إعداد البلازميد باستخدام الموجات فوق الصوتية
Ultrasonication هي تقنية موثوقة لتجزئة الحمض النووي البلازميد. السعة التي يمكن التحكم فيها بدقة ، ووضع النبض والتحكم في درجة الحرارة هي أهم ميزات الموجات فوق الصوتية لتجزئة البلازميد غير الضارة. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد استخدام بعض العوامل على الحماية من تدهور البلازميد. Hielscher Ultrasonics يقدم حلولا مختلفة لتجزئة البلازميد التي تسيطر عليها من قوارير واحدة، صوتنة في وقت واحد من العديد من العينات، فضلا عن لوحات الآبار متعددة. معرفة المزيد عن نجاح تجزئة البلازميد بالموجات فوق الصوتية!
ذا UIP400MTP يسمح بالموجات فوق الصوتية التي يتم التحكم فيها بدقة من لوحات متعددة الآبار. أحد تطبيقات UIP400MTP هو تجزئة الحمض النووي البلازميد من أجل الحصول على شظايا ذات طول مستهدف على وجه التحديد.
قص البلازميد باستخدام الموجات فوق الصوتية
عندما تتعرض عينات الحمض النووي للموجات فوق الصوتية ، فإن الاهتزازات المتولدة بالموجات فوق الصوتية تخلق تجويفا صوتيا في السائل الذي يقص أو يكسر جزيئات الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي عبر القوى الميكانيكية. Sonication هي الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لتجارب قص الحمض النووي السائبة بما في ذلك التطبيقات ، مثل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ، والتي تعتبر أحجام الشظايا الصغيرة ضرورية للغاية للحصول على دقة عالية. (راجع تسينغ وآخرون ، 2012)
الحمض النووي البلازميد (pDNA) هو شكل محدد من الحمض النووي ، يتميز بشكله الدائري ويوجد في البكتيريا وبعض حقيقيات النوى.
الحمض النووي pDNA فائق اللف هو الشكل المطلوب من الحمض النووي البلازميدي لأنه يظهر أفضل النتائج في العمليات النهائية مثل التسلسل الآلي والنقل. الموجات فوق الصوتية مناسبة لتجزئة الحمض النووي ، بما في ذلك pDNA supercoiled ، بنجاح.
أظهر Thompson et al. (2008) أن صوتنة البلازميد ، المعروفة بتفتيت الحمض النووي فائق الالتفاف ، هي طريقة فعالة لتحسين أطوال قراءة phred20 المتسلسلة لدرجة أنها لا تختلف اختلافا كبيرا عن قالب التحكم في Beckman Coulter أو البلازميدات الخطية إنزيميا.
- يمكن التحكم فيها بدقة
- نتائج قابلة للتكرار
- قابل للتعديل لاستهداف أطوال شظايا الحمض النووي
- التحكم في درجة الحرارة
- قابلة للتطوير لأي حجم عينة
استخدام ناقلات البلازميد
غالبا ما تستخدم البلازميدات كأدوات لاستنساخ الجينات ونقلها ومعالجتها. عندما يتم استخدام البلازميدات تجريبيا لهذه الأغراض ، فإنها تسمى المتجهات. يمكن إدخال شظايا أو جينات الحمض النووي في ناقل البلازميد ، مما يخلق ما يسمى البلازميد المؤتلف. تستخدم ناقلات البلازميد كمركبات لدفع الحمض النووي المعاد الاتحاد إلى الخلية المضيفة وهي مكون رئيسي للاستنساخ الجزيئي.
“تجري دراسة النواقل غير الفيروسية على نطاق واسع لاستخدامها المحتمل في العلاج الجيني لعلاج مختلف الأمراض المعقدة. تحمي النواقل غير الفيروسية الحمض النووي البلازميد من التدهور الفيزيائي والكيميائي والأنزيمي وتوصل جزيء الحمض النووي إلى الموقع المستهدف. على سبيل المثال ، تشكل الجسيمات الشحمية الموجبة والشيتوزان وغيرها من الجسيمات النانوية المشحونة إيجابيا مجمعات مع الحمض النووي البلازميد من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية. ومع ذلك ، فإن معقدات الحمض النووي الكاتيوني / البلازميد المتكونة بسهولة كبيرة نسبيا (أي 300-400 نانومتر) وغير متجانسة بطبيعتها مما يجعل من الصعب استخدامها في التطبيقات الصيدلانية. يمكن تقليل الحمض النووي البلازميد / الجسيمات الشحمية الكبيرة وغير المتجانسة ، والحمض النووي البلازميد / الهباء الجوي ، ومجمعات الحمض النووي / الببتيدات البلازميد إلى جزيئات أصغر ومتجانسة باستخدام الموجات فوق الصوتية.” (ساركر وآخرون ، 2019)
ومن الأمثلة البارزة على استخدام ناقلات البلازميد كريسبر-كاس 9. عادة ما يتم تسليم نظام CRISPR-Cas9 إلى الخلايا كبلازميد واحد كبير أو عدة بلازميدات أصغر تشفر تسلسلا مستهدفا ودليل CRISPR و Cas9.
التحضير بالموجات فوق الصوتية لجسيمات PLGA النانوية المحملة بالحمض النووي عن طريق الترسيب النانوي
استخدم Jo et al. (2020) بولي (حمض اللاكتيك المشترك في الجليكوليك) (PLGA) من أجل تشكيل حامل جسيمات نانوية لتوصيل نموذج CRISPR-Cas9 plasmid إلى البلاعم المشتقة من نخاع العظم الأساسي. بالنسبة للترسيب النانوي لجسيمات PLGA النانوية ، تم استخدام PLGA مع مجموعتين طرفيتين مختلفتين (مجموعات الإستر والأمين) بهدف أن تزيد أغطية نهاية الأمين المشحونة إيجابيا من كفاءة التغليف والتحميل بسبب تفاعلات الشحن بينها وبين العمود الفقري سالب الشحنة للحمض النووي. في أنبوب طرد مركزي مخروطي من مادة البولي بروبيلين سعة 50 مل ، تم إذابة 100 مجم من Pluronic F127 في 20 مل من ماء DI المعقم عن طريق خلط الدوامة متبوعا ب 30 دقيقة من الصوتنة اللطيفة باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية (انظر كوبهورن). تمت إضافة قضيب تقليب مغناطيسي معقم وتم خلط المحلول عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة بينما تم صنع المحاليل الأخرى. تم استخدام أدوات المختبر البلاستيكية بدلا من الأواني الزجاجية في جميع أنحاء لتقليل الامتزاز غير المحدد للحمض النووي. تم صنع محاليل PLGA المذابة في DMF (44.48 مجم / مل) و TIPS pentacene المذاب في THF (0.667 مجم / مل) بشكل منفصل. تم ترك PLGA بهدوء للبلل في DMF لمدة 30 دقيقة قبل صوتنة لمدة 30 دقيقة (للحصول على بروتوكول كامل انظر Jo et al. ، 2020)
- استخراج الحمض النووي
- تغليف الحمض النووي
- تشتت الحمض النووي المغلف بالجسيمات النانوية
- توصيل الحمض النووي البلازميد إلى الخلايا
UP200St CupHorn للصوتنة غير المباشرة للعينات ، على سبيل المثال لاستخراج الحمض النووي وتجزئته.
حماية الحمض النووي البلازميد أثناء Sonication
الحمض النووي بما في ذلك البلازميدات والبلازميدات فائقة اللفائف هي تدهور حساس للغاية. جميع طرق التجزئة المتاحة معروفة بعيوب معينة. تجزئة الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية هي واحدة من الطرق المفضلة منذ صوتنة تسيطر في تركيبة مع تدابير وقائية يسمح للحد من القص والحرارة الناجمة عن الضرر من خيوط الحمض النووي.
إلى جانب إعدادات السعة المنخفضة ووضع النبض والتحكم في درجة الحرارة أثناء قص الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية ، أظهر استخدام بعض العوامل تأثيرا وقائيا كبيرا ضد تدهور الحمض النووي. على سبيل المثال ، تحمي البوليمرات المختلفة والببتيدات والدهون الحمض النووي للبلازميد أثناء الموجات فوق الصوتية.
تم التحقيق في استقرار الحمض النووي البلازميد ، ومركبات البلازميد DNA / IL النانوية ضد إجهاد القص بالموجات فوق الصوتية باستخدام مقايسة الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز. تعرض كل من الحمض النووي البلازميد والمركبات النانوية DNA / IL البلازميد لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لنقاط زمنية مختلفة. تعرض الحمض النووي البلازميد لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 0 و 10 و 20 و 30 و 40 دقيقة. ومع ذلك ، تعرضت مجمعات الحمض النووي النانوية البلازميد / IL لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 60 و 90 و 120 دقيقة.
(دراسة وصورة: ©ساركر وآخرون ، 2019)
أظهر Sarker et al. (2019) أنه عندما تعرضت الهياكل النانوية للحمض النووي البلازميد / السائل الأيوني (pDNA / IL) لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 60 و 90 و 120 دقيقة وتعقدت مع عامل توصيل الجينات الموجبة المتاح تجاريا ليبوفيكتامين ، كانت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية الفلورية 80٪ ، 98٪ ، 97٪ ، 85٪ ، 78٪ ، 65٪ ، 65٪ و 50٪ على التوالي (انظر الرسم البياني أدناه). زادت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية الفلورية عندما تعرضت الهياكل النانوية لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 و 20 دقيقة ، وبعد ذلك انخفضت ببطء.
تأثير السائل الأيوني [Bmim] [PF6] على توصيل الحمض النووي البلازميد إلى خلايا COS7. تعرضت المركبات النانوية Plasmid DNA / IL (السائل الأيوني) لإجهاد القص بالموجات فوق الصوتية لمدة تصل إلى 120 دقيقة وتعقدت مع LA قبل تسليمها إلى خلايا COS7. تظهر البيانات متوسط عدد (٪) خلايا هيلا الإيجابية ل GFP التي تم حسابها في 10 مجالات مجهرية مختلفة وتم إجراء التجربة عدة مرات في ثلاثة أيام مختلفة. (الدراسة والرسم البياني: ©Sarker et al. ، 2019)
يمكن حماية الحمض النووي البلازميد بإضافة عامل قبل التجزئة بالموجات فوق الصوتية: التحلل الناجم عن الصوتنة للحمض النووي العاري (A) والحمض النووي pDNA المركب مع 1.5 mM من CaCl2 و 20٪ (v / v) t-butanol (B)
تم صوتنة العينات باستخدام مسبار 20 واط لمدة تصل إلى 120 ثانية ، كما هو موضح في الجزء العلوي من كل حارة. يتوافق Lane H مع علامة Hyperladder I ™️. يشار إلى نطاقات البلازميد OC و SC.
(دراسة وصور: ©وو وآخرون ، 2009)
إعداد المحللة بالموجات فوق الصوتية
بروتوكول تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية
ابدأ بعينة غنية من الخلايا التي تم تحضيرها عبر طريقة فصل الخلايا (على سبيل المثال ، فصل الخلايا المغناطيسية المناعية ، فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) ، الطرد المركزي المتدرج الكثافة ، عزل الخلايا المناعية).
يجب أن تظهر عينات الخلايا حجما من المخزن المؤقت للتحلل المناسب للهدف التجريبي والموجات فوق الصوتية من نوع المسبار.
يفضل استخدام المخازن المؤقتة منخفضة التوتر لأنها تعزز تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية. من المهم استخدام المواد المضافة وتركيز الملح بطريقة مناسبة.
حدد جهاز التحلل بالموجات فوق الصوتية: للحصول على صوتنة غير مباشرة من قوارير ، يوصى باستخدام VialTweeter أو CupHorn. بالنسبة للألواح متعددة الآبار ، فإن UIP400MTP هو الموجات فوق الصوتية المثالية. وصوتنة من نوع المسبار الكلاسيكي ، فإن الخالط بالموجات فوق الصوتية مثل UP100H أو UP200Ht مع طرف صغير هي الأنسب.
بروتوكول صوتنة من نوع المسبار: ضع مسبار الموجات فوق الصوتية في حجم العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق وصوتنة لمدة 10 ثوان تقريبا. اعتمادا على عينة الحمض النووي ، قد يتم تكرار صوتنة مرة أو مرتين أخريين. يعتمد إدخال الطاقة بالموجات فوق الصوتية المطلوبة (Ws / mL) على لزوجة العينة ونوع الحمض النووي. التبريد عن طريق حمام الجليد ووضع النبض من الموجات فوق الصوتية يساعد على منع أن العينة تتحلل حراريا.
بعد التحلل بالموجات فوق الصوتية ، يتم طرد العينة لفصل حطام الحبيبات (الذي يحتوي على خلايا غير محللة ونوى وعضيات غير محللة)
إذا لم تتم معالجة العينة على الفور ، فيمكن تخزينها في درجة حرارة مناسبة للحفاظ على صلاحيتها.
الموجات فوق الصوتية لتجزئة الحمض النووي
Hielscher الفوق صوتيات يقدم مختلف المنصات القائمة على الموجات فوق الصوتية للحمض النووي، الحمض النووي الريبي، وتجزئة الكروماتين. وتشمل هذه المنصات المختلفة تحقيقات الموجات فوق الصوتية (sonotrodes) ، وحلول صوتنة غير مباشرة لإعداد عينة في وقت واحد من أنابيب متعددة أو لوحات متعددة الآبار (على سبيل المثال ، لوحات 96 بئر ، لوحات microtiter) ، مفاعلات سونو ، و cuphorns بالموجات فوق الصوتية. يتم تشغيل جميع منصات قص الحمض النووي بواسطة معالجات بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء مضبوطة على التردد ، والتي يمكن التحكم فيها بدقة وتقدم نتائج قابلة للتكرار.
معالجات بالموجات فوق الصوتية لأي عدد عينة وحجم
مع الموجات فوق الصوتية متعددة العينات من Hielscher VialTweeter (لما يصل إلى 10 أنابيب اختبار) و UIP400MTP (للألواح الدقيقة / لوحات multiwell) يصبح من الممكن بسهولة تقليل وقت معالجة العينات بسبب الموجات فوق الصوتية المكثفة والتي يمكن التحكم فيها بدقة مع الحصول على توزيع حجم جزء الحمض النووي المطلوب والعائد. تجزئة الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية تجعل خطوات تحضير البلازميد فعالة وموثوقة وقابلة للتطوير. يمكن تحجيم البروتوكولات خطيا من عينة واحدة إلى عدة عينات من خلال تطبيق معلمات الموجات فوق الصوتية الثابتة.
مسبار الموجات فوق الصوتية مع واحد إلى خمسة أصابع مثالية لإعداد أرقام عينات أصغر. الموجات فوق الصوتية مختبر Hielscher متوفرة بمستويات طاقة مختلفة بحيث يمكنك اختيار المعطل بالموجات فوق الصوتية المثالي للتطبيق المتعلق بالحمض النووي الخاص بك.
وحدة تحضير العينات المتعددة بالموجات فوق الصوتية VialTweeter يسمح لصوتنة في وقت واحد من ما يصل إلى 10 قارورة. مع جهاز التثبيت VialPress ، يمكن ضغط ما يصل إلى 4 أنابيب إضافية إلى الأمام للحصول على صوتنة مكثفة.
تحكم دقيق في العملية
تعد إعدادات الصوتنة التي يمكن التحكم فيها بدقة أمرا بالغ الأهمية لأن الصوتنة الشاملة يمكن أن تدمر الحمض النووي والحمض النووي الريبي والكروماتين ، ولكن القص بالموجات فوق الصوتية غير الكافي يؤدي إلى شظايا طويلة جدا من الحمض النووي والكروماتين. Hielscher الموجات فوق الصوتية الرقمية يمكن ضبطها بسهولة على معلمة صوتنة دقيقة. يمكن أيضا حفظ إعدادات صوتنة محددة كإعداد مبرمج للتكرار السريع لنفس الإجراء.
يتم بروتوكول جميع صوتنة تلقائيا وتخزينها كملف CSV على بطاقة SD مدمجة. وهذا يسمح لتوثيق دقيق من التجارب التي أجريت ويجعل من الممكن لمراجعة صوتنة يعمل بسهولة.
عبر جهاز التحكم عن بعد في المتصفح ، يمكن تشغيل جميع الموجات فوق الصوتية الرقمية ومراقبتها عبر أي متصفح قياسي. لا يلزم تثبيت برامج إضافية ، نظرا لأن اتصال LAN عبارة عن إعداد بسيط للغاية للتوصيل والتشغيل.
أعلى سهولة في الاستخدام أثناء تحضير الحمض النووي بالموجات فوق الصوتية
تم تصميم جميع الموجات فوق الصوتية Hielscher لتقديم الموجات فوق الصوتية عالية الأداء، في حين في الوقت نفسه دائما كونها سهلة الاستخدام للغاية وسهلة التشغيل. جميع الإعدادات منظمة بشكل جيد في قائمة واضحة ، والتي يمكن الوصول إليها بسهولة عبر شاشة ملونة تعمل باللمس أو جهاز التحكم عن بعد في المتصفح. يضمن البرنامج الذكي مع الإعدادات القابلة للبرمجة وتسجيل البيانات التلقائي إعدادات صوتنة مثالية للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. واجهة القائمة نظيفة وسهلة الاستخدام تحويل الموجات فوق الصوتية Hielscher إلى أجهزة سهلة الاستخدام وفعالة.
يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزة الموجات فوق الصوتية في مختبرنا لتحلل الخلايا وتجزئة الحمض النووي:
| حجم الدفعة | معدل التدفق | الأجهزة الموصى بها |
|---|---|---|
| لوحات متعددة الآبار | غير متوفر | UIP400MTP |
| قوارير دورق صغيرة | غير متوفر | كوب بالموجات فوق الصوتيةهورن |
| ما يصل إلى 10 قوارير | غير متوفر | VialTweeter |
| 1 إلى 500 مل | 10 إلى 200 مل / دقيقة | UP100H |
| 10 إلى 2000 مل | 20 إلى 400 مل / دقيقة | UP200Ht, UP400St |
اتصل بنا! / اسألنا!
الأدب / المراجع
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
حقائق تستحق المعرفة
ما هي البلازميدات؟
البلازميد هو جزيء DNA دائري صغير منفصل فيزيائيا عن الحمض النووي الكروموسومي ويتضاعف بشكل مستقل. غالبا ما ترتبط البلازميدات بالجينات التي تساهم في بقاء الكائن الحي وتضفي مزايا محددة ، مثل مقاومة المضادات الحيوية. توجد البلازميدات بشكل شائع كجزيئات DNA دائرية صغيرة مزدوجة الشريط في البكتيريا. ومع ذلك ، توجد البلازميدات في بعض الأحيان في الكائنات الحية القديمة وحقيقية النواة. البلازميدات هي أدوات مهمة في البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة والكيمياء الحيوية وعلوم الحياة. تعرف البلازميدات باسم النواقل في الهندسة الوراثية ، وتستخدم لتكرار أو التعبير عن جينات معينة. يسمى التغيير المستهدف للمتجه تصميم المتجه.
تحليل GFP في أبحاث الخلايا
بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) هو علامة بيولوجية متعددة الاستخدامات لمراقبة العمليات الفسيولوجية ، وتصور توطين البروتين ، والكشف عن التعبير الوراثي في الجسم الحي. يمكن إثارة GFP بواسطة خط الليزر 488 نانومتر ويتم اكتشافه على النحو الأمثل عند 510 نانومتر.
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع الخالط بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء من المختبر ل الحجم الصناعي.