Virusvacciner baserade på cellodling – Effektiv celluppbrytning med ultraljudsbehandling

Vanliga frågor om ultraljudsbaserad celluppbrytning vid tillverkning av virusbaserade vacciner

Vad är ultraljudsbaserad celluppbrytning?

Vid celluppbrytning med ultraljud används högintensivt ultraljud, vanligtvis i frekvensområdet 20–30 kHz, för att bryta upp cellmembran och frigöra intracellulärt material. Kraftfulla ultraljudsvågor skapar kavitationsbubblor i vätskan. När dessa bubblor kollapsar genererar de intensiva lokala skjuvkrafter och mikroströmmar som mekaniskt bryter upp cellerna och främjar massöverföring mellan cellens inre och det omgivande mediet. Vid vaccinproduktion används detta för att lysera virusinfekterade cellkulturer och för att frigöra intracellulära och membranbundna viruspartiklar till skörden.

Varför använda ultraljudsbehandling istället för kemisk eller enzymatisk lysering vid virusutvinning?

Ultraljudsbehandling fungerar med rent mekaniska krafter. Det krävs inga tvättmedel, lysozym, proteinas K eller andra lyseringsreagenser som kan förändra lysatet, störa efterföljande reningssteg eller behöva avlägsnas före vidare bearbetning. Kemiska reagenser kräver vanligtvis tidskrävande förberedelser i flera steg för att förhindra hämning av efterföljande analyser och andra steg efter bearbetningen. Enzymatisk nedbrytning kräver långa inkubationstider och ger ofta icke-reproducerbara resultat. Ultraljudslysering sammanför dessutom stegen resuspension, nedbrytning och extraktion till en enda kontinuerlig process. Om din process kräver ett steg med tvättmedel eller enzymer förstärker ultraljudsbehandlingen detta snarare än att ersätta det: kavitation försvagar membranen och förbättrar den jämna exponeringen av alla celler för reagenset.

Hur skiljer sig ultraljudsbehandling från mekaniska homogeniseringsmetoder?

Ultraljudsapparater av sondtyp överför ultraljudsenergi direkt och effektivt, eftersom sonotroden står i direkt kontakt med provet. Mekaniskt drivna homogeniseringstekniker leder ofta till lägre energieffektivitet. Ultraljudsbehandling kräver inga förbrukningsartiklar som slipkulor eller roterande tätningar i produktströmmen, inga munstycken eller kamrar som kan sättas igen av viskös cellmassa och ingen korskontaminering mellan satser.

Kan ultraljudsbehandling skada viruset eller antigenet?

Detta är den centrala optimeringsuppgiften, och den går att styra. Genom att justera parametrarna för ultraljudsbehandlingen kan effekterna av ultraljudsbehandlingen kontrolleras exakt: låg amplitud och kort behandlingstid ger mycket milda effekter, medan höga amplituder, förhöjt tryck och längre behandlingsvaraktighet resulterar i intensiv bearbetning. Eftersom intensiteten kan anpassas exakt efter det biologiska provet undviks överbehandling, nedbrytning och utbytesförlust. I praktiken ställs amplitud, uppehållstid och antal genomgångar in på det minimum som uppnår den önskade uppbrytningsgraden, med kontinuerlig temperaturövervakning och kylning.

Minskar ultraljudsbehandlingen viskositeten hos skörden?

Ja. Koncentrerade skördar med hög celltäthet är viskösa och svåra att pumpa på grund av frigjort, ofragmenterat värdcells-DNA. Ultraljudsbehandlingen skär och fragmenterar DNA och RNA, samtidigt som den löser upp cellmassan och bryter upp cellrester. Resultatet blir en homogen, pumpbar suspension som underlättar klarning, centrifugering och kromatografi på ett mer effektivt sätt. Fragmentering av DNA och RNA genom kontrollerad ultraljudsbehandling är en väl etablerad laboratorietillämpning av samma teknik.

Kan jag köra processen i kontinuerligt inline-läge?

Ja. Hielschers ultraljudsenheter är konstruerade för kontinuerlig drift dygnet runt i industriella miljöer och kan konfigureras med flödesceller och reaktorer för kontinuerlig inline-ultraljudsbehandling, återcirkulationsslingor eller integration i produktionsmoduler och processlinjer. Både enkel- och flerpassdrift är möjliga.

Hur går jag vidare från laboratoriet till produktion?

Linjärt, baserat på mätbar energitillförsel. Alla ultraljudsbehandlingsresultat som uppnås med en ultraljudshomogenisator från Hielscher kan skalas upp linjärt till högre genomströmningar vid industriell tillverkning; ultraljudsparametrar som tagits fram med en bänkskalssonikator kan överföras direkt till större Hielscher-system. Kriteriet för uppskalningen är den specifika energitillförseln per volym, tillsammans med amplitud, uppehållstid och temperatur. Hielschers processrådgivning omfattar rekommendationer för parameteroptimering (amplitud, specifik energi E/V, uppehållstid, temperatur- och tryckreglering) kopplade till mätbar energitillförsel.

Är celluppbrytning med ultraljud lämplig för tillverkning i renrum och enligt GMP-standarder?

Hielschers ultraljudsenheter kan enkelt installeras i renrumslaboratorier och produktionsanläggningar. Höljena är tillverkade av antibakteriell plast eller rostfritt stål. Alla delar som kommer i kontakt med vätska, såsom sonotroder och flödesceller, är tillverkade av titan eller rostfritt stål och kan autoklaveras. Det finns speciella flödescellsreaktorer som uppfyller avancerade CIP- (clean-in-place) och SIP-krav (sterilize-in-place). Omvandlaren i den industriella UIP-serien har skyddsklass IP64 och kan installeras i krävande miljöer medan generatorn placeras på avstånd. Eftersom Hielschers ultraljudsenheter omvandlar elektrisk energi till mekanisk svängning med en mycket hög verkningsgrad på cirka 80–90 % från eluttaget till vätskan, kan givaren byggas in i slutna höljen utan ventilationsgaller, och ingen forcerad kylning, såsom tryckluft eller vatten, behövs. Detta innebär också att inget kylmedium kommer i kontakt med processen. Automatisk processdokumentation underlättar spårbarhet och reproducerbarhet vid reglerad tillverkning.

Kan ultraljudsbehandling även inaktivera viruset för ett inaktiverat vaccin?

Ja. Kraftfullt ultraljud används för inaktivering av patogener såsom bakterier och virus. Med rätt dos och intensitet av ultraljudsbehandlingen kan celler och mikrober behandlas i enlighet med processmålet, vilket innebär att samma plattform kan användas både för lysering i syfte att utvinna material och för inaktivering. Kombinationen av ultraljud och värme, så kallad termosonikering, ger en snabbare sterilisering med avsevärt lägre värmeintensitet och kortare varaktighet, vilket är fördelaktigt för att bevara värmekänsliga föreningar såsom proteiner och antigener. Ultraljudsinaktivering används i allmänhet i kombination med etablerad inaktiveringskemi, och den fullständiga inaktiveringskinetiken måste valideras för varje specifikt virus.

Kan samma system användas för beredningsstegen efter skörden?

Ja. Samma plattform hanterar spridning av antigen i suspensioner, polymerer eller liposomala inkapslingar, deagglomerering och jämn fördelning av antigener och aluminiumbaserade adjuvanter såsom Alhydrogel™, formulering av vacciner till liposomer och nanopartiklar av fasta lipider med exakt kontroll över bärarstorleken samt avgasningssteget före fyllning i ampuller eller sprutor.