PMCA за детекцију приона уз велику пропусност узорака помоћу соникатора UIP400MTP

Соникатор UIP400MTP за плоче са више бунарчића нуди снажно решење за припрему узорака уз велику пропусност у цикличној амплификацији погрешно савијених протеина (PMCA). Равномерном расподелом енергије у више бунарчића и одржавањем прецизних параметара соникације, овај систем омогућава истовремену обраду бројних узорака уз изузетну поновљивост. Ове могућности су кључне за оптимизацију PMCA ради детекције приона у ниским концентрацијама у захтевним биолошким узорцима, попут пљувачке, у којима инхибитори теста могу прикрити резултате.

Прионске болести, попут хроничне болести исцрпљивања (CWD) код јелена и сродних врста и Кројцфелд–Јакобове болести (CJD) код људи, јесу неуродегенеративни поремећаји узроковани погрешно савијеним прионским протеинима (PrP^Sc). Ове болести често подразумевају ниске нивое инфективних приона у телесним течностима, попут пљувачке, крви и урина, што отежава дијагностику и истраживање. Хоризонтално преношење CWD путем приона који се излучују у матриксе животне средине има нарочито значајне последице по управљање популацијама дивљих животиња и здравље екосистема. Слично томе, код болести попут Кројцфелд–Јакобове болести, поуздана амплификација погрешно савијених прионских протеина из људских узорака кључна је за унапређење дијагностике и разумевање напредовања болести.

Олакшајте MBEC тестове поузданим и брзим одвајањем биофилма помоћу соникатора UIP400MTP за микроплоче. UIP400MTP може да обрађује било коју стандардну плочу за тестирање и ефикасно одваја ћелије и биофилмове.

Примена модификованог PMCA протокола омогућава превазилажење деловања уобичајених инхибитора теста (нпр. муцина у пљувачки) и постизање високе осетљивости при детекцији приона који би иначе остали недетектовани или би дали неодређене резултате применом техника попут конверзије изазване мућкањем у реалном времену (RT-QuIC). Ова унапређења побољшавају детекцију приона код различитих болести, чинећи PMCA незаменљивим алатом за истраживање и дијагностику прионских болести. Соникатор UIP400MTP за плоче са више бунарчића олакшава PMCA уз велику пропусност узорака, соникацијом бројних узорака у микроплочама (нпр. плочама са 6, 24 или 96 бунарчића) или бочицама у сталку за епрувете.

Протокол за цикличну амплификацију погрешно савијених протеина (PMCA) уз велику пропусност узорака

Следећи протокол омогућава ефикасну обраду великог броја узорака под потпуно истим условима ради добијања поузданих резултата истраживања.

Припрема узорака

Полазни материјал:
Припремите узорке на следеће начине:

Ресуспендовањем талога добијених саркозилном екстракцијом у PMCA супстрату.
Директним додавањем прионских семена хомогенатима мозга или узорцима крви.

Супстрат:

Користите 10% (wt/vol) хомогенат мозга припремљен од трансгених мишева са прекомерном експресијом PrP^C (нпр. Tg мишеви).
Хомогенизујте мождано ткиво у:
– 1× PBS.
– 150 mM NaCl.
– 1% Triton X-100.
Чувајте супстрат на -80ºC до употребе.

Постављање узорака у микроплочу или епрувете:
Епрувете:

Додајте 90 μL супстрата хомогената мозга и засејте са 10 μL узорка (нпр. крви, хомогената мозга или саркозилног талога).
Ставите 3 тефлонске куглице (пречника 1,59-mm или 2,38-mm) у сваку епрувету од 0,2 mL.
Поставите епрувете у сталак компатибилан са соникатором UIP400MTP.

Микроплоча са 6 бунарчића:

Додајте 5 mL супстрата хомогената мозга и засејте са 500 μL узорка по бунарчићу.
Додајте 3 тефлонске куглице у сваки бунарчић.

Поступак PMCA

Постављање:
Поставите сталак са епруветама или микроплочу са 6 бунарчића у соникатор UIP400MTP према упутствима произвођача.

Програм циклуса:
Спроведите 144 PMCA циклуса на следећи начин:

Инкубација: 29 минута и 30 секунди на 37°C.
Соникација: 30 секунди при амплитуди од 60%.
Пратите температуру: Користите прикључни температурни сензор за праћење температуре узорка и програмирајте UIP400MTP на максималну температуру од 48–50°C.

Наредне рунде:
Након завршетка прве рунде од 144 циклуса, пренесите аликвот амплификованог материјала:

Разблажите 10 пута у свежем супстрату хомогената мозга трансгених мишева.
Спроведите 96 PMCA циклуса за наредне рунде, одржавајући исте параметре соникације.
Наставите до жељеног броја рунди (обично до 5).

Детекција PrP^Sc

Дигестија протеиназом K:
– Третирајте узорке протеиназом K (50 μg/mL) на 37°C током 1 сата.
– Прекините дигестију додавањем SDS пуфера за узорке и кувањем током 10 минута.
Вестерн блот анализа:
– Анализирајте дигестоване узорке користећи:
– 6H4 или PRC1 анти-PrP антитела.
– Спроведите SDS-PAGE и пренос на PVDF мембране ради детекције.

Hielscher UIP400MTP је најприлагодљивији соникатор за ваше плоче са више бунарчића, PCR плоче или епрувете за узорке. Са 400 вати непрекидне снаге соникације, намењен је применама као што су лиза ћелија, емулговање, екстракција протеина, фрагментација DNA / RNA, деагломерација, екстракција из FFPE узорака, одвајање ћелија и биофилмова или емулговање. UIP400MTP није ултразвучно купатило. То је чашаста сонотрода високог интензитета за усмерену соникацију. Овај снажан бесконтактни соникатор обезбеђује равномерну соникацију у свим бунарчићима ваше стандардне плоче. Имате прецизну контролу над амплитудом, снагом и пулсним радом. Уграђени тајмер и температурна сонда обезбеђују уједначене резултате. Соникатор за плоче UIP400MTP хлади узорке помоћу воденог купатила, уз могућност додавања спољног расхладног уређаја.

Обрадите више узорака за поузданије резултате

Соникатор UIP400MTP за плоче са више бунарчића значајно повећава ефикасност и скалабилност цикличне амплификације погрешно савијених протеина (PMCA), решавајући проблем традиционално дуготрајног поступка. Омогућавајући истовремену обраду до 96 узорака у плочи са 96 бунарчића, систем поједностављује радне токове PMCA уз одржавање прецизних и уједначених услова соникације у свим бунарчићима. Ова могућност обраде великог броја узорака своди ручно руковање на минимум, смањује број радно захтевних корака и обезбеђује поновљивост, чинећи систем незаменљивим алатом за истраживање приона. Било да се истражује хронична болест исцрпљивања или Кројцфелд–Јакобова болест, UIP400MTP олакшава спровођење студија великог обима уз већу ефикасност, омогућавајући истраживачима да испуне захтеве савремених дијагностичких и научних примена.

Повезане теме

Литература / Референце

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Често постављана питања

Шта су приони?

Приони су погрешно савијени протеини који могу да изазову абнормално савијање нормалних ћелијских протеина, нарочито у мозгу. За разлику од бактерија или вируса, приони немају нуклеинске киселине и умножавају се механизмом у коме сами служе као шаблон, што доводи до прогресивних неуродегенеративних болести као што су Кројцфелд–Јакобова болест, говеђа спонгиформна енцефалопатија (болест лудих крава) и скрепи код оваца. Њихова отпорност на стандардне поступке стерилизације наглашава њихову јединствену патогеност и представља значајан изазов у медицинским и истраживачким установама.

Шта је техника PMCA?

Циклична амплификација погрешно савијених протеина (PMCA) јесте лабораторијска техника која се користи за амплификацију погрешно савијених прионских протеина (PrP^Sc) in vitro. Она опонаша претварање нормалног ћелијског прионског протеина (PrP^C) у његов погрешно савијени инфективни облик (PrP^Sc), што је карактеристично обележје прионских болести. Процес обухвата циклусе инкубације и соникације ради убрзавања агрегације PrP^Sc, што га чини моћним алатом за детекцију ниских нивоа приона.

Погрешно савијање ког протеина узрокује Кројцфелд–Јакобову болест?

Кројцфелд–Јакобова болест (CJD) узрокована је погрешним савијањем прионског протеина (PrP). Нормална изоформа (PrP^C) поприма абнормалну конформацију богату β-плочама (PrP^Sc) која постаје инфективна, стварајући амилоидне агрегате у мозгу, што доводи до неуродегенерације.

Шта је циклична амплификација погрешно савијених протеина код инфективних приона?

Циклична амплификација погрешно савијених протеина (PMCA) јесте метода за амплификацију инфективног облика приона (PrP^Sc) поновљеном инкубацијом нормалног PrP^C са малим количинама PrP^Sc. Током сваког циклуса, PrP^Sc катализује погрешно савијање PrP^C, а соникација фрагментише агрегате, стварајући више места за започињање агрегације. То опонаша репликацију приона in vivo и омогућава осетљиву детекцију приона у биолошким узорцима.

Шта узрокује погрешно савијање PrP?

Погрешно савијање PrP у патогени облик PrP^Sc може бити изазвано следећим факторима:

Спонтаним погрешним савијањем код спорадичних прионских болести.
Генетским мутацијама у гену PRNP (нпр. код породичних прионских болести).
Излагањем инфективном PrP^Sc путем контаминиране хране, медицинских поступака или на друге начине.
Факторима средине или структурним факторима, попут pH, јона метала или кофактора који дестабилизују PrP^C.

Шта је тест RT-QuIC?

Конверзија изазвана мућкањем у реалном времену (RT-QuIC) јесте високоосетљив дијагностички тест за прионске болести. Њиме се детектује PrP^Sc амплификацијом његове способности да претвара рекомбинантни PrP^C у погрешно савијене агрегате. Тест користи детекцију настанка амилоидних фибрила засновану на флуоресценцији, што га чини корисним за дијагностиковање болести попут CJD у цереброспиналној течности (CSF) или другим ткивима.