Genetska transformacija rastlinskih celic z ultrazvokom

Transformacija s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium ob pomoči sonikacije (SAAT) je učinkovita metoda za okužbo rastlinskih celic s tujimi geni, pri kateri Agrobacterium deluje kot prenašalec. Ultrazvočna kavitacija povzroči sonoporacijo, ki jo lahko opišemo kot ciljno povzročanje mikropoškodb rastlinskega tkiva. Skozi te z ultrazvokom ustvarjene mikropoškodbe je mogoče učinkovito prenesti DNA in vektorje DNA v celični matriks.

Sonoporacija – z ultrazvokom izboljšana transformacija celic

Pri uporabi nizkofrekvenčnega ultrazvoka (pribl. 20kHz) na celičnih suspenzijah učinki akustične kavitacije povzročijo prehodno povečanje prepustnosti membran v celičnih tkivih. Ta ultrazvočni učinek je znan kot sonoporacija in se uporablja za prenos genov v celice ali tkiva.
Prednosti ultrazvočne obdelave temeljijo na njenem netoplotnem mehanskem načelu delovanja, zaradi katerega je sonikacija pogosto bolj vsestranska in manj odvisna od vrste celic. Vsestranska uporaba sonoporacije odpira možnosti za uporabo transgenih rastlin, ki imajo velik potencial za biološko proizvodnjo kompleksnih človeških terapevtskih beljakovin. Takšne rastlinske bioreaktorje je mogoče preprosto genetsko spreminjati, preprečujejo morebitno kontaminacijo s človeškimi patogeni, ne poškodujejo bakterij, ki posredujejo pri transformaciji (npr. Agrobacterium), in so poceni ter učinkovita metoda biosinteze.

Transformacija celic ob pomoči ultrazvoka

Sonikacija je tehnika, pri kateri se nizkofrekvenčni ultrazvočni valovi uporabljajo za premikanje delcev v raztopini in mešanje raztopin, s čimer se povečata hitrost prenosa snovi in hitrost raztapljanja. Hkrati lahko sonikacija odstrani raztopljene pline iz tekočin. Pri transformaciji rastlin sonikacija povzroči nastanek mikropoškodb rastlinskega tkiva in izboljša vnos gole DNA v rastlinski protoplast.

Za genetsko transformacijo je prednostna metoda transformacija s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium ob pomoči sonikacije (SAAT), ki je bistveno učinkovitejša od sonikacije za neposredni prenos gole DNA in vektorjev DNA v protoplast. Številne študije so pokazale, da je mogoče transformacijo s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium ob pomoči sonikacije (SAAT) uporabiti za povzročanje mehanske razgradnje in nastanka poškodb rastlinskih celic z ultrazvočnimi valovi ter posledično akustično kavitacijo. Kratka ultrazvočna obdelava ustvari mikropoškodbe na površini eksplantatov. Poškodovane celice omogočijo prodiranje bakterij rodu Agrobacterium v globlje dele rastlinskih tkiv, s čimer se poveča verjetnost okužbe rastlinskih celic. Poleg tega izločene fenolne spojine izboljšajo transformacijo. Mikropoškodbe, ustvarjene z ultrazvokom, olajšajo tudi prodiranje bakterij v eksplantate. SAAT so uspešno uporabili za genetsko transformacijo rastlinskih vrst, ki veljajo za posebej odporne proti bakterijam rodu Agrobacterium.
Glavni prednosti metode SAAT sta njena velika preprostost in nizka cena ter znatno izboljšanje prenosa genov s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium. Poleg uspešne uporabe metode SAAT pri transformaciji Chenopodium rubrum L. in Beta vulgaris L. so ta pristop uporabili tudi za proizvodnjo rekombinantnega toplotno labilnega holotoksina divjega tipa Escherichia coli in mutantnih adjuvansov LT za cepiva iz Escherichia coli v Nicotiana tabacum, pri čemer so pri pticah zaznali najvišje sistemske titre IgG, specifičnih za LT-B.
(prim. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka in R. Baranski, 2014)

Splošni postopek prenosa genov s sonoporacijo v rastlinskih celicah

1. Priprava genskega materiala: Najprej pripravite genski material, ki ga želite vnesti v rastlinske celice. To je lahko plazmidna DNA, RNA ali druge nukleinske kisline.
2. Izolacija rastlinskih celic: Izolirajte rastlinske celice, ki jih želite obdelati. Odvisno od vašega poskusa lahko te celice izolirate iz rastlinskih tkiv ali kultur.
3. Celična suspenzija: Rastlinske celice suspendirajte v ustreznem gojišču ali pufru. To je nujno za zagotovitev, da so celice zdrave in v stanju, ki omogoča sprejem genov.
4. Nastavitev sonikatorja: Pripravite sonikator s sondo tako, da vnaprej nastavite parametre sonikacije, kot so amplituda, čas, energija in temperatura. Ultrazvočno sondo potopite v celično suspenzijo.
5. Sonikacija: Začnite postopek sonikacije. Hitro nihanje konice sonde ustvarja kavitacijske mehurčke v tekočini. Ti mehurčki se zaradi ultrazvočnih valov širijo in sesedajo, pri čemer v suspenziji nastajajo mehanske sile in mikropretakanje.
6. Sonoporacija: Mehanske sile in mikropretakanje, ki nastanejo zaradi kavitacije, ustvarijo začasne pore in odprtine v membranah rastlinskih celic. Genski material, prisoten v suspenziji, lahko skozi te pore vstopi v rastlinske celice.
7. Inkubacija: Po obdelavi s sonoporacijo rastlinske celice inkubirajte, da si opomorejo in stabilizirajo svoje membrane. To je ključen korak za zagotovitev preživetja celic in uspešnega prenosa genov.

Prenos genov z bakterijami rodu Agrobacterium ali liposomi

Obstajata dva običajna načina transfekcije rastlinskih celic. Kot prenašalce genskega materiala uporabljata bodisi Agrobacterium, rod po Gramu negativnih bakterij, bodisi liposome.

• Sonoporacija s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens je bakterija, ki se pogosto uporablja pri genskem inženirstvu rastlin. Pri tej metodi se plazmidna DNA, ki vsebuje želeni gen, vnese v Agrobacterium, ki se nato zmeša z rastlinskimi celicami. Celična suspenzija se izpostavi sonoporaciji s sonikatorjem s sondo. Ultrazvočna energija izboljša prenos genskega materiala iz bakterij rodu Agrobacterium v rastlinske celice. Ta metoda se široko uporablja za gensko spreminjanje rastlin.
• Sonoporacija s posredovanjem liposomov: Liposomi so vezikli na osnovi lipidov, ki lahko prenašajo genski material. Pri tej metodi se liposomi, napolnjeni s plazmidno DNA ali drugimi nukleinskimi kislinami, zmešajo z rastlinskimi celicami. Za olajšanje sprejema liposomov v rastlinske celice se uporablja sonoporacija s sonikatorjem s sondo. Ultrazvok poruši lipidne dvosloje liposomov in sprosti genski material v rastlinske celice. Ta pristop je uporaben za študije prehodnega izražanja genov v rastlinskih celicah.

Znanstveno dokazane prednosti transformacije s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium ob pomoči sonikacije (SAAT)

Transformacijo s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium ob pomoči sonikacije (SAAT) so uporabili pri številnih rastlinskih vrstah. Kratka in razmeroma blaga ultrazvočna obdelava kultur rastlinskih celic povzroči sonoporacijo, ki nato omogoči globoko prodiranje bakterij rodu Agrobacterium kot prenašalcev genov. Spodaj si lahko preberete primere študij, ki dokazujejo koristne učinke metode SAAT.

Transformacija ašvagande ob pomoči ultrazvoka

Da bi izboljšali učinkovitost transformacije W. somnifera (znane kot ašvaganda ali zimska češnja), so Dehdashti in sodelavci (2016) raziskovali uporabo acetosiringona (AS) in sonikacije.
Acetosiringon (AS) so dodali v treh fazah: v tekočo kulturo bakterij rodu Agrobacterium, med okužbo z bakterijami rodu Agrobacterium in med sokultivacijo eksplantatov z bakterijami rodu Agrobacterium. Ugotovili so, da je dodatek 75 μM AS v tekočo kulturo bakterij rodu Agrobacterium optimalen za indukcijo genov vir.
Dodatna uporaba sonikacije (SAAT) je privedla do najvišjega izražanja genov. Ugotovili so, da je bilo izražanje gena gusA v lasastih koreninah najboljše, ko so liste sonikirali 10, vršičke poganjkov pa 20s. Učinkovitost transformacije po izboljšanem protokolu je znašala 66,5 pri listnih eksplantatih in 59,5% pri eksplantatih vršičkov poganjkov. V primerjavi z drugimi protokoli so ugotovili, da je bila učinkovitost transformacije po tem izboljšanem protokolu 2,5-krat večja pri listih in 3,7-krat večja pri vršičkih poganjkov. Analize s prenosom po Southernu so potrdile 1–2 kopiji transgena gusA v linijah W1-W4, medtem ko so v liniji W5, pridobljeni z izboljšanim protokolom, zaznali 1–4 kopije transgena.

Vpliv trajanja transformacije s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium ob pomoči sonikacije (SAAT) na pogostost transformacije listnih eksplantatov (a) in eksplantatov vršičkov poganjkov (b) W. somnifera
(študija in grafični prikaz: © Dehdashti et al., 2016)

Transformacija bombaževca ob pomoči ultrazvoka

Hussain et al. (2007) prikazujejo koristne učinke transformacije bombaževca ob pomoči sonikacije. Akustična kavitacija, ki jo povzroči nizkofrekvenčni ultrazvok, ustvari mikropoškodbe na površini rastlinskega tkiva in pod njo (sonoporacija) ter omogoči bakterijam rodu Agrobacterium, da prodrejo globlje in po celotnem rastlinskem tkivu. Tak način povzročanja poškodb poveča verjetnost okužbe rastlinskih celic, ki ležijo globlje v tkivu. Za oceno učinkovitosti transformacije z metodo SAAT so merili izražanje gena GUS. Poročevalski sistem GUS je sistem poročevalskega gena, ki je posebej uporaben v rastlinski molekularni biologiji in mikrobiologiji. S prilagajanjem različnih parametrov SAAT so bistveno izboljšali prehodno izražanje GUS v bombaževcu, pri čemer so kot eksplantate uporabili zrele zarodke. GUS so prvič zaznali 24h po inkubaciji eksplantatov, po 48h pa je bilo izražanje GUS zelo intenzivno, kar je bilo uporaben pokazatelj uspešne transformacije eksplantata bombaževca po transformaciji s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium ob pomoči sonikacije (SAAT). Pri primerjavi različnih tehnik transformacije (in sicer biolistične transformacije, Agro, BAAT, SAAT) je transformacija s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium ob pomoči sonikacije (SAAT) pokazala daleč najboljše rezultate transformacije.

Izbira postopka transformacije na podlagi prehodnega izražanja GUS. Transformacija s posredovanjem bakterij rodu Agrobacterium ob pomoči sonikacije (SAAT) kaže bistveno višje prehodno izražanje.
(študija in grafični prikaz: © Hussain et al., 2007)

Visokozmogljive ultrazvočne rešitve za sonoporacijo in SAAT

Hielscher Ultrasonics ima dolgoletne izkušnje pri razvoju in izdelavi visokozmogljivih ultrazvočnih sonikatorjev za laboratorije, raziskovalne ustanove ter industrijsko proizvodnjo z zelo velikimi zmogljivostmi obdelave. Za mikrobiologijo in vede o življenju Hielscher ponuja različne rešitve za izpolnjevanje različnih zahtev, potrebnih za posamezna tkiva in njihovo obdelavo. Za sočasno ultrazvočno obdelavo številnih vzorcev Hielscher ponuja UIP400MTP za plošče z več vdolbinicami, VialTweeter za sonikacijo do 10 vial (npr. epruvet Eppendorf) ali ultrazvočni CupHorn. Ultrazvočni sonikatorji s sondo imajo razpon moči od 50 do 400 vatov za laboratorijske homogenizatorje in od 500 vatov do 16 kW za industrijske sisteme.
Stopite v stik z nami ter nam predstavite svojo uporabo in procesne zahteve. Naše izkušeno osebje vam bo z veseljem priporočilo najprimernejši ultrazvočni sonikator za vaš biološki proces.
Spodnja preglednica prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih sonikatorjev: