Genska transformacija v rastlinskih celicah z uporabo ultrazvoka

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) je učinkovita metoda za okužbo rastlinskih celic s tujimi geni z uporabo Agrobacterium kot transporterja. Ultrazvočna kavitacija povzroča sonoporacijo, ki jo lahko opišemo kot ciljno mikroranjenje rastlinskega tkiva. S temi ultrazvočnimi ustvarjenimi mikro ranami se lahko DNK in DNK vektorji učinkovito prenesejo v celično matrico.

sonoporacija – Ultrazvočno izboljšana celična transformacija

Ko se na celične suspenzije uporabi nizkofrekvenčni ultrazvok (približno 20 kHz), učinki akustične kavitacije povzročijo prehodno membransko permeabilizacijo na celičnih tkivih. Ta ultrazvočni učinek je znan kot sonoporacija in se uporablja za prenos genov v celice ali tkiva.
Prednosti ultrazvočnega delovanja temeljijo na netoplotnem mehanskem delovnem principu, zaradi česar je ultrazvočno razbijanje pogosto bolj vsestransko in manj odvisno od vrst celic. Vsestranska uporaba sonoporacije odpira možnost uporabe transgenih rastlin, ki imajo pomemben potencial v bioproizvodnji kompleksnih človeških terapevtskih beljakovin. Takšni rastlinski bioreaktorji se lahko zlahka gensko manipulirajo, preprečujejo morebitno kontaminacijo s človeškimi patogeni, ne poškodujejo bakterij, ki posredujejo transformacijo (npr. Agrobacterium), in so poceni, učinkovita metoda biosinteze.

Ultrazvočno podprta celična transformacija

Sonication je tehnika, ki uporablja nizkofrekvenčne ultrazvočne valove za mešanje delcev v raztopini, mešanje raztopin in s tem povečanje hitrosti prenosa in raztapljanja mase. Hkrati lahko ultrazvočno razbijanje odstrani raztopljene pline iz tekočin. Pri transformaciji rastlin bo ultrazvočna obdelava povzročila nastanek mikroran na rastlinskem tkivu in povečala dostavo gole DNK v rastlinski protoplast.

Za genetsko transformacijo je najprimernejša metoda Sonication-Assisted Agrobacterium-posredovana transformacija (SAAT) in ima bistveno večjo učinkovitost kot ultrazvočna obdelava, ki se uporablja za prenos gole DNK in vektorjev DNA neposredno v protoplast. Številne študije so pokazale, da se lahko ultrazvočna transformacija, ki jo posreduje Agrobacterium (SAAT), uporablja za povzročanje mehanskih motenj in nastajanja ran na rastlinskih celicah z ultrazvočnimi valovi in posledično akustično kavitacijo. Kratka ultrazvočna obdelava ustvarja mikro rane na površini eksplantatov. Ker bodo ranjene celice omogočile prodor Agrobacterium v globlji del rastlinskih tkiv, s čimer se poveča verjetnost okužbe rastlinskih celic. Poleg tega izločene fenolne spojine povečajo transformacijo. Ultrazvočno ustvarjene mikro rane omogočajo tudi prodiranje eksplantata bakterij bolj izvedljivo. SAAT je bil uspešno uporabljen za gensko transformacijo pri rastlinskih vrstah, ki so še posebej odporne na Agrobacterium.
Ker je to zelo preprosta in poceni metoda, pa tudi znatno izboljšanje prenosa genov, ki ga posreduje Agrobacterium, so glavne prednosti SAAT. Poleg uspešne uporabe SAAT pri transformaciji Chenopodium rubrum L. in Beta vulgaris L. je bil ta pristop uporabljen tudi pri proizvodnji rekombinantnega toplotno labilnega holotoksina divjega tipa Escherichia coli in adjuvansov cepiva Escherichia coli mutant LT pri Nicotiana tabacum, pri katerih so bili pri pticah odkriti najvišji sistemski LT-B-specifični titri IgG.
(prim. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka in R. Baranski, 2014)

Splošni postopek prenosa genov s sonoporacijo v rastlinskih celicah

1. Priprava genskega materiala: Začnite s pripravo genskega materiala, ki ga želite vnesti v rastlinske celice. To je lahko plazmidna DNK, RNA ali druge nukleinske kisline.
2. Izolacija rastlinskih celic: Izolirajte rastlinske celice, na katere želite ciljati. Glede na vaš poskus se lahko te celice izolirajo iz rastlinskih tkiv ali kultur.
3. Suspenzija celic: Rastlinske celice suspendiramo v primernem gojišču ali pufru. To je bistvenega pomena za zagotovitev, da so celice zdrave in v stanju, ki vodi k vnosu genov.
4. Nastavite svoj Sonicator: Pripravite sondni zvočnik tako, da ultrazvočno nastavitev parametrov, kot so amplituda, čas, energija in temperatura. Potopite ultrazvočno sondo v celično suspenzijo.
5. Sonikacija: Začnite postopek ultrazvočnega razbijanja. Hitro nihanje konice sonde ustvarja kavitacijske mehurčke v tekočini. Ti mehurčki se razširijo in zrušijo zaradi ultrazvočnih valov, kar ustvarja mehanske sile in mikrotok v suspenziji.
6. Sonoporacija: Mehanske sile in mikrotok, ki jih ustvarja kavitacija, začasno ustvarjajo pore in luknje v membranah rastlinskih celic. Genetski material, ki je prisoten v suspenziji, lahko skozi te pore vstopi v rastlinske celice.
7. Inkubacije: Po zdravljenju s sonoporacijo inkubirajte rastlinske celice, da si lahko opomorejo in stabilizirajo membrane. To je ključni korak za zagotovitev preživetja celic in uspešnega prenosa genov.

Prenos genov prek agrobakterij ali liposomov

Obstajata dve pogosti obliki za pretvorbo rastlinskih celic. Uporabljajo bodisi agrobakterijo, rod gram-negativnih bakterij, bodisi liposome kot nosilec genskega materiala.

• Sonoporacija, ki jo posreduje agrobakterija: Agrobacterium tumefaciens je bakterija, ki se pogosto uporablja v rastlinskem genskem inženiringu. Pri tej metodi se plazmidna DNA, ki vsebuje želeni gen, vnese v Agrobacterium, ki se nato zmeša z rastlinskimi celicami. Celična suspenzija se izpostavi sonoporaciji z uporabo sondnega sondatorja. Ultrazvočna energija poveča prenos genskega materiala iz Agrobacterium v rastlinske celice. Ta metoda se pogosto uporablja za gensko spreminjanje rastlin.
• Sonoporacija, posredovana z liposomom: Liposomi so mehurčki na osnovi lipidov, ki lahko nosijo genski material. Pri tej metodi se liposomi, napolnjeni s plazmidno DNK ali drugimi nukleinskimi kislinami, zmešajo z rastlinskimi celicami. Sonoporacija z uporabo sondnega zvočnika se uporablja za lažji sprejem liposomov v rastlinske celice. Ultrazvok moti lipidne dvoplasti liposomov in sprošča genetski material v rastlinske celice. Ta pristop je uporaben za študije prehodne ekspresije genov v rastlinskih celicah.

Znanstveno dokazane koristi ultrazvočne transformacije, ki jo posredujejo agrobakterije (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediation Transformation (SAAT) je bila uporabljena za številne rastlinske vrste. Kratka in relativno blaga ultrazvočna obdelava rastlinskih celičnih kultur povzroči sonoporacijo, ki nato omogoča globoko penetracijo Agrobacterium kot genskega prenašalca. Spodaj si lahko preberete zgledne študije, ki dokazujejo koristne učinke SAAT.

Ultrazvočno podprta transformacija Ashwagandhe

Da bi izboljšali učinkovitost transformacije pri W. somnifera (znana kot ashwagandha ali zimska češnja), so Dehdashti in sodelavci (2016) raziskali uporabo acetosyringona (AS) in ultrazvočnega razbijanja.
Acetosyringon (AS) je bil dodan v treh fazah: tekoča kultura Agrobacterium, okužba z Agrobacterium in kokultura eksplantatov z Agrobacterium. Ugotovljeno je bilo, da je dodatek 75 μM AS tekoči kulturi Agrobacterium optimalen za indukcijo genov virusa.
Dodatna uporaba ultrazvočne razbijanje (SAAT) je povzročila najvišjo ekspresijo genov. Ugotovljeno je bilo, da je izražanje gena gusA v dlakavih koreninah najboljše, ko so bili listi in konice poganjkov sonikirani 10 oziroma 20 let. Učinkovitost transformacije izboljšanega protokola je bila zabeležena 66,5 oziroma 59,5% v primeru eksplantatov listov in konic poganjkov. V primerjavi z drugimi protokoli je bilo ugotovljeno, da je učinkovitost transformacije tega izboljšanega protokola 2,5-krat višja za liste in 3,7-krat večja za konice streljanja. Analize južnih blotov so potrdile 1–2 kopiji transgena gusA v linijah W1-W4, medtem ko so bile 1–4 kopije transgenov odkrite v liniji W5, ki jo je ustvaril izboljšan protokol.

Vpliv trajanja ultrazvočno podprte transformacije Agrobacterium (SAAT) na frekvenco transformacije eksplantatov listov (a) in konice poganjkov (b)
(študija in grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvočno podprta transformacija bombaža

Hussain et al. (2007) kažejo koristne učinke transformacije bombaža s pomočjo ultrazvočne obdelave. Akustična kavitacija, ki jo povzroča nizkofrekvenčni ultrazvok, ustvarja mikrorane na in pod površino rastlinskega tkiva (sonoporacija) in omogoča Agrobacteriumu, da potuje globlje in popolnoma skozi rastlinsko tkivo. Ta način ranjevanja povečuje verjetnost okužbe rastlinskih celic, ki ležijo globlje v tkivu. Da bi ocenili učinkovitost transformacije SAAT, smo izmerili ekspresijo gena GUS. Reporterski sistem GUS je reporterski genski sistem, ki je še posebej uporaben v molekularni biologiji in mikrobiologiji rastlin. S prilagoditvijo različnih parametrov SAAT se je znatno povečala prehodna ekspresija GUS v bombažu z uporabo zrelih zarodkov kot eksplantata. GUS je bil prvič odkrit 24 ur po inkubaciji eksplantatov in do 48 ur je bila ekspresija GUS zelo intenzivna, kar je služilo kot koristen pokazatelj uspešne transformacije bombažnega eksplantata po ultrazvočni transformaciji Agrobacterium (SAAT). Primerjava različnih transformacijskih tehnik (in sicer biolistične, Agro, BAAT, SAAT), ultrazvočno podprte transformacije Agrobacterium (SAAT) je pokazala daleč najboljše rezultate transformacije.

Izbira postopka transformacije na podlagi prehodne ekspresije GUS. Transformacija, ki jo posreduje Agrobacterium (SAAT), ki jo podpira ultrazvočno razbijanje, kaže bistveno višjo prehodno izražanje.
(študija in grafika: © Hussain et al., 2007)

Visoko zmogljive ultrazvočne rešitve za sonoporacijo in SAAT

Hielscher Ultrasonics ima dolgoletne izkušnje z razvojem in proizvodnjo visoko zmogljivih ultrazvočnih aparatov za laboratorije, raziskovalne objekte in industrijsko proizvodnjo z zelo visoko prepustnostjo. Za mikrobiologijo in znanost o življenju Hielscher ponuja različne rešitve za različne zahteve, potrebne za določena tkiva in njihovo zdravljenje. Za hkratno ultrazvočno obdelavo številnih vzorcev Hielscher ponuja UIP400MTP za plošče z več jamicami, VialTweeter za ultrazvočno razbijanje do 10 vial (npr. Eppendorfove cevi) ali ultrazvočni CupHorn. Ultrazvočni aparati so na voljo od 50 do 400 vatov kot laboratorijski homogenizatorji, medtem ko industrijski sistemi pokrivajo razpon moči od 500 vatov do 16 kW.
Stopite v stik z nami in nam sporočite svoje zahteve glede prijave in postopka. Naše izkušeno osebje vam bo z veseljem priporočilo najprimernejši ultrazvočni aparat za vaš biološki proces.
Spodnja tabela vam prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih aparatov: