف لأنبوب جديد. (إذا لزم الأمر، المحللة يمكن تخزينها في -80 ° C).
• إضافة الأجسام المضادة الأولية لطاف. وحضنت طاف مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية تحت الإثارة الخفيفة. وعادة ما يتم إضافة الأجسام المضادة الأولية بمبلغ 10X أكثر تركيزا من يستخدم لالنشاف الغربية. (يمكنك أن تبدأ مع 1μg في 100μL).
• ثم يتم تحضين طاف كذلك مع مزيج من كميات متساوية من البروتين A-الاغاروز (إينفيتروجن) والبروتين G الاغاروز لمدة 1 ساعة أخرى.
• غسل الكريات الاغاروز ثلاث مرات مع العازلة IP. بعد ذلك، استخراج البروتينات ملزمة مع العازلة تحميل SDS-PAGE عن طريق التسخين في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

C. مناعي

• خذ 200 المحللة خلية ميكرولتر وإضافة الأجسام المضادة الأولية. احتضان مع هزاز لطيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
• إضافة إما بروتين A أو G الخرز الاغاروز (20 ميكرولتر من 50٪ حبة الطين). احتضان مع هزاز لطيف لمدة 1-3 ساعات في 4 درجات مئوية.
• microcentrifuge لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية. غسل بيليه خمس مرات مع 500 ميكرولتر من 1X العازلة خلية تحلل. الحفاظ على الجليد خلال يغسل.
• إعادة تعليق بيليه مع 20 عينة العازلة 3X SDS ميكرولتر. دوامة، ثم microcentrifuge لمدة 30 ثانية.
• تسخين العينة إلى 95-100 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق وmicrocentrifuge لمدة 1 دقيقة في 14000 X ز.
• تحميل العينة (15-30 ميكرولتر) على هلام SDS-PAGE (12-15٪).
• تحليل عينة من قبل الغرب النشاف.

تحليل لطخة غربية مع UP50H ultrasonicator

واستخدمت بعد بروتوكول في دراسة Kriebisch وآخرون. (2011):
تم عزل البروتين الكلي من خلايا MC3T3-E1 تعامل مع 1،25 (OH)₂د₃ (10)^-8 M) أو مركبة. وهي lysed الخلايا مع العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8 (سيغما الدريتش)؛ 150 مم كلوريد الصوديوم (فيشر العلمية)؛ 0.1٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) (فيشر العلمية)؛ 1٪ IGEPAL CA-630 (سيغما الدريتش) و 0.5٪ deoxycholate الصوديوم (ميرك). كان sonicated المحللة خلية ل 2 × 10 ثانية في دورة 1 و السعة 80 مع المعالج UP50H بالموجات فوق الصوتية (Hielscher، Ultrasound Technology، Teltow، Germany). بعد ذلك تم الطرد المركزي للمواد لمدة 10 دقائق عند 14000 دورة في الدقيقة واستخدمت المادة الطافية للنبض الغربي. تم غليان 25 ميكروغراماً من البروتين في المخزن المؤقت للعينات وعامل التخفيض (Invitrogen) وتم فصله لاحقًا بواسطة SDS-PAGE باستخدام 4 - 12٪ من هلام polyacrylamide (Invitrogen) ونقل إلى غشاء nitrocellulose (GE Healthcare). تم حجب الغشاء لمدة ساعة واحدة مع TBS (10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ؛ الرقم الهيدروجيني 7.6 ؛ 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم) تحتوي على 1٪ كاسين (سيغما-الدريش) و 1٪ تريس (1 متر). بعد الحجب ، تم تحضين الغشاء مع التحريض الطفيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية (CBS أرنب ضد الإنسان 1/500 ، وضعت في مختبر البروفيسور ر. بانيرجي ، آن أربور ، MI ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء التحضين مع الأجسام المضادة الثانوية البيروكسيديز (HPR) - المقذوفة الثانوية (Dako) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم تطوير جميع البقع عن طريق زيادة التشمع الكيميائي (Perkin Elmer).

الأدب / المراجع