Izboljšajte analizo HPLC z zanesljivo pripravo vzorcev
Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ostaja ena najpomembnejših analiznih tehnik za identifikacijo in kvantifikacijo spojin v kompleksnih matriksih. Metode HPLC so cenjene zaradi svoje občutljivosti, selektivnosti in ponovljivosti, od nadzora kakovosti v farmaciji do spremljanja stanja okolja in analize živil. Vendar je zanesljivost kromatografskih podatkov močno odvisna od enega ključnega koraka: priprave vzorcev za HPLC.
Raziskave in rutinski postopki priprave vzorcev kažejo, da ekstrakcija in priprava vzorcev s pomočjo sonikacije bistveno izboljšata učinkovitost, točnost in hitrost analize HPLC. Z uporabo ultrazvočne energije za razgradnjo matriksov in izboljšanje prenosa analitov v topila lahko laboratoriji dosežejo višje izkoristke, krajše čase ekstrakcije in bolj ponovljive analizne rezultate.
Zakaj je priprava vzorcev pomembna pri HPLC
V številnih analiznih postopkih matriks vzorca – na primer rastlinski material, biološko tkivo, tla ali voda – vsebuje kompleksne zmesi spojin, ki lahko motijo kromatografsko ločevanje. Zato je učinkovita priprava vzorcev potrebna za izolacijo analitov, odstranitev motečih snovi in koncentriranje ciljnih spojin pred injiciranjem v sistem HPLC.
Tradicionalne ekstrakcijske tehnike pogosto vključujejo dolgotrajne postopke, velike volumne organskih topil in več korakov čiščenja. Te metode lahko povzročijo variabilnost, povečajo obratovalne stroške in podaljšajo skupni čas analize.
Ultrazvočna priprava vzorcev ponuja učinkovito alternativo. Sonikacija v tekoči medij vnaša visokofrekvenčno akustično energijo, pri čemer nastajajo mikroskopski kavitacijski mehurčki. Ko se ti mehurčki sesedejo, ustvarijo lokalizirane strižne sile in učinke mikromešanja, ki razgradijo trdne matrikse in pospešijo prenos snovi. Ta proces izrazito izboljša učinkovitost ekstrakcije.
Sonikator UIP400MTP z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev s stojalom za viale samodejnega vzorčevalnika
Znanstveni dokazi: sonikacija izboljša analizno zmogljivost
Več recenziranih študij je pokazalo prednosti ultrazvočne ekstrakcije v postopkih HPLC.
Na primer, metoda, razvita za spremljanje ostankov pesticidov v vzorcih vode, je uporabljala sonikacijo v kombinaciji z analizo LC–MS/MS za določanje koncentracij pesticida karbarila. Pri tem pristopu so vzorce vode pred kromatografsko analizo ekstrahirali z acetonitrilom ob ultrazvočni obdelavi. Metoda je dosegla visoko analizno zmogljivost, vključno z izkoristki med 89,53% in 101,72%, kar potrjuje točnost in zanesljivost postopka ultrazvočne priprave vzorcev.
Korak ultrazvočne ekstrakcije je omogočil učinkovit prenos analitov iz vodnega matriksa v organsko topilo, s čimer je zmanjšal porabo topil in odpravil potrebo po obsežnih postopkih čiščenja. Validirana analizna metoda je pokazala odlično linearnost, natančnost in meje kvantifikacije, kar poudarja učinkovitost sonikacije v sodobnih kromatografskih postopkih. (prim. Roudani et al., 2018)
Druga študija je uvedla disperzijo matriksa v trdni fazi s pomočjo ultrazvoka (UA-MSPD) za določanje oleuropeina v oljčnih listih z analizo HPLC. Pri tej tehniki so rastlinski prah in sorbent zmešali ter ju nato med korakom eluiranja izpostavili ultrazvočnim valovom. Ultrazvok je izboljšal desorpcijo analita s površine sorbenta in hkrati izboljšal ekstrakcijo iz matriksa vzorca. (prim. Rashidipour in Heydari, 2018)
Optimizirani ultrazvočni postopek je prinesel pomembne analizne izboljšave, vključno z:
- Linearnimi umeritvenimi krivuljami z R² = 0,9979
- Mejami zaznavnosti že pri 0,03 µg mL⁻¹
- Izkoristki med 90,2% in 96,7%
Ti rezultati potrjujejo, da ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka ne le pospeši pripravo vzorcev, temveč tudi poveča izkoristek ekstrakcije v primerjavi s klasičnimi tehnikami disperzije matriksa v trdni fazi.
Sonikator UP200St s sondo za pripravo vzorcev za HPLC
Ključne prednosti ultrazvočne priprave vzorcev za HPLC
Vse širšo uporabo ultrazvočne ekstrakcije v analiznih laboratorijih spodbuja več merljivih prednosti.
- Višja učinkovitost ekstrakcije
Akustična kavitacija razgrajuje trdne matrikse in izboljša prodiranje topila. To izboljša sproščanje analitov in poveča izkoristke, zlasti pri spojinah v sledovih v kompleksnih vzorcih. - Krajši čas priprave vzorcev
Z ultrazvočno ekstrakcijo je pogosto mogoče dokončati pripravo vzorcev v nekaj sekundah ali minutah. Na primer, optimizirani parametri ultrazvočne ekstrakcije pri UA-MSPD so omogočili učinkovit izkoristek analitov v približno 30 sekundah sonikacije, kar kaže, kako izrazito je mogoče pospešiti analizne postopke. - Manjša poraba topil
Ker ultrazvok izboljša prenos snovi, so običajno potrebni manjši volumni topil. Zmanjšana uporaba topil izboljša trajnost laboratorijskega dela in zniža obratovalne stroške. - Izboljšana ponovljivost
Enakomerna porazdelitev ultrazvočne energije zagotavlja dosledno razgradnjo in ekstrakcijo vzorcev pri ponovitvah, kar vodi do boljše natančnosti analiznih meritev. - Združljivost s sodobnimi kromatografskimi metodami
Ultrazvočno ekstrakcijo je enostavno vključiti v sisteme HPLC, UHPLC in LC-MS, zato je primerna za analizna okolja z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev.
Kromatogram HPLC fenolnih spojin iz ekstrakta listov Annona muricata, izoliranega z ultrazvokom z uporabo ultrazvočne naprave UP400S.
(Študija in grafični prikaz: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktične rešitve za sonikacijo pri pripravi vzorcev za HPLC
Laboratorijem, ki uvajajo ultrazvočno ekstrakcijo, sonikatorji Hielscher omogočajo natančen nadzor parametrov, kot so amplituda, čas in pulzni način delovanja. Zato so laboratorijski sonikatorji Hielscher še posebej primerni za analizne laboratorije.
Izberite najprimernejši laboratorijski sonikator za svoje vzorce za HPLC
| Model sonikatorja | Prednosti za HPLC | Najprimernejša uporaba pri pripravi vzorcev za HPLC |
| Sonikator VialTweeter za več epruvet |
• Sočasna sonikacija do 10 zaprtih vial z enako ultrazvočno energijo • Sterilno: brez navzkrižne kontaminacije, ker vzorci ostanejo zaprti • Zelo ponovljivi pogoji ekstrakcije med serijami • Učinkovita kavitacija za analizne vzorce majhnega volumna |
• Priprava okoljskih, živilskih ali farmacevtskih vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave • Ekstrakcija analitov v sledovih pred analizo HPLC, UHPLC ali LC-MS • Standardizirani postopki, ki zahtevajo enako obdelavo več vzorcev |
| Sonikator UIP400MTP za mikroplošče |
• Brezkontaktna sonikacija celotnih mikroplošč (formati s 96 in 384 vdolbinicami) • Enakomerna porazdelitev ultrazvočne energije po vseh vdolbinicah • Omogoča avtomatizacijo in vključevanje robotike v analizne postopke • Visoka zmogljivost obdelave vzorcev z natančnim nadzorom amplitude in časa sonikacije |
• Presejalni postopki UHPLC z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev • Knjižnice farmacevtskih spojin in priprava vzorcev za metabolomiko • Ekstrakcija na ploščah za analizne postopke LC-MS ali UHPLC |
| Laboratorijski sonikatorji z mikrokonico (neposredna sonikacija) |
• Največja ultrazvočna intenzivnost za učinkovito razgradnjo matriksa • Zelo hitra ekstrakcija analitov iz trdnih, viskoznih ali heterogenih vzorcev • Nastavljivi parametri amplitude in pulziranja za optimizirane pogoje ekstrakcije • Visoka kavitacijska energija izboljša izkoristek analitov in ekstrakcije |
• Ekstrakcija iz zahtevnih matriksov, kot so rastlinsko tkivo, vzorci živil ali polimeri • Homogenizacija pred SPE, filtracijo ali ekstrakcijo tekoče–tekoče • Razvoj metod za ultrazvočno pripravo vzorcev za HPLC |
| CupHorn (“visokointenzivna kopel” za čaše in epruvete) |
• Posredna sonikacija preprečuje kontaminacijo sonde • Enakomerno ultrazvočno polje za več epruvet hkrati • Idealno za sterilne, nevarne ali hlapne vzorce, ki morajo ostati zaprti • Poenostavi rokovanje, hkrati pa ohranja visoko kavitacijsko energijo |
• Vzporedna ekstrakcija več vzorcev za HPLC v zaprtih centrifugirnih epruvetah • Priprava bioloških, farmacevtskih ali okoljskih vzorcev • Postopki, pri katerih je potrebna posredna sonikacija brez kontaminacije |
Znanstveni pomen za analizno kemijo
Ker se analizna kemija usmerja k hitrejšim in bolj trajnostnim laboratorijskim praksam, je ultrazvočna priprava vzorcev postala zmogljiva tehnologija, ki omogoča ta razvoj. Sonikacija podpira razvoj hitrih analiznih metod z manjšo porabo topil, izboljšano učinkovitostjo ekstrakcije in robustnimi validacijskimi parametri.
Vse obsežnejša literatura o ultrazvočni ekstrakciji kaže, da priprava vzorcev za HPLC s pomočjo sonikacije ni zgolj priročna – je znanstveno validiran pristop, ki izboljša analizno zmogljivost. S kombiniranjem ultrazvočne ekstrakcije s sodobnimi kromatografskimi tehnikami lahko laboratoriji dosežejo zanesljivo zaznavanje analitov v sledovih v vse bolj kompleksnih matriksih vzorcev.
Postopki HPLC, izboljšani s sonikacijo
Ob nenehnem napredku analiznih instrumentov in tehnologij priprave vzorcev bo ultrazvočna ekstrakcija verjetno imela še večjo vlogo v kromatografskih laboratorijih. Njena sposobnost poenostavljanja postopkov, izboljševanja kakovosti podatkov in zmanjševanja vpliva na okolje se dobro ujema z razvijajočimi se zahtevami sodobne analizne znanosti.
Analiznim kemikom in industrijskim laboratorijem, ki želijo optimizirati pripravo vzorcev za HPLC, ultrazvočna ekstrakcija ponuja preverjeno, prilagodljivo obsegu obdelave in znanstveno robustno rešitev. Z vključitvijo sonikacije v rutinske protokole priprave vzorcev lahko laboratoriji bistveno izboljšajo tako učinkovitost kot zanesljivost kromatografske analize.
Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost, izdelana v Nemčiji
Ultrazvočne naprave Hielscher so znane po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključitev naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Ultrazvočne naprave Hielscher zlahka obvladujejo težke pogoje in zahtevna okolja.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim napravam, ki jih odlikujeta najsodobnejša tehnologija in prijaznost do uporabnika. Seveda so ultrazvočne naprave Hielscher skladne s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Literatura / reference
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Pogosto zastavljena vprašanja
Kaj je HPLC?
Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je analizna tehnika ločevanja, ki se uporablja za identifikacijo, kvantifikacijo in čiščenje sestavin v zmesi. Pri HPLC tekoča mobilna faza pod visokim tlakom prenaša raztopljene analite skozi kolono, napolnjeno s stacionarno fazo. Razlike v interakcijah med analiti, stacionarno fazo in mobilno fazo povzročijo ločevanje spojin med prehajanjem skozi kolono. Detektorji, kot so UV-Vis, fluorescenčni ali masnospektrometrični detektorji, merijo ločene spojine in omogočajo natančno kvalitativno in kvantitativno analizo.
Katere so vrste tekočinske kromatografije?
Tekočinsko kromatografijo lahko razvrstimo glede na mehanizem ločevanja, ki temelji na interakcijah med analitom, stacionarno fazo in mobilno fazo. Najpogostejše vrste so kromatografija z obrnjeno fazo, pri kateri nepolarna stacionarna faza ločuje spojine na podlagi hidrofobnih interakcij; kromatografija z normalno fazo, ki uporablja polarno stacionarno fazo in ločuje spojine glede na polarnost; ionskoizmenjevalna kromatografija, pri kateri nabite stacionarne faze ločujejo analite na podlagi ionskih interakcij; in izključitvena kromatografija, ki ločuje molekule glede na njihovo hidrodinamsko velikost in molekulsko maso. Dodatne specializirane metode vključujejo afinitetno kromatografijo in kromatografijo s hidrofilnimi interakcijami (HILIC), ki sta usmerjeni v specifične molekulske interakcije ali polarne spojine.
Katere viale se uporabljajo za HPLC?
Pri analizah HPLC se običajno uporabljajo majhne steklene ali polimerne viale, namenjene shranjevanju pripravljenih vzorcev pred injiciranjem v kromatografski sistem. Najpogostejši format je 2-mL viala za samodejni vzorčevalnik, ki je združljiva z večino samodejnih vzorčevalnikov HPLC. Te viale so običajno izdelane iz borosilikatnega stekla, da zagotavljajo kemijsko odpornost in minimalne interakcije s topili in analiti. Glede na vrsto vzorca lahko viale vključujejo vložke za vzorce majhnega volumna, navojne ali krimpane pokrovčke ter septe iz materialov, kot je PTFE/silikon, za ohranjanje celovitosti vzorca.
Kaj so viale za samodejni vzorčevalnik?
Viale za samodejni vzorčevalnik so specializirane posodice za vzorce, zasnovane za samodejne sisteme injiciranja v instrumentih HPLC in UHPLC. Vsebujejo pripravljeno raztopino vzorca in so nameščene na pladnju samodejnega vzorčevalnika instrumenta, kjer sistem samodejno odvzame določen volumen za injiciranje v kromatografsko kolono. Viale za samodejni vzorčevalnik so izdelane z natančnimi merami, da zagotavljajo združljivost z robotskimi iglami za vzorčenje in čim bolj zmanjšajo izhlapevanje, kontaminacijo ali adsorpcijo vzorca. Njihova zasnova omogoča ponovljive analize z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev v sodobnih kromatografskih laboratorijih.
Kateri so koraki pri HPLC?
Običajni postopek tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) obsega več zaporednih korakov, ki zagotavljajo zanesljivo ločevanje in zaznavanje analitov.
- Najprej se izvede priprava vzorca, da se analit raztopi, odstranijo delci in pogosto ekstrahirajo ali koncentrirajo ciljne spojine iz matriksa vzorca. Ta korak lahko vključuje filtracijo, redčenje ali ekstrakcijske tehnike, kot so ultrazvočna ekstrakcija, ekstrakcija na trdni fazi ali ekstrakcija tekoče–tekoče.
- Nato se pripravljeni vzorec prenese v vialo za HPLC in vstavi v samodejni vzorčevalnik. Samodejni vzorčevalnik injicira natančen volumen vzorca v tok mobilne faze.
- V fazi dovajanja mobilne faze se injicirani vzorec nato prenese skozi sistem z visokotlačno črpalko. Mobilna faza prenaša analite skozi kromatografsko kolono pri nadzorovanem pretoku.
- V kromatografski koloni poteka ločevanje. Kolona vsebuje stacionarno fazo, običajno polnilo iz delcev z določenimi kemijskimi lastnostmi. Med prehajanjem skozi kolono analiti različno interagirajo s stacionarno in mobilno fazo, zato se eluirajo ob različnih časih.
- Po ločevanju spojine preidejo skozi detektor, kot je UV-Vis, fluorescenčni ali masnospektrometrični detektor. Detektor meri prisotnost in koncentracijo eluirajočih se spojin ter pretvori signal v elektronske podatke.
- Na koncu se s kromatografsko programsko opremo izvedeta zajem in analiza podatkov. Sistem ustvari kromatogram, v katerem vrhovi ustrezajo posameznim spojinam. Retencijski časi vrhov pomagajo pri identifikaciji analitov, površine ali višine vrhov pa omogočajo kvantitativno določanje njihove koncentracije.
Hielscher Ultrasonics izdeluje visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje od laboratorijskih do industrijskih velikosti.