Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) je učinkovita metoda za okužbo rastlinskih celic s tujimi geni, ki uporabljajo Agrobacterium kot transporter. Ultrazvočna kavitacija povzroča sonoporacijo, ki jo lahko opišemo kot ciljno mikrorananje rastlinskega tkivo. Preko teh ultrazvočno ustvarja mikro-rane, DNK in DNA vektorji se lahko učinkovito prenesejo v celično matriko.

Sonoporacija – Ultrazvočno izboljšana transformacija celic

Pri uporabi nizko frekvenčnega ultrazvoka (približno 20kHz) za celične suspenzije učinki akustične kavitacije povzročajo prehodno membransko permeabilizacijo na celična tkiva. Ta ultrazvočni učinek je znan kot sonoporacija in se uporablja za prenos genov v celice ali tkiva.
Prednosti ultrasonikacije temeljijo na svojem netermalnem mehaničnem delovnem načelu, zaradi katerega je sonication pogosto bolj vsestranska in manj odvisna od vrst celic. Vsestranska uporaba sonoporacije odpira možnost uporabe transgenih rastlin, ki imajo pomemben potencial pri bioprodukciji kompleksnih človeških terapevtskih beljakovin. Takšne bioreaktorje na rastlinskem osnovi je mogoče enostavno genetsko manipulirati, preprečiti morebitno kontaminacijo s človeškimi patogeni, ne poškodujejo transformacije mediacijo bakterij (npr. Agrobacterium), in so poceni, učinkovita metoda bio-sinteze.

Ultrazvočno podprto preoblikovanje celic

Sonication je tehnika, ki uporablja nizko frekvenčno ultrazvočne valove za agitacijo delcev v raztopini, za mešanje raztopin, s čimer se poveča hitrost prenosa mase in raztapljanja. Hkrati lahko sonication odstrani raztopljene pline iz tekočin. Pri preoblikovanju rastlin bo sonication povzročila nastanek mikrozvezdov na rastlinsko tkivo in okrepila dostavo gole DNK v rastlinski protoplast.

Za gensko preobrazbo je prednostna metoda sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) in ima bistveno večjo učinkovitost kot sonication, ki se uporablja za prenos golih DNA in DNA vektorjev neposredno v protoplast. Številne študije so pokazale, da je sonication pomagal Agrobacterium-mediated transformacijo (SAAT) lahko uporabi za povzročitev mehanske motnje in nastanek ran na rastlinskih celicah z ultrazvočnimi valovi in posledične akustične kavitacije. Kratko ultrazvočno zdravljenje ustvarja mikro-rane na površini explants. Ker bodo ranjene celice omogočile prodor Agrobakterija v globlji del rastlinskih tkiv, s čimer se bo povečala verjetnost okužbe rastlinskih celic. Poleg tega izločajo fenolne spojine povečati transformacijo. Ultrazvočno ustvarjene mikro-rane naredijo explant penetracije z bakterijami tudi bolj izvedljivo. SAAT se je uspešno uporabljal za gensko preoblikovanje rastlinskih vrst, ki so bile še posebej odporne na agrobakterij.
Zelo preprosta in poceni metoda, pa tudi pomembno povečanje prenosa genov, posredovanih v agrobakterij, so glavne prednosti SAAT. Razen uspešne uporabe SAAT pri preoblikovanju Chenopodium rubrum L. I Beta vulgaris L., taj je pristop primenljiv i u proizvodnji rekombinantnih Escherichia coli wild-labile holotoksina i Escherichia coli mutanta LT adjuvansa za LT vakcine u Nicotiana tabacumu, u katerem su pri pticama detektovani najsistemičniji sistemski IgG titri specifični za LT-B.
(prim. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka in R. Baranski, 2014)

Splošni postopek prenosa genov s sonoporacijo v rastlinskih celicah

1. Priprava genskega materiala: Začnite s pripravo genskega materiala, ki ga želite vnesti v rastlinske celice. To so lahko plazmidna DNA, RNA ali druge nukleinske kisline.
2. Izolacija rastlinskih celic: Izolirajte rastlinske celice, na katere želite ciljati. Glede na vaš poskus lahko te celice izoliramo iz rastlinskih tkiv ali kultur.
3. Suspenzija celic: Suspendirajte rastlinske celice v ustreznem mediju ali pufru. To je bistveno za zagotovitev, da so celice zdrave in v stanju, ki vodi do vnosa genov.
4. Nastavite svoj Sonicator: Pripravite svoj sondni zvočnik z ultrazvočno nastavitvijo parametrov, kot so amplituda, čas, energija in temperatura. Ultrazvočno sondo potopite v celično suspenzijo.
5. ultrazvoka: Začnite postopek ultrazvočnega razbijanja. Hitro nihanje konice sonde povzroči kavitacijske mehurčke v tekočini. Ti mehurčki se razširijo in zrušijo zaradi ultrazvočnih valov, kar ustvarja mehanske sile in mikro pretakanje v suspenziji.
6. Sonoporacija: Mehanske sile in mikrotok, ki jih povzroča kavitacija, ustvarjajo začasne pore in luknje v membranah rastlinskih celic. Genetski material, ki je prisoten v suspenziji, lahko vstopi v rastlinske celice skozi te pore.
7. Inkubacije: Po sonoporacijski obdelavi inkubirajte rastlinske celice, da si lahko opomorejo in stabilizirajo membrane. To je ključni korak za zagotovitev preživetja celic in uspešnega prenosa genov.

Prenos genov preko Agrobacterium ali liposomov

Obstajata dve skupni obliki za transfekcijo rastlinskih celic. Uporabljajo bodisi agrobacterium, rod gram-negativnih bakterij, bodisi liposome kot nosilec genskega materiala.

• Sonoporacija, ki jo posreduje Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens je bakterija, ki se pogosto uporablja v rastlinskem genskem inženiringu. Pri tej metodi se plazmidna DNA, ki vsebuje želeni gen, vnese v Agrobacterium, ki se nato zmeša z rastlinskimi celicami. Suspenzija celic je izpostavljena sonoporaciji z uporabo sondnega sonde. Ultrazvočna energija pospešuje prenos genskega materiala iz Agrobacterium v rastlinske celice. Ta metoda se pogosto uporablja za gensko spreminjanje rastlin.
• Sonoporacija, posredovana z liposomom: Liposomi so vezikli na osnovi lipidov, ki lahko nosijo genetski material. Pri tej metodi se liposomi, obremenjeni s plazmidno DNA ali drugimi nukleinskimi kislinami, zmešajo z rastlinskimi celicami. Sonoporacija z uporabo sondnega sonikatorja se uporablja za olajšanje vnosa liposomov v rastlinske celice. Ultrazvok moti lipidne dvosloje liposomov in sprošča genetski material v rastlinske celice. Ta pristop je uporaben za prehodne študije genske ekspresije v rastlinskih celicah.

Znanstveno dokazane koristi sonication-assisted Agrobacterium-Mediated Transformacija (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) je bila uporabljena za številne rastlinske vrste. Kratka in relativno blaga ultrazvočna obdelava kultur rastlinskih celic povzroča sonoporacijo, kar nato omogoča globok prodor Agrobacteriuma kot genskega prenašalca. Spodaj si lahko preberete zgledne študije, ki dokazujejo koristne učinke SAAT.

Ultrazvočno podprta preobrazba Ashwagandha

Da bi izboljšali učinkovitost preoblikovanja v W. somniferi (znani kot ashwagandha ali zimska češnja), so Dehdashti in kolegi (2016) preiskali uporabo acetosyringona (AS) in sonication.
Acetoziringon (AS) je bil dodan v treh fazah: Agrobacterium liquid culture, Agrobacterium okužba in sokultura razsadkov z Agrobacterium. Ugotovili so, da je dodajanje 75 μM AS tekočinski kulturi Agrobacterium optimalno za indukcijo vir genov.
Dodatna uporaba sonication (SAAT) je povzročila najvišji genski izraz. Genski izraz gusA v kosmatih koreninah je bil najboljši, ko so bili listje in konice za snemanje sonicated za 10 oziroma 20 let. Učinkovitost preoblikovanja izboljšanega protokola je bila zabeležena 66,5 oziroma 59,5 % v primeru izstrelkov listnih in strelnih konicah. V primerjavi z drugimi protokoli se je ugotovilo, da je učinkovitost transformacije tega izboljšanega protokola 2,5 krat višja za listje in 3,7 krat več za konice za snemanje. Južne blot analize so potrdile 1–2 izvodov transgena gusA v linijah W1-W4, 1–4 transgenske kopije pa so bile odkrite v vrstici W5, ki je bila ustvarjena z izboljšanim protokolom.

Učinek trajanja sonication-asisted Agrobacterium-mediated transformacije (SAAT) na pretvorbo pogostost W. somnifera list (a) in strel konico (b) explants
(študija in grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvočno podprta preobrazba bombaža

Hussain et al. (2007) dokazuje koristne učinke sonication-assisted preoblikovanje bombaža. Akustična kavitacija, ki jo povzroča nizko frekvenčni ultrazvok, ustvarja mikro-rane na površini rastlinskega tkiva in pod njo (sonoporacija) in omogoča Agrobakterij, da potuje globlje in popolnoma po celotnem rastlinskega tkivu. Ta moda rane povečuje verjetnost za nalezljivost rastlinskih celic, ki leže globlje v tkivu. Da bi ocenili učinkovitost transformacije SAAT, je bilo izmerjeno gensko izražanje GUS. Gus reporterski sistem je poročevalski genski sistem, še posebej uporaben v rastlinski molekularni biologiji in mikrobiologiji. Prilagajanje različnih parametrov SAAT, se je bistveno povečal prehodni izraz GUS v bombažu z uporabo zrelih zarodkov kot razslojev. GUS je bil prvič odkrit 24h po inkubacijah razstrelišč in do 48h je bil IZRAZ GUS zelo intenzivna, kar je služilo kot uporaben kazalnik uspešnega preoblikovanja bombažnega obtoka po sonication asistirani agrobakterij posredovani transformaciji (SAAT). Primerjava različnih transformacijskih tehnik (in sicer biolističnih, Agro, BAAT, SAAT), sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation (SAAT) je pokazala daleč najboljše rezultate transformacije.

Izbira postopka transformacije na podlagi prehodnega izražanja GUS. Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformacija (SAAT) kaže bistveno višji prehodni izraz.
(študija in grafika: © Hussain et al., 2007)

Ultrazvočne rešitve visoke zmogljivosti za sonoporacijo in SAAT

Hielscher Ultrasonics je dolgo časa izkušen v razvoju in izdelavi visoko zmogičnih ultrazvočnihtorjev za laboratorije, raziskovalne objekte, kot tudi industrijsko proizvodnjo z zelo visokimi vhodi. Za mikrobiologijo in življenjsko znanost Hielscher ponuja različne rešitve za namestitev različnih zahtev, potrebnih za specifična tkiva in njihovo zdravljenje. Za hkratno ultrasonication številnih vzorcev Hielscher ponuja UIP400MTP za večplastne plošče, VialTweeter za sonication do 10 vial (npr. Eppendorf cevi) ali ultrazvočni CupHorn. Ultrasonikatorji tipa sonde so na voljo od 50 do 400 vatov kot laboratorijski homogenizatorji, industrijski sistemi pa pokrivajo razpon moči od 500 vatov do 16kW.
Obrnite se na nas in nam povejte o vaših zahtevah glede uporabe in postopka. Naše dobro izkušeno osebje vam bo z veseljem priporočilo najbolj primeren ultrazvočnitor za vaš biološki proces.
V spodnji tabeli vam daje podatek o približni zmogljivosti obdelave naših ultrasonicators: