Формирање амилоидних фибрила помоћу УИП400МТП Мицроплате Соницатор

Амилоидна влакна, слично као кристали, формирају се кроз процес нуклеације и накнадног раста. Међутим, због високе слободне енергетске баријере нуклеације, спонтано формирање амилоидних фибрила се јавља тек након продужене фазе кашњења. Ултразвук се појавио као моћно средство за изазивање нуклеације амилоида, чиме се значајно убрзава формирање фибрила. Када се комбинује са читачем микроплоча који користи флуоресценцију тиофлавина Т (ТхТ), ултразвучна обрада омогућава детекцију амилоидних фибрила високе пропусности у више узорака истовремено.

Ултразвучно индуковано формирање амилоидних фибрила помоћу УИП400МТП микроплоче Соницатор

Са УИП400МТП соникатором плоча са више бунара, амилоидна фибрила истог квалитета у великим количинама могу се брзо синтетизовати у истраживачке сврхе. Овај ефикасан приступ омогућава проучавање амилоидогености протеина. Ова техника олакшава брзу и поновљиву амилоидну фибрилацију, као што је показано са β2-микроглобулином (β2-м), амилоидогеним протеином повезаним са амилоидозом повезаном са дијализом.

Једноставан експериментални приступ: ултразвучно индукована амилоидна фибрилација

Да би се изазвало формирање фибрила, микроплоча са 96 јажица постављена је у центар ултразвучног уређаја за плоче УИП400МТП са више бунара, који обезбеђује уједначену ултразвучну експозицију у свим бунарчићима. Експериментални услови су били следећи:

1. Сваки бунар је садржао 0,2 мл раствора β2-микроглобулина (0,3 мг/мл, пХ 2,5) допуњеног са 5 μМ ТхТ.
2. Плоча је подвргнута циклусима ултразвучне обраде, као што је 1-минутна ултразвучна обрада након чега је уследила пауза од 9 минута.
3. После соникације, ТхТ флуоресценција је мерена коришћењем читача микроплоче.

(уп. Со ет ал., 2011)

Поређење са конвенционалном агитацијом

У поређењу са традиционалним методама мешања, ултразвук је драстично смањио фазу кашњења формирања фибрила. Под конвенционалним условима мућкања микроплоче, само 1 од 10 бунарчића је показало повећану флуоресценцију ТхТ након 20 сати. Насупрот томе, коришћењем циклусне ултразвучне обраде (15 минута соникације праћено 5 минута мировања), значајно повећање флуоресценције ТхТ откривено је одмах након првог третмана ултразвуком.

Брзо убрзање кинетике фибрилације

Резултати добијени од Со ет ал. (2011) су показали да се спонтано формирање фибрила β2-микроглобулина при пХ 2,5 може убрзати са неколико сати на само 10–15 минута ултразвучном обрадом.
Слике микроскопије атомске силе (АФМ) потврдиле су да се фибрила генерисана ултразвуком у трајању од 10 минута сваких 15 минута морфолошки не разликују од оних формираних коришћењем 1-минутне ултразвучне обраде сваких 10 минута. Ово наглашава поновљивост и робусност ултразвучно индуковане амилоидне фибрилације.

АФМ слике амилоидних фибрила произведене 1-минутном ултразвуком сваких 10 мин (и), 10-минутном ултразвуком сваких 15 мин (ии), и реакцијом засијавања без ултразвучне обраде (иии). Бела трака скале представља 1 μм.
Студија и слике: ©Со ет ал., 2011

Фибрилација у неутралним пХ условима

Чак и под неутралним пХ условима, формирање фибрила је постигнуто након времена кашњења од 1,5 сати, што показује да ултразвук значајно смањује енергетску баријеру за нуклеацију и раст. Ово даље подржава хипотезу да је амилоидна фибрилација првенствено физичка реакција, у великој мери ограничена енергетском баријером нуклеације, коју ултразвук ефикасно смањује.

Утицај на истраживање болести повезаних са амилоидом

Лако и поуздано формирање амилоидних фибрила коришћењем ултразвучног апарата за микроплоче УИП400МТП има значајне импликације за истраживање Алцхајмерове болести (АД) и других поремећаја повезаних са амилоидом, као што су Паркинсонова болест, дијабетес типа ИИ и системске амилоидоза. У АД, агрегација амилоида-β (Аβ) је кључни патолошки знак, али проучавање његове кинетике фибрилације остаје изазовно због дугих фаза кашњења и варијабилности у конвенционалним методама. Формирање фибрила вођено ултразвуком убрзава нуклеацију, обезбеђујући високу репродуктивност и смањену варијабилност, што је кључно за скрининг потенцијалних инхибитора и разумевање амилоидогених механизама. Штавише, способност високе пропусности УИП400МТП омогућава истраживања великих размера погрешног савијања и агрегације протеина, олакшавајући откривање терапеутских агенаса који могу да модулишу формирање фибрила и потенцијално ублаже неуродегенеративну прогресију.

Ова студија утврђује ултразвучну обраду помоћу УИП400МТП ултразвучног уређаја за плоче са више бунара као високоефикасну методу за убрзавање формирања амилоидних фибрила. Кључне предности овог приступа укључују:

• Драматично смањење времена кашњења за фибрилацију.
• Уједначено излагање ултразвуку у свим бунарима, омогућавајући поновљиво формирање фибрила.
• Могућност скрининга високе пропусности, што га чини погодним за претрагу амилоидогености протеина у целом геному.

Интеграцијом ултразвучне обраде са детекцијом флуоресценције ТхТ, овај метод обезбеђује брзу, скалабилну и поуздану платформу за проучавање амилоидне фибрилације. С обзиром на његову ефикасност и потенцијал високог протока, овај приступ може олакшати лакшу синтезу амилоидних фибрила за биофизичка и фармацеутска истраживања, нудећи обећавајући алат за студије у вези са амилоидом и скрининг лекова.