تحضير البلازميدات باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية

تُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية تقنية موثوقة لتجزئة DNA البلازميدي. وتُعد إمكانية التحكم الدقيق في السعة، ونمط النبض، والتحكم في درجة الحرارة أهم خصائص جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية لتجزئة البلازميدات دون إتلافها. بالإضافة إلى ذلك، يساعد استخدام عوامل معينة على الحماية من تحلل البلازميدات. تقدم Hielscher Ultrasonics حلولاً متنوعة لتجزئة البلازميدات بصورة مضبوطة، بدءاً من القوارير الفردية وصولاً إلى المعالجة المتزامنة لعينات عديدة بالموجات فوق الصوتية، وكذلك الصفائح متعددة الآبار. تعرّف على المزيد حول التجزئة الناجحة للبلازميدات بالموجات فوق الصوتية!

قص البلازميدات باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية

عندما تتعرض عينات DNA للموجات فوق الصوتية، تُحدث الاهتزازات المتولدة بالموجات فوق الصوتية تجويفاً صوتياً في السائل، يؤدي إلى قص جزيئات DNA ذات الوزن الجزيئي المرتفع أو تكسيرها بفعل القوى الميكانيكية. وتُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية الطريقة الأكثر استخداماً في تجارب قص DNA بكميات كبيرة، بما في ذلك تطبيقات مثل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)، التي تُعد فيها أحجام القطع الصغيرة ضرورية تماماً للحصول على دقة فصل عالية. (راجع Tseng et al., 2012)
DNA البلازميدي (pDNA) هو شكل محدد من DNA، يتميز بشكله الحلقي ويوجد في البكتيريا وبعض حقيقيات النوى.
يُعد pDNA فائق الالتفاف الشكل المرغوب من DNA البلازميدي، لأنه يحقق أفضل النتائج في العمليات اللاحقة، مثل تحديد التسلسل الآلي وإدخال المادة الوراثية إلى الخلايا. وتناسب المعالجة بالموجات فوق الصوتية تجزئة pDNA بنجاح، بما في ذلك pDNA فائق الالتفاف.
أوضح Thompson et al. (2008) أن معالجة البلازميدات بالموجات فوق الصوتية، المعروفة بقدرتها على تجزئة DNA فائق الالتفاف، تُعد طريقة فعالة لتحسين أطوال قراءات التسلسل عند مستوى phred20 إلى حد لا تختلف معه اختلافاً معنوياً عن القالب الضابط لدى Beckman Coulter أو البلازميدات المحوّلة إنزيمياً إلى الشكل الخطي.

استخدام النواقل البلازميدية

تُستخدم البلازميدات غالباً كأدوات لاستنساخ الجينات ونقلها وتعديلها. وعندما تُستخدم البلازميدات تجريبياً لهذه الأغراض، تُسمى نواقل. ويمكن إدخال قطع DNA أو الجينات في ناقل بلازميدي، مما يُنشئ ما يُسمى بالبلازميد المؤتلف. وتُستخدم النواقل البلازميدية كوسائل لإدخال DNA المؤتلف إلى خلية مضيفة، وهي مكوّن أساسي في الاستنساخ الجزيئي.
“تُدرس النواقل غير الفيروسية على نطاق واسع لإمكان استخدامها في العلاج الجيني لمعالجة أمراض معقدة مختلفة. وتحمي النواقل غير الفيروسية DNA البلازميدي من التحلل الفيزيائي والكيميائي والإنزيمي، وتُوصل جزيء DNA إلى الموقع المستهدف. فعلى سبيل المثال، تُكوّن الجسيمات الشحمية الكاتيونية والكيتوزان وغيرها من الجسيمات النانوية موجبة الشحنة معقدات مع DNA البلازميدي من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية. ومع ذلك، فإن معقدات الجسيمات الشحمية الكاتيونية/DNA البلازميدي التي تتشكل بسهولة تكون كبيرة نسبياً (أي 300–400 nm) وغير متجانسة بطبيعتها، مما يصعّب استخدامها في التطبيقات الصيدلانية. ويمكن اختزال المعقدات الكبيرة وغير المتجانسة من DNA البلازميدي/الجسيمات الشحمية، وDNA البلازميدي/الهباء الجوي، وDNA البلازميدي/الببتيدات إلى جسيمات أصغر ومتجانسة باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية.” (Sarker et al., 2019)
يُعد CRISPR–Cas9 مثالاً بارزاً على استخدام النواقل البلازميدية. وعادةً ما يُوصل نظام CRISPR–Cas9 إلى الخلايا في صورة بلازميد كبير واحد أو عدة بلازميدات أصغر تُشفّر تسلسلاً مستهدفاً، ودليلاً لـ CRISPR، وCas9.

تحضير جسيمات PLGA النانوية المحمّلة بـ DNA بالموجات فوق الصوتية عن طريق الترسيب النانوي

استخدم Jo et al. (2020) بوليمر حمض اللاكتيك المشترك مع حمض الغليكوليك (PLGA) لتكوين حامل من الجسيمات النانوية لإيصال بلازميد نموذجي من CRISPR–Cas9 إلى خلايا بلعمية كبيرة أولية مشتقة من نخاع العظم. وللترسيب النانوي لجسيمات PLGA النانوية، استُخدم PLGA بمجموعتين طرفيتين مختلفتين (مجموعات الإستر والأمين)، بهدف أن تزيد مجموعات الأمين الطرفية موجبة الشحنة من كفاءة التغليف والتحميل نتيجة تفاعلات الشحنات بينها وبين العمود الفقري سالب الشحنة لـ DNA. وفي أنبوب طرد مركزي مخروطي من البولي بروبيلين بسعة 50 mL، أُذيب 100 mg من Pluronic F127 في 20 mL من الماء منزوع الأيونات المعقّم بالأوتوكلاف بواسطة الخلط الدوامي، تلاه 30 min من المعالجة اللطيفة بالموجات فوق الصوتية باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية (انظر CupHorn). أُضيف قضيب تحريك مغناطيسي معقّم بالأوتوكلاف، وخُلط المحلول بسرعة 600 RPM لمدة 30 min أثناء تحضير المحاليل الأخرى. واستُخدمت الأدوات المختبرية البلاستيكية بدلاً من الزجاجية طوال العملية لتقليل الامتزاز غير النوعي لـ DNA. وحُضّرت بصورة منفصلة محاليل PLGA المذاب في DMF ‏(44.48 mg/ ml) وبنتاسين TIPS المذاب في THF ‏(0.667 mg/ml). وتُرك PLGA ساكناً ليتبلل في DMF لمدة 30 min قبل معالجته بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 min. (للاطلاع على البروتوكول الكامل، راجع Jo et al., 2020)

حماية DNA البلازميدي أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية

يكون DNA، بما في ذلك البلازميدات والبلازميدات فائقة الالتفاف، شديد الحساسية للتحلل. ومن المعروف أن جميع طرق التجزئة المتاحة تنطوي على عيوب معينة. وتُعد تجزئة DNA بالموجات فوق الصوتية إحدى الطرق المفضلة، لأن المعالجة المضبوطة بالموجات فوق الصوتية، بالاقتران مع تدابير الحماية، تتيح الحد من تلف سلاسل DNA الناجم عن القص والحرارة.
إلى جانب إعدادات السعة المنخفضة، ونمط النبض، والتحكم في درجة الحرارة أثناء قص DNA بالموجات فوق الصوتية، أظهر استخدام عوامل معينة تأثيراً وقائياً ملحوظاً ضد تحلل DNA. فعلى سبيل المثال، تحمي بوليمرات وببتيدات ودهون متنوعة DNA البلازميدي أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية.

دُرست مقاومة DNA البلازميدي ومعقدات DNA البلازميدي/IL النانوية لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية باستخدام اختبار الرحلان الكهربائي في هلام الأغاروز. وعُرّض كل من DNA البلازميدي ومعقدات DNA البلازميدي/IL النانوية لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدد زمنية مختلفة. وعُرّض DNA البلازميدي لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 0، و10، و20، و30، و40 دقيقة. أما معقدات DNA البلازميدي/IL النانوية، فعُرّضت لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 0، و10، و20، و30، و40، و60، و90، و120 دقيقة.
(الدراسة والصورة: ©Sarker et al., 2019)

أوضح Sarker et al. (2019) أنه عند تعريض البنى النانوية من DNA البلازميدي / السائل الأيوني (pDNA/IL) لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 0، و10، و20، و30، و40، و60، و90، و120 min وتكوين معقدات منها مع عامل إيصال الجينات الكاتيوني المتاح تجارياً lipofectamine، كانت النسب المئوية للخلايا الإيجابية للتألق 80%، و98%، و97%، و85%، و78%، و65%، و65%، و50%، على التوالي (انظر الرسم البياني أدناه). وازدادت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية للتألق عند تعريض البنى النانوية لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 و20 min، ثم انخفضت ببطء بعد ذلك.

تأثير السائل الأيوني [Bmim][PF6] على إيصال DNA البلازميدي إلى خلايا COS7. عُرّضت معقدات DNA البلازميدي/IL (السائل الأيوني) النانوية لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة تصل إلى 120 دقيقة، وكُوّنت معقدات منها مع LA قبل إيصالها إلى خلايا COS7. وتُظهر البيانات متوسط عدد (%) خلايا HeLa الإيجابية لـ GFP التي عُدّت في 10 حقول مجهرية مختلفة، وأُجريت التجربة عدة مرات في ثلاثة أيام مختلفة. (الدراسة والرسم البياني: ©Sarker et al., 2019)

تحضير محلول الخلايا المُحلَّلة بالموجات فوق الصوتية

بروتوكول تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية
ابدأ بعينة مُثرَاة من الخلايا حُضّرت باستخدام طريقة لفصل الخلايا (مثل الفصل المناعي المغناطيسي للخلايا، أو فرز الخلايا المنشّط بالتألق (FACS)، أو الطرد المركزي بتدرج الكثافة، أو عزل الخلايا بالكثافة المناعية).
يجب أن تحتوي عينات الخلايا على حجم من المحلول المنظّم للتحلل يتناسب مع الهدف التجريبي وجهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية ذي المسبار.
تُفضَّل المحاليل المنظّمة ناقصة التوتر لأنها تعزز تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية. ومن المهم استخدام المواد المضافة وتركيز الملح بصورة مناسبة.
اختر جهاز تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية: يُوصى باستخدام VialTweeter أو CupHorn للمعالجة غير المباشرة للقوارير بالموجات فوق الصوتية. وللصفائح متعددة الآبار، يُعد UIP400MTP جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية المثالي. أما للمعالجة التقليدية بالموجات فوق الصوتية باستخدام مسبار، فإن المجانس بالموجات فوق الصوتية مثل UP100H أو UP200Ht المزود بطرف دقيق هو الأنسب.
بروتوكول المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام مسبار: ضع مسبار جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية داخل حجم العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق، وعالجها بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 ثوانٍ تقريباً. وقد تُكرر المعالجة بالموجات فوق الصوتية مرة أو مرتين إضافيتين بحسب عينة DNA. ويعتمد مقدار الطاقة فوق الصوتية المطلوب إدخالها (Ws/mL) على لزوجة العينة ونوع DNA. ويساعد التبريد بحمام ثلجي ونمط النبض في جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية على منع التحلل الحراري للعينة.
بعد التحلل بالموجات فوق الصوتية، تُجرى للعينة عملية طرد مركزي لفصل الحطام المترسب (الذي يحتوي على خلايا غير متحللة، ونوى، وعضيات غير متحللة).
إذا لم تُستكمل معالجة العينة فوراً، فيمكن تخزينها عند درجة حرارة مناسبة للحفاظ على حيويتها.

أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية لتجزئة DNA

تقدم Hielscher Ultrasonics منصات متنوعة تعتمد على الموجات فوق الصوتية لتجزئة DNA وRNA والكروماتين. وتشمل هذه المنصات المختلفة مسابير الموجات فوق الصوتية (السونوترودات)، وحلول المعالجة غير المباشرة بالموجات فوق الصوتية للتحضير المتزامن للعينات في عدة أنابيب أو صفائح متعددة الآبار (مثل الصفائح ذات 96 بئراً وصفائح المعايرة الدقيقة)، ومفاعلات الموجات فوق الصوتية، وأجهزة cuphorns بالموجات فوق الصوتية. وتعمل جميع منصات قص DNA بواسطة معالجات عالية الأداء بالموجات فوق الصوتية مضبوطة التردد، تتيح التحكم الدقيق وتوفر نتائج قابلة للتكرار.

معالجات بالموجات فوق الصوتية لأي عدد وحجم من العينات

باستخدام أجهزة Hielscher لمعالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية، وهي VialTweeter (لما يصل إلى 10 أنابيب اختبار) وUIP400MTP (للصفائح الدقيقة/الصفائح متعددة الآبار)، يصبح من السهل تقليل زمن معالجة العينات بفضل المعالجة المكثفة بالموجات فوق الصوتية التي يمكن التحكم فيها بدقة، مع الحصول على التوزيع المطلوب لأحجام قطع DNA والمردود المطلوب. وتجعل تجزئة DNA بالموجات فوق الصوتية خطوات تحضير البلازميدات فعالة وموثوقة وقابلة للتوسيع. ويمكن توسيع نطاق البروتوكولات خطياً من عينة واحدة إلى عينات عديدة بتطبيق معلمات ثابتة للموجات فوق الصوتية.
تُعد أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية ذات المسابير المزودة بإصبع واحد إلى خمسة أصابع مثالية لتحضير أعداد أقل من العينات. وتتوفر أجهزة Hielscher المختبرية للمعالجة بالموجات فوق الصوتية بمستويات قدرة مختلفة، بحيث يمكنك اختيار جهاز التفكيك بالموجات فوق الصوتية المثالي لتطبيقك المتعلق بـ DNA.