ПМЦА за детекцију приона високог протока помоћу УИП400МТП Соницатор-а

УИП400МТП соникатор плоча са више бунара нуди моћно решење за припрему узорака високог протока у цикличној амплификацији погрешно савијања протеина (ПМЦА). Пружајући уједначену дистрибуцију енергије у више бунара и одржавајући прецизне параметре соникације, овај систем омогућава истовремену обраду бројних узорака са изузетном поновљивошћу. Ове способности су критичне за оптимизацију ПМЦА за откривање приона у ниским концентрацијама у изазовним биолошким узорцима, као што је пљувачка, где инхибитори анализе могу да прикрију резултате.

Прионске болести, као што је болест хроничног трошења (ЦВД) код грлића и Цреутзфелдт-Јакобова болест (ЦЈД) код људи, су неуродегенеративни поремећаји узроковани погрешно савијеним прионским протеинима (ПрП^Сц). Ове болести често укључују низак ниво инфективних приона у телесним течностима, као што су пљувачка, крв и урин, што компликује дијагнозу и истраживање. Хоризонтални пренос ЦВД кроз прионе који се налазе у матрицама животне средине има посебно значајне импликације на управљање дивљим животињама и еколошко здравље. Слично томе, код болести као што је Цреутзфелдт-Јакобова болест, поуздана амплификација погрешно савијених прионских протеина из људских узорака је кључна за унапређење дијагностике и разумевање прогресије болести.

Примена модификованог ПМЦА протокола омогућава да се заобиђу уобичајени инхибитори теста (нпр. муцини у пљувачки) и постигне висока осетљивост у откривању приона који би иначе били неоткривени или двосмислени коришћењем техника као што је конверзија изазвана потресом у реалном времену (РТ-КуИЦ). Овај напредак побољшава откривање приона за различите болести, чинећи ПМЦА незаменљивим алатом за истраживање и дијагностику приона. Соникатор плоча са више јажица УИП400МТП олакшава ПМЦА ултразвучну обраду бројних узорака у микроплочама (нпр. плочама са 6, 24 или 96 јажица) или бочицама у сталку за епрувете.

Протокол за цикличну амплификацију погрешно савијања протеина високог протока (ПМЦА)

Следећи протокол омогућава ефикасну обраду великог броја узорака под потпуно истим условима за робусне резултате истраживања.

Припрема узорка

Почетни материјал:
Припремите узорке тако што ћете:

• Ресуспендовање пелета за екстракцију саркозила у ПМЦА супстрату.
• Директно сипање хомогената мозга или узорака крви са семенима приона.

Подлога:

• Користите 10% (тежина/запремни) хомогенат мозга припремљен од трансгених мишева који прекомерно експримирају ПрП^Ц (нпр. Тг мишеви).
• Хомогенизирати мождано ткиво у:
  – 1× ПБС.
  – 150 мМ НаЦл.
  – 1% Тритон Кс-100.
• Чувати подлогу на -80ºЦ до употребе.

Постављање узорка у микроплочи или епруветама:
цеви:

• Додајте 90 μЛ супстрата хомогената мозга и засијајте са 10 μЛ узорка (нпр. крв, хомогенат мозга или саркосил пелета).
• Ставите 3 тефлонске перле (пречника 1,59 мм или 2,38 мм) у сваку епрувету од 0,2 мЛ.
• Монтирајте цеви у сталак компатибилан са УИП400МТП соникатором.

Микроплоча са 6 јажица:

• Додати 5 мЛ супстрата хомогената мозга и засејати са 500 μЛ узорка по бунарчићу.
• Додајте 3 тефлонске перле у сваки бунар.

ПМЦА процедура

Пласман:
Ставите сталак за епрувету или микроплочу са 6 јажица у соникатор УИП400МТП према упутствима произвођача.

Бициклистички програм:
Извршите 144 ПМЦА циклуса на следећи начин:

• Инкубација: 29 минута и 30 секунди на 37°Ц.
• Соникација: 30 секунди при 60% амплитуде.
• Праћење температуре: Користите температурни сензор који се може прикључити да надгледате температуру узорка и програмирајте УИП400МТП на макс. температура од 48-50°Ц.

Наредне рунде:
Након завршетка првог круга од 144 циклуса, пренесите аликвот појачаног материјала:

• Разблажите 10 пута у свеж супстрат хомогеног трансгеног мозга миша.
• Извршите 96 ПМЦА циклуса за наредне рунде, одржавајући исте параметре соникације.
• Наставите до жељеног броја рунди (обично до 5).

Детекција ПрП^Сц

1. Варење протеиназе К:
   – Третирајте узорке са Протеиназом К (50 μг/мЛ) на 37°Ц током 1 сата.
   – Прекините варење додавањем СДС пуфера за узорке и кључањем 10 минута.
2. Вестерн блот анализа:
   – Анализирајте пробављене узорке користећи:
   – 6Х4 или ПРЦ1 анти-ПрП антитела.
   – Урадите СДС-ПАГЕ и пренесите на ПВДФ мембране ради детекције.

 

 

Обрадите више узорака за робусније резултате

УИП400МТП соникатор плоча са више бунара значајно побољшава ефикасност и скалабилност цикличне амплификације погрешно савијања протеина (ПМЦА), решавајући традиционално дуготрајну природу процедуре. Омогућавајући истовремену обраду до 96 узорака у плочи са 96 бунарчића, систем поједностављује ПМЦА радне токове док одржава прецизне и уједначене услове соникације у свим бунарима. Ова способност високе пропусности минимизира ручно руковање, смањује радно интензивне кораке и осигурава поновљивост, што га чини незаменљивим алатом за истраживање приона. Било да истражује хроничну болест исцрпљивања или Кројцфелд-Јакобову болест, УИП400МТП олакшава студије великих размера са већом ефикасношћу, омогућавајући истраживачима да испуне захтеве савремених дијагностичких и научних примена.

---

---

Литература / Референце

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.