Формирање амилоидних фибрила помоћу соникатора за микроплоче UIP400MTP

Амилоидне фибриле, слично кристалима, настају процесом нуклеације и накнадног раста. Међутим, због високе баријере слободне енергије за нуклеацију, спонтано формирање амилоидних фибрила одвија се тек након продужене латентне фазе. Ултразвучни третман се показао као моћно средство за индуковање нуклеације амилоида, чиме се значајно убрзава формирање фибрила. У комбинацији са читачем микроплоча који користи флуоресценцију тиофлавина Т (ThT), ултразвучни третман омогућава детекцију амилоидних фибрила уз високу пропусност, истовремено у више узорака.

Ултразвучно индуковано формирање амилоидних фибрила помоћу соникатора за микроплоче UIP400MTP

Помоћу соникатора за плоче са више бунарчића UIP400MTP могуће је брзо синтетисати велике количине амилоидних фибрила уједначеног квалитета за потребе истраживања. Овај ефикасан приступ омогућава проучавање амилоидогености протеина. Ова техника олакшава брзу и репродуктивну амилоидну фибрилацију, као што је показано на β2-микроглобулину (β2-m), амилоидогеном протеину повезаном са амилоидозом услед дијализе.

Једноставан експериментални приступ: ултразвучно индукована амилоидна фибрилација

Да би се индуковало формирање фибрила, микроплоча са 96 бунарчића постављена је у средиште соникатора за плоче са више бунарчића UIP400MTP, који обезбеђује равномерно излагање ултразвуку у свим бунарчићима. Експериментални услови били су следећи:

1. Сваки бунарчић садржао је 0,2 ml раствора β2-микроглобулина (0,3 mg/ml, pH 2,5) уз додатак 5 μM ThT.
2. Плоча је подвргнута циклусима ултразвучног третмана, као што је 1 минут ултразвучног третмана након којег следи пауза од 9 минута.
3. Након соникације, флуоресценција ThT мерена је помоћу читача микроплоча.

(уп. So et al., 2011)

Поређење са конвенционалним мешањем

У поређењу са традиционалним методама мешања, ултразвучни третман драстично је скратио латентну фазу формирања фибрила. При конвенционалним условима протресања микроплоче, само је 1 од 10 бунарчића показао повећану флуоресценцију ThT након 20 сати. Насупрот томе, при примени цикличног ултразвучног третмана (15 минута соникације након којих следи 5 минута мировања), значајно повећање флуоресценције ThT детектовано је одмах након првог соникационог третмана.

Нагло убрзање кинетике фибрилације

Резултати које су добили So et al. (2011) показали су да се време потребно за спонтано формирање фибрила β2-микроглобулина при pH 2,5 може скратити са неколико сати на само 10–15 минута применом ултразвучног третмана.
Снимци добијени микроскопијом атомских сила (AFM) потврдили су да се фибриле настале ултразвучним третманом у трајању од 10 минута на сваких 15 минута морфолошки нису разликовале од оних насталих ултразвучним третманом у трајању од 1 минута на сваких 10 минута. Ово истиче репродуктивност и робусност ултразвучно индуковане амилоидне фибрилације.

AFM снимци амилоидних фибрила добијених ултразвучним третманом у трајању од 1 min на сваких 10 min (i), соникацијом у трајању од 10 min на сваких 15 min (ii) и реакцијом засејавања без ултразвучног третмана (iii). Бела скала представља 1 μm.
Студија и снимци: ©So et al., 2011

Фибрилација при неутралној pH вредности

Чак и при неутралној pH вредности, формирање фибрила постигнуто је након латентног периода од 1,5 сати, што показује да ултразвучни третман значајно снижава енергетску баријеру за нуклеацију и раст. Ово додатно подржава хипотезу да је амилоидна фибрилација првенствено физичка реакција, у великој мери ограничена енергетском баријером нуклеације, коју ултразвучни третман ефикасно снижава.

Утицај на истраживање болести повезаних са амилоидом

Једноставно и поуздано формирање амилоидних фибрила помоћу соникатора за микроплоче UIP400MTP има значајне импликације за истраживање Алцхајмерове болести (AD) и других поремећаја повезаних са амилоидом, као што су Паркинсонова болест, дијабетес типа II и системске амилоидозе. Код AD, агрегација амилоида-β (Aβ) представља кључно патолошко обележје, али проучавање кинетике његове фибрилације остаје изазовно због дугих латентних фаза и варијабилности конвенционалних метода. Формирање фибрила подстакнуто ултразвучним третманом убрзава нуклеацију, обезбеђујући високу репродуктивност и смањену варијабилност, што је од пресудног значаја за скрининг потенцијалних инхибитора и разумевање амилоидогених механизама. Поред тога, висока пропусност уређаја UIP400MTP омогућава обимна истраживања неправилног савијања и агрегације протеина, олакшавајући откривање терапијских агенаса који могу модулисати формирање фибрила и потенцијално ублажити напредовање неуродегенерације.

Ова студија потврђује да је ултразвучни третман помоћу соникатора за плоче са више бунарчића UIP400MTP веома ефикасна метода за убрзавање формирања амилоидних фибрила. Кључне предности овог приступа обухватају:

• Драстично скраћење латентног периода фибрилације.
• Равномерно излагање ултразвуку у свим бунарчићима, што омогућава репродуктивно формирање фибрила.
• Могућност скрининга са високом пропусношћу, што овај приступ чини погодним за испитивање амилоидогености протеина на нивоу целог генома.

Комбиновањем ултразвучног третмана са детекцијом флуоресценције ThT, ова метода пружа брзу, скалабилну и поуздану платформу за проучавање амилоидне фибрилације. С обзиром на ефикасност и потенцијал за високу пропусност, овај приступ може олакшати једноставну синтезу амилоидних фибрила за биофизичка и фармацеутска истраживања, пружајући обећавајуће средство за истраживања повезана са амилоидом и скрининг лекова.