تحضير البلازميد باستخدام الموجات فوق الصوتية
الموجات فوق الصوتية هي تقنية موثوقة لتفتيت الحمض النووي البلازميد. تعد السعة التي يمكن التحكم فيها بدقة ووضع النبض والتحكم في درجة الحرارة أهم ميزات جهاز الموجات فوق الصوتية لتجزئة البلازميد غير الضارة. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد استخدام بعض العوامل على الحماية من تدهور البلازميد. تقدم Hielscher Ultrasonics حلولا مختلفة لتجزئة البلازميد التي يتم التحكم فيها من قوارير مفردة ، وصوتنة العديد من العينات في وقت واحد بالإضافة إلى لوحات متعددة الآبار. معرفة المزيد عن تجزئة البلازميد بالموجات فوق الصوتية الناجحة!
The UIP400MTP يسمح بالموجات فوق الصوتية التي يتم التحكم فيها بدقة للوحات متعددة الآبار. أحد تطبيقات UIP400MTP هو تفتيت الحمض النووي البلازميد من أجل الحصول على شظايا ذات طول مستهدف على وجه التحديد.
القص البلازميد باستخدام الموجات فوق الصوتية
عندما تتعرض عينات الحمض النووي للموجات فوق الصوتية ، فإن الاهتزازات التي يتم إنشاؤها بالموجات فوق الصوتية تخلق تجويفا صوتيا في السائل الذي يقص أو يكسر جزيئات الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي عبر القوى الميكانيكية. الصوتنة هي الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لتجارب قص الحمض النووي السائبة بما في ذلك التطبيقات ، مثل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ، والتي تعتبر أحجام الشظايا الصغيرة حاسمة للغاية للحصول على دقة عالية. (راجع تسنغ وآخرون، 2012)
الحمض النووي البلازميد (pDNA) هو شكل محدد من الحمض النووي ، يتميز بشكل حلقته ويوجد في البكتيريا وبعض حقيقيات النوى.
pDNA الملفوف الفائق هو الشكل المطلوب من الحمض النووي البلازميد لأنه يظهر أفضل النتائج في العمليات النهائية مثل التسلسل الآلي والنقل. الموجات فوق الصوتية مناسبة لتجزئة pDNA ، بما في ذلك pDNA الملفوف الفائق ، بنجاح.
أثبت Thompson et al. (2008) أن صوتنة البلازميد ، والتي من المعروف أنها تجزئ الحمض النووي الملفوف الفائق ، هي طريقة فعالة لتحسين أطوال قراءة phred20 للتسلسل لدرجة أنها لا تختلف اختلافا كبيرا عن قالب التحكم في Beckman Coulter أو البلازميدات الخطية الأنزيمية.
- يمكن التحكم بدقة
- نتائج قابلة للتكرار
- قابل للتعديل لاستهداف أطوال أجزاء الحمض النووي
- التحكم في درجة الحرارة
- قابلة للتطوير إلى أي حجم عينة
استخدام ناقلات البلازميد
غالبا ما تستخدم البلازميدات كأدوات لاستنساخ الجينات ونقلها والتلاعب بها. عندما يتم استخدام البلازميدات تجريبيا لهذه الأغراض ، فإنها تسمى المتجهات. يمكن إدخال شظايا الحمض النووي أو الجينات في ناقل البلازميد ، مما يخلق ما يسمى بالبلازميد المؤتلف. تستخدم ناقلات البلازميد كمركبات لدفع الحمض النووي المؤتلف إلى خلية مضيفة وهي مكون رئيسي في الاستنساخ الجزيئي.
“تجري دراسة النواقل غير الفيروسية على نطاق واسع لاستخدامها المحتمل في العلاج الجيني لعلاج مختلف الأمراض المعقدة. تحمي النواقل غير الفيروسية الحمض النووي البلازميدي من التدهور الفيزيائي والكيميائي والإنزيمي وتوصل جزيء الحمض النووي إلى الموقع المستهدف. على سبيل المثال ، تشكل الجسيمات الشحمية الكاتيونية والشيتوزان وغيرها من الجسيمات النانوية الموجبة الشحنة مجمعات مع الحمض النووي البلازميدي من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية. ومع ذلك ، فإن الجسيمات الشحمية الكاتيونية سهلة التكوين / مجمعات الحمض النووي البلازميد كبيرة نسبيا (أي 300-400 نانومتر) وغير متجانسة في طبيعتها مما يجعل من الصعب استخدامها في التطبيقات الصيدلانية. يمكن تقليل الحمض النووي البلازميدي الكبير وغير المتجانس / الجسيمات الشحمية ، والحمض النووي البلازميد / الهباء الجوي ، ومجمعات الحمض النووي / الببتيدات البلازميدية إلى جزيئات أصغر حجما ومتجانسة باستخدام الموجات فوق الصوتية.” (ساركر وآخرون، 2019)
مثال بارز على استخدام ناقلات البلازميد هو CRISPR-Cas9. عادة ما يتم تسليم نظام CRISPR–Cas9 إلى الخلايا كبلازميد واحد كبير أو عدة بلازميدات أصغر حجما تقوم بتشفير تسلسل مستهدف ودليل CRISPR وCas9.
إعداد بالموجات فوق الصوتية للجسيمات النانوية PLGA المحملة بالحمض النووي عن طريق هطول الأمطار النانوية
استخدم Jo et al. (2020) poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) من أجل تشكيل حامل جسيمات نانوية لتوصيل نموذج CRISPR-Cas9 plasmid إلى البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم. بالنسبة لهطول الأمطار النانوية للجسيمات النانوية PLGA ، تم استخدام PLGA مع مجموعتين نهايتين مختلفتين (مجموعات الإستر والأمين) بهدف أن تزيد أغطية نهاية الأمين الموجبة الشحنة من كفاءة التغليف والتحميل بسبب تفاعلات الشحنة بينها وبين العمود الفقري المشحون سلبا للحمض النووي. في أنبوب طرد مركزي مخروطي من البولي بروبيلين سعة 50 مل ، تم إذابة 100 ملغ من Pluronic F127 في 20 مل من ماء DI المعقم عن طريق خلط الدوامة متبوعا ب 30 دقيقة من الصوتنة اللطيفة باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية (انظر كوبهورن). تمت إضافة شريط تحريك مغناطيسي معقم وتم خلط المحلول عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة بينما تم صنع المحاليل الأخرى. تم استخدام أدوات المختبر البلاستيكية بدلا من الأواني الزجاجية في جميع أنحائها لتقليل الامتزاز غير المحدد للحمض النووي. تم تصنيع محاليل PLGA الذائبة في DMF (44.48 مجم / مل) و TIPS pentacene المذاب في THF (0.667 mg / ml) بشكل منفصل. تم ترك PLGA بهدوء ليبلل في DMF لمدة 30 دقيقة قبل أن يتم صوته لمدة 30 دقيقة (للحصول على البروتوكول الكامل ، انظر Jo et al.، 2020)
- استخراج الحمض النووي
- تغليف الحمض النووي
- تشتت الحمض النووي المغلف بالجسيمات النانوية
- توصيل الحمض النووي البلازميدي إلى الخلايا
UP200St CupHorn للصوتنة غير المباشرة للعينات ، على سبيل المثال لاستخراج الحمض النووي وتفتيته.
حماية الحمض النووي البلازميد أثناء الصوتنة
الحمض النووي بما في ذلك البلازميدات والبلازميدات الملفوفة الفائقة هي تدهور حساس للغاية. جميع طرق التجزئة المتاحة معروفة ببعض العيوب. تجزئة الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية هي واحدة من الطرق المفضلة لأن الصوتنة التي تسيطر عليها في تركيبة مع تدابير وقائية تسمح للحد من الضرر الناجم عن القص والحرارة من خيوط الحمض النووي.
إلى جانب إعدادات السعة المنخفضة ووضع النبض والتحكم في درجة الحرارة أثناء قص الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية ، أظهر استخدام بعض العوامل تأثيرا وقائيا كبيرا ضد تدهور الحمض النووي. على سبيل المثال ، تحمي البوليمرات المختلفة والببتيدات والدهون الحمض النووي البلازميد أثناء الموجات فوق الصوتية.
تم التحقيق في استقرار الحمض النووي البلازميد ، والمجمعات النانوية للحمض النووي البلازميد / IL ضد إجهاد القص بالموجات فوق الصوتية باستخدام فحص الرحلان الكهربائي هلام agarose. تعرض كل من الحمض النووي البلازميدي والحمض النووي البلازميدي / المجمعات النانوية IL لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لنقاط زمنية مختلفة. تعرض الحمض النووي البلازميد لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 0 و 10 و 20 و 30 و 40 دقيقة. ومع ذلك ، تعرضت المجمعات النانوية للحمض النووي البلازميد / IL لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 60 و 90 و 120 دقيقة.
(دراسة وصورة: ©Sarker et al., 2019)
أظهر Sarker et al. (2019) أنه عندما تعرضت الهياكل النانوية للحمض النووي / السائل الأيوني البلازميد (pDNA / IL) لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 60 و 90 و 120 دقيقة وتعقدت مع عامل توصيل الجينات الكاتيوني المتاح تجاريا lipofectamine ، كانت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية الفلورية 80٪ و 98٪ و 97٪ و 85٪ و 78٪ و 65٪ 65٪ ، و 50٪ على التوالي (انظر الرسم البياني أدناه). زادت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية الفلورية عندما تعرضت الهياكل النانوية لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 ، و 20 دقيقة ، وبعد ذلك انخفضت ببطء.
تأثير السائل الأيوني [Bmim] [PF6] على توصيل الحمض النووي البلازميد إلى خلايا COS7. تعرضت المجمعات النانوية للحمض النووي البلازميد / IL (السائل الأيوني) لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة تصل إلى 120 دقيقة وعقدت مع LA قبل تسليمها إلى خلايا COS7. تظهر البيانات متوسط عدد (٪) من خلايا HeLa الإيجابية GFP التي تم حسابها في 10 حقول مجهرية مختلفة وتم إجراء التجربة عدة مرات في ثلاثة أيام مختلفة. (الدراسة والرسم البياني: ©Sarker et al.، 2019)
يمكن حماية الحمض النووي البلازميد بإضافة عامل قبل التجزئة بالموجات فوق الصوتية: التدهور الناجم عن سونيكشن من pDNA عارية (A) و pDNA المصاغة مع 1.5 mM من CaCl2 و 20 ٪ (v / v) t-butanol (B)
تم صوتنة العينات باستخدام مسبار بقوة 20 واط لمدة تصل إلى 120 ثانية ، كما هو موضح في الجزء العلوي من كل حارة. يتوافق Lane H مع علامة Hyperladder ™️ I. يشار إلى نطاقات البلازميد OC و SC.
(دراسة وصور: ©وو وآخرون، 2009)
إعداد ليسات بالموجات فوق الصوتية
بروتوكول تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية
ابدأ بعينة غنية من الخلايا التي تم إعدادها عبر طريقة فصل الخلايا (على سبيل المثال ، فصل الخلايا المناعية المغناطيسية ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) ، والطرد المركزي لتدرج الكثافة ، وعزل الخلايا ذات الكثافة المناعية).
يجب أن تظهر عينات الخلايا حجما من مخزن مؤقت للتحلل مناسب للهدف التجريبي والموجات فوق الصوتية من نوع المسبار.
ويفضل المخازن المؤقتة هيبتونيك لأنها تعزز تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية. من المهم استخدام المواد المضافة وتركيز الملح بطريقة مناسبة.
حدد جهاز التحلل بالموجات فوق الصوتية: بالنسبة للصوتنة غير المباشرة للقوارير ، يوصى باستخدام VialTweeter أو CupHorn. بالنسبة للوحات متعددة الآبار ، فإن UIP400MTP هو جهاز الموجات فوق الصوتية المثالي. والصوتنة الكلاسيكية من نوع المسبار ، وهو مجانس بالموجات فوق الصوتية مثل UP100H أو UP200Ht مع طرف صغير هي الأنسب.
بروتوكول الصوتنة من نوع المسبار: ضع مسبار الموجات فوق الصوتية في حجم العينة في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق وسونيكات لمدة 10 ثوان تقريبا. اعتمادا على عينة الحمض النووي ، قد يتم تكرار الصوتنة مرة أو مرتين أكثر. يعتمد إدخال الطاقة بالموجات فوق الصوتية المطلوبة (Ws / mL) على لزوجة العينة ونوع الحمض النووي. يساعد التبريد عبر حمام الثلج ووضع النبض في الموجات فوق الصوتية على منع تدهور العينة حراريا.
بعد التحلل بالموجات فوق الصوتية ، يتم طرد العينة مركزيا لفصل حطام الكريات (الذي يحتوي على خلايا غير محللة ونوى وعضيات غير محللة)
إذا لم تتم معالجة العينة على الفور ، فيمكن تخزينها في درجة حرارة مناسبة للحفاظ على صلاحيتها.
الموجات فوق الصوتية لتجزئة الحمض النووي
Hielscher Ultrasonics يقدم مختلف المنصات القائمة على الموجات فوق الصوتية للحمض النووي، الجيش الملكي النيبالي، وتجزئة الكروماتين. وتشمل هذه المنصات المختلفة مسابير الموجات فوق الصوتية (سونوتروديس)، حلول سونيكيشن غير المباشرة لإعداد عينة في وقت واحد من أنابيب متعددة أو لوحات متعددة الآبار (على سبيل المثال، لوحات 96 بئر، لوحات microtiter)، سونوريكاتورس، وcuphorns بالموجات فوق الصوتية. تعمل جميع منصات قص الحمض النووي بمعالجات بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء يتم ضبطها حسب التردد، والتي يمكن التحكم فيها بدقة وتوصل إلى نتائج قابلة للاستنساخ.
المعالجات بالموجات فوق الصوتية لأي رقم العينة والحجم
مع أجهزة الموجات فوق الصوتية متعددة العينات VialTweeter من Hielscher (لما يصل إلى 10 أنابيب اختبار) و UIP400MTP (للألواح الدقيقة / اللوحات متعددة الآبار) ، يصبح من الممكن بسهولة تقليل وقت معالجة العينات بسبب الموجات فوق الصوتية المكثفة والتي يمكن التحكم فيها بدقة مع الحصول على توزيع حجم جزء الحمض النووي المطلوب وإنتاجيته. تجزئة الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية يجعل خطوات إعداد البلازميد فعالة وموثوقة وقابلة للتطوير. يمكن قياس البروتوكولات خطيا من عينة واحدة إلى عدة عينات من خلال تطبيق معلمات الموجات فوق الصوتية الثابتة.
تعد أجهزة الموجات فوق الصوتية للمسبار ذات الإصبع الواحد إلى الخمسة أصابع مثالية لإعداد أعداد عينات أصغر. تتوفر أجهزة الموجات فوق الصوتية المختبرية من Hielscher بمستويات طاقة مختلفة بحيث يمكنك اختيار المعطل بالموجات فوق الصوتية المثالي للتطبيق المتعلق بالحمض النووي الخاص بك.
وحدة إعداد العينات المتعددة بالموجات فوق الصوتية VialTweeter يسمح ل sonication في وقت واحد من 10 قنينات. مع فيالبريس جهاز المشبك، يمكن الضغط على ما يصل إلى 4 أنابيب إضافية إلى الأمام ل sonication مكثفة.
عملية مراقبة دقيقة
إعدادات سونيكيشن يمكن التحكم فيها بدقة حاسمة منذ سونيشن شاملة يمكن أن تدمر الحمض النووي، الجيش الملكي النيبالي والكروماتين، ولكن نتائج القص بالموجات فوق الصوتية غير كافية في الحمض النووي طويلة جدا وشظايا الكروماتين. يمكن تعيين الموجات فوق الصوتية الرقمية Hielscher بسهولة إلى معلمة سونيكيشن دقيقة. يمكن أيضا حفظ إعدادات sonication محددة كإعداد مبرمجة للتكرار السريع لنفس الإجراء.
يتم تلقائيا بروتوكول جميع sonication وتخزينها كملف CSV على المدمج في بطاقة SD. وهذا يسمح لتوثيق دقيق للتجارب التي أجريت ويجعل من الممكن لمراجعة سونيكيشن يعمل بسهولة.
عن طريق التحكم عن بعد المتصفح، يمكن تشغيل جميع ultrasonicators الرقمية ومراقبتها عبر أي متصفح القياسية. تثبيت برامج إضافية غير مطلوب، لأن اتصال LAN هو إعداد التوصيل n-play بسيطة جدا.
أعلى سهولة في الاستخدام أثناء إعداد الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية
تم تصميم جميع الموجات فوق الصوتية Hielscher لتقديم الموجات فوق الصوتية عالية الأداء، في حين يجري دائما في الوقت نفسه جدا سهلة الاستخدام وسهلة التشغيل. جميع الإعدادات منظمة بشكل جيد في قائمة واضحة ، والتي يمكن الوصول إليها بسهولة عن طريق شاشة اللمس الملونة أو جهاز التحكم عن بعد المتصفح. يضمن البرنامج الذكي الذي يتضمن إعدادات قابلة للبرمجة وتسجيل تلقائي للبيانات إعدادات صوتنة مثالية للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للاستنساخ. واجهة القائمة نظيفة وسهلة الاستخدام تحويل Hielscher ultrasonicators إلى أجهزة سهلة الاستخدام وفعالة.
يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزة الموجات فوق الصوتية في المختبر لدينا لتحلل الخلايا وتجزئة الحمض النووي:
| دفعة حجم | معدل المد و الجزر | الأجهزة الموصى بها |
|---|---|---|
| لوحات متعددة الآبار | ن / أ | UIP400MTP |
| قوارير ، كوب صغير | ن / أ | cuphorn بالموجات فوق الصوتية |
| ما يصل إلى 10 قوارير | ن / أ | VialTweeter |
| 1 إلى 500ML | 10 إلى 200ML / دقيقة | UP100H |
| 10 إلى 2000ML | 20 إلى 400ML / دقيقة | Uf200 ः ر، UP400St |
اتصل بنا! / اسألنا!
الأدب / المراجع
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
حقائق تستحق العلم
ما هي البلازميدات؟
البلازميد هو جزيء حمض نووي دائري صغير منفصل جسديا عن الحمض النووي للكروموسومات ويتكاثر بشكل مستقل. غالبا ما ترتبط البلازميدات بالجينات التي تساهم في بقاء الكائن الحي وتضفي مزايا محددة ، مثل مقاومة المضادات الحيوية. توجد البلازميدات بشكل شائع كجزيئات حمض نووي دائرية صغيرة مزدوجة الخيوط في البكتيريا. ومع ذلك ، توجد البلازميدات في بعض الأحيان في الكائنات القديمة والكائنات حقيقية النواة. البلازميدات هي أدوات مهمة في البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة والكيمياء الحيوية وعلوم الحياة. تعرف البلازميدات باسم النواقل في الهندسة الوراثية، وتستخدم لتكرار جينات معينة أو التعبير عنها. يسمى التغيير المستهدف للمتجه تصميم المتجهات.
تحليل GFP في أبحاث الخلايا
بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) هو علامة بيولوجية متعددة الاستخدامات لمراقبة العمليات الفسيولوجية ، وتصور توطين البروتين ، والكشف عن التعبير المعدل وراثيا في الجسم الحي. يمكن إثارة GFP بواسطة خط الليزر 488 نانومتر ويتم اكتشافه على النحو الأمثل عند 510 نانومتر.
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع عالية الأداء المجانسة بالموجات فوق الصوتية من مختبر إلى حجم الصناعية.