Proizvodnja hitina in hitozana iz gob

Ultrasonication je zelo učinkovita metoda za sproščanje hitina in hitozana iz glivičnih virov, kot so gobe. Hitin in hitozan je treba depolimerizirati in deacetilirati v nadaljnji obdelavi, da se dobi visokokakovosten biopolimer. Ultrazvočno podprta depolimerizacija in deacetilacija je zelo učinkovita, preprosta in hitra tehnika, ki ima za posledico visokokakovostne hitozane z visoko molekulsko maso in vrhunsko biološko uporabnostjo.

Hitin in hitozan iz gob z ultrazvokom

Užitne in zdravilne gobe, kot so Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi ali reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (gobe), Hericium erinaceus (levja griva), Cordyceps sinensis (gosenica), Grifola frondosa (kokoš lesa), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, puranov rep) in številne druge vrste gliv, se pogosto uporabljajo kot hrana in za ekstrakcijo bioaktivnih spojin. Te gobe in ostanki predelave (gobasji odpadki) se lahko uporabijo za proizvodnjo hitozana. Ultrasonication ne spodbuja le sproščanja hitina iz strukture glivične celične stene, temveč tudi spodbuja pretvorbo hitina v dragocen hitozan z ultrazvočno podprto depolimerizacijo in deacetilacijo.

Depolimerizacijo in deacetilacijo hitina v hitozan spodbuja ultrazvočno razbijanje

Intenzivna ultrasonication z uporabo ultrazvočnega sistema tipa sonde je tehnika, ki se uporablja za spodbujanje depolimerizacije in deacetilacije hitina, kar vodi do nastanka hitozana. Hitin je naravni polisaharid, ki ga najdemo v eksoskeletih rakov, žuželk in celičnih sten nekaterih gliv. Hitozan izhaja iz hitina z odstranitvijo acetilnih skupin iz molekule hitina.

Ultrazvočni postopek za pretvorbo glivičnega hitina v hitozan

Ko se za proizvodnjo hitozana iz hitina uporablja intenzivna ultrazvočna razdalja, se hitinska suspenzija ultrazvočno razbije z visoko intenzivnimi, nizkofrekvenčnimi ultrazvočnimi valovi, običajno v območju od 20 kHz do 30 kHz. Proces ustvarja intenzivno akustično kavitacijo, ki se nanaša na nastajanje, rast in propad mikroskopskih vakuumskih mehurčkov v tekočini. Kavitacija ustvarja lokalizirane ekstremno visoke strižne sile, visoke temperature (do nekaj tisoč stopinj Celzija) in tlake (do več sto atmosfer) v tekočini, ki obdaja kavitacijske mehurčke. Ti ekstremni pogoji prispevajo k razgradnji hitinskega polimera in kasnejši deacetilaciji.
 

SEM slike hitinov in hitozanov iz dveh vrst gob: a) Hitin iz L. vellereus; b) hitin iz P. ribis; c) hitozan iz L. vellereus; d) hitozan iz P. ribis.slika in študija: © Erdoğan et al., 2017

Ultrazvočna depolimerizacija hitina

Depolimerizacija hitina poteka s kombiniranimi učinki mehanskih sil, kot so mikrotok in brizganje tekočine, pa tudi z ultrazvočno sproženimi kemijskimi reakcijami, ki jih povzročajo prosti radikali in druge reaktivne vrste, ki nastanejo med kavitacijo. Visokotlačni valovi, ki nastanejo med kavitacijo, povzročijo, da so hitinske verige podvržene strižni napetosti, kar povzroči razrez polimera na manjše delce.

Ultrazvočna deacetilacija hitina

Poleg depolimerizacije intenzivna ultrazvočna razglasitev spodbuja tudi deacetilacijo hitina. Deacetilacija vključuje odstranitev acetilnih skupin iz molekule hitina, kar vodi do nastanka hitozana. Intenzivna ultrazvočna energija, zlasti visoke temperature in tlaki, ki nastanejo med kavitacijo, pospešijo reakcijo deacetilacije. Reaktivni pogoji, ki jih ustvarja kavitacija, pomagajo prekiniti acetilne vezi v hitinu, kar povzroči sproščanje ocetne kisline in pretvorbo hitina v hitozan.
Na splošno intenzivna ultrazvočna razširitev izboljša procese depolimerizacije in deacetilacije z zagotavljanjem potrebne mehanske in kemične energije za razgradnjo hitinskega polimera in olajšanje pretvorbe v hitozan. Ta tehnika ponuja hitro in učinkovito metodo za proizvodnjo hitozana iz hitina, s številnimi aplikacijami v različnih industrijah, vključno s farmacevtsko industrijo, kmetijstvom in biomedicinskim inženiringom.

Industrijska proizvodnja hitozana iz gob z močnim ultrazvokom

Komercialna proizvodnja hitina in hitozana temelji predvsem na odpadkih morske industrije (npr. ribolov, nabiranje školjk itd.). Različni viri surovin imajo za posledico različne kakovosti hitina in hitosana, kar je posledica nihanj proizvodnje in kakovosti zaradi sezonskih sprememb ribolova. Poleg tega hitozan, pridobljen iz glivičnih virov, ponuja domnevno boljše lastnosti, kot so homogena dolžina polimera in večja topnost v primerjavi s kitozanom iz morskih virov. (prim. Ghormade et al., 2017) Da bi zagotovili enoten hitozan, je ekstrakcija hitina iz glivičnih vrst postala stabilna alternativna proizvodnja. Proizvodnjo hitina in citiosana iz gliv je mogoče enostavno in zanesljivo doseči s tehnologijo ultrazvočne ekstrakcije in deacetilacije. Intenzivna ultrazvočna razbijanje moti celične strukture za sproščanje hitina in spodbuja prenos mase v vodnih topilih za vrhunske donose hitina in učinkovitost ekstrakcije. Naknadna ultrazvočna deacetilacija pretvori hitin v dragocen hitozan. Ultrazvočna ekstrakcija hitina in deacetilacija v hitozan se lahko linearno prilagodita kateri koli komercialni proizvodni ravni.

Sonication intenzivira proizvodnjo glivičnega hitozana in naredi proizvodnjo učinkovitejšo in ekonomičnejšo.(slika in študija: © Zhu et al., 2019)

Rezultati raziskav za ultrazvočno deacetilacijo hitina in hitozana

Zhu et al. (2018) v svoji študiji zaključujejo, da se je ultrazvočna deacetilacija izkazala za ključni preboj, ki pretvarja β-hitin v hitozan z 83–94% deacetilacijo pri znižanih reakcijskih temperaturah. Na levi sliki je prikazana SEM slika ultrazvočno deacetiliranega hitozana (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (slika in študija: © Zhu et al., 2018)
V njihovem protokolu je bila raztopina NaOH (20 w/v %) pripravljena z raztapljanjem kosmičev NaOH v vodi DI. Alkalna raztopina je bila nato dodana sedimentu GLSP (0,5 g) v razmerju trdne snovi in tekočine 1:20 (g: ml) v centrifugalno cev. Hitozan so dodali NaCl (40 ml, 0,2 M) in ocetni kislini (0,1 M) v volumskem razmerju raztopine 1:1. Suspenzija je bila nato izpostavljena ultrazvoku pri blagi temperaturi 25 ° C 60 minut z uporabo ultrazvočnega zvočnega aparata (250 W, 20 kHz). (prim. Zhu et al., 2018)
 
(2021) ugotovili, da na hitrost razgradnje raztopin hitozana redko vplivajo koncentracije kisline, ki se uporablja za raztapljanje polimera, in je v veliki meri odvisna od temperature, intenzivnosti ultrazvočnih valov in ionske moči medija, ki se uporablja za raztapljanje polimera. (prim. Pandit et al., 2021)
 
(2019) so kot glivično surovino uporabili praške spore Ganoderma lucidum in raziskali ultrazvočno podprto deacetilacijo in učinke parametrov obdelave, kot so čas ultrazvočne obdelave, razmerje med trdno in tekočino, koncentracija NaOH in moč obsevanja na stopnjo deacetilacije (DD) hitozana. Najvišja vrednost DD je bila pridobljena pri naslednjih ultrazvočnih parametrih: 20 min ultrazvočna razbijanje pri 80W, 10% (g: ml) NaOH, 1:25 (g: ml). Površinska morfologija, kemijske skupine, toplotna stabilnost in kristalnost ultrazvočno pridobljenega hitozana so bili preučeni z uporabo SEM, FTIR, TG in XRD. Raziskovalna skupina poroča o znatnem povečanju stopnje deacetilacije (DD), dinamične viskoznosti ([η]) in molekulske mase (Mv ̄) ultrazvočno proizvedenega hitozana. Rezultati so poudarili tehniko ultrazvočne deacetilacije gliv, zelo močno proizvodno metodo za hitozan, ki je primerna za biomedicinske aplikacije. (prim. Zhu et al., 2019)

Vrhunska kakovost hitozana z ultrazvočno depolimerizacijo in deacetilacijo

Ultrazvočno vodeni procesi ekstrakcije hitina? hitozana in depolimerizacije so natančno nadzorovani, ultrazvočni procesni parametri pa se lahko prilagodijo surovinam in ciljni kakovosti končnega izdelka (npr. Molekulska masa, stopnja deacetilacije). To omogoča prilagoditev ultrazvočnega procesa zunanjim dejavnikom in nastavitev optimalnih parametrov za vrhunski rezultat in učinkovitost.
Ultrazvočno deacetilirani hitozan kaže odlično biološko uporabnost in biokompatibilnost. Ko ultrazvočno pripravljene biopolimere hitozana primerjamo s toplotno pridobljenim hitozanom glede biomedicinskih lastnosti, ultrazvočno proizveden hitozan kaže znatno izboljšano sposobnost preživetja fibroblastov (celica L929) in povečano antibakterijsko aktivnost za Escherichia coli (E. coli) in Staphylococcus aureus (S. aureus).
(prim. Zhu et al., 2018)
 

Slike vrstične elektronske mikroskopije (SEM) v povečavi 100× a) gladiusa, b) ultrazvočno obdelanega gladija, c) β-hitina, d) ultrazvočno obdelanega β-hitina in e) hitozana (vir: Preto et al. 2017)

Visoko zmogljiva ultrazvočna oprema za obdelavo hitina in hitozana

Razdrobljenost hitina in detilacija hitina v hitozan zahteva zmogljivo in zanesljivo ultrazvočno opremo, ki lahko zagotovi visoke amplitude, ponuja natančno nadzor nad procesnimi parametri in se lahko upravlja 24 ur na dan, 7 dni v tednu pod veliko obremenitvijo in v zahtevnih okoljih. Paleta izdelkov Hielscher Ultrasonics zanesljivo izpolnjuje te zahteve. Poleg izjemne ultrazvočne zmogljivosti se Hielscher ultrazvočni aparati ponašajo z visoko energetsko učinkovitostjo, kar je pomembna ekonomska prednost – še posebej, če se uporablja v komercialni proizvodnji v velikem obsegu.
Hielscher ultrazvočni sistemi so visoko zmogljivi sistemi, ki so lahko opremljeni z dodatki, kot so sonotrode, ojačevalniki, reaktorji ali pretočne celice, da optimalno ustrezajo vašim procesnim potrebam. Z digitalnim barvnim zaslonom, možnostjo prednastavitve ultrazvočnih tekov, samodejnim snemanjem podatkov na integrirano kartico SD, daljinskim upravljanjem brskalnika in številnimi drugimi funkcijami, Hielscher ultrazvočni aparati zagotavljajo najvišji nadzor nad procesom in prijaznost do uporabnika. V kombinaciji z robustnostjo in veliko nosilnostjo so Hielscher ultrazvočni sistemi vaš zanesljiv delovni konj v proizvodnji. 
Fragmentacija hitina in deacetilacija zahtevata močan ultrazvok, da se doseže ciljna pretvorba in končni produkt hitozana visoke kakovosti. Zlasti za fragmentacijo hitinskih kosmičev in korake depolimerizacije? deacetilacije so ključne visoke amplitude in povišani tlaki. Industrijski ultrazvočni procesorji Hielscher Ultrasonics zlahka zagotavljajo zelo visoke amplitude. Amplitude do 200 μm se lahko neprekinjeno izvajajo v 24/7 delovanju. Za še višje amplitude so na voljo prilagojene ultrazvočne sonotrode. Močna zmogljivost Hielscher ultrazvočnih sistemov omogoča učinkovito in hitro depolimerizacijo in deacetilacijo v varnem in uporabniku prijaznem procesu.
 

Sinergistično zdravljenje hitina izboljšano z ultrazvokom

Da bi premagali pomanjkljivosti (tj. nizko učinkovitost, visoke stroške energije, dolg čas obdelave, strupena topila) tradicionalne kemične in encimske deacecetacije hitina, je bil ultrazvok visoke intenzivnosti integriran v obdelavo hitina in hitosana. Visoka intenzivnost ultrazvočnega razbijanja in posledični učinki akustične kavitacije vodijo do hitrega rezanja polimernih verig in zmanjšajo polidisperznost, s čimer spodbujajo sintezo hitozana. Poleg tega ultrazvočne strižne sile okrepijo prenos mase v raztopini, tako da se poveča kemična, hidrolitska ali encimska reakcija. Ultrazvočno zdravljenje hitina se lahko kombinira z že obstoječimi tehnikami predelave hitina, kot so kemijske metode, hidroliza ali encimski postopki.

Ultrazvočno podprta kemična deacetilacija in depolimerizacija

Ker je hitin nereaktiven in netopen biopolimer, mora biti podvržen procesnim fazam demineralizacije, deproteinizacije in depolimerizacije? deacetilacije, da se dobi topen in bioacetiziran hitozan. Ti procesni koraki vključujejo zdravljenje z močnimi kislinami, kot je HCl, in močnimi bazami, kot sta NaOH in KOH. Ker so ti konvencionalni procesni koraki neučinkoviti, počasni in zahtevajo visoke energije, intenziviranje procesa z ultrazvočnim razbijanjem bistveno izboljša proizvodnjo hitosana. Uporaba močnega ultrazvoka poveča donos in kakovost hitosana, skrajša postopek z dni na nekaj ur, omogoča blažja topila in naredi celoten proces bolj energetsko učinkovit.

Ultrazvočno izboljšana deproteinizacija hitina

(2021) so v svoji raziskavi deproteinizacije hitina ugotovili, da je “Uporaba ultrazvoka za proizvodnjo biopolimerov je zmanjšala vsebnost beljakovin in velikost delcev hitina. Hitozan z visoko stopnjo deacetilacije in srednje molekulske mase je bil proizveden z ultrazvočno pomočjo.”

Ultrazvočna hidroliza za hitinsko depolimerizacijo

Za kemično hidrolizo se za deacetilacijo hitina uporabljajo kisline ali alkalije, vendar se bolj uporablja alkalna deacetilacija (npr. natrijev hidroksid NaOH). Kislinska hidroliza je alternativna metoda tradicionalni kemični deacetilaciji, kjer se raztopine organskih kislin uporabljajo za depolimerizacijo hitina in hitozana. Metoda kislinske hidrolize se večinoma uporablja, kadar mora biti molekulska masa hitina in hitozana homogena. Ta konvencionalni postopek hidrolize je znan kot počasen in energetsko in stroškovno intenziven. Potreba po močnih kislinah, visokih temperaturah in tlakih so dejavniki, ki hidrolitski hitozanski proces spremenijo v zelo drag in dolgotrajen postopek. Uporabljene kisline zahtevajo nadaljnje procese, kot sta nevtralizacija in razsoljevanje.
Z vključitvijo ultrazvoka visoke moči v proces hidrolize se lahko znatno znižajo zahteve glede temperature in tlaka za hidrolitsko cepitev hitina in hitosana. Poleg tega ultrazvočna razbijanje omogoča nižje koncentracije kislin ali uporabo blažjih kislin. Zaradi tega je postopek bolj trajnosten, učinkovit, stroškovno učinkovit in okolju prijaznejši.

Ultrazvočno podprta kemična deacetilacija

Kemično razgradnjo in deakteilacijo hitina in hitozana dosežemo predvsem z obdelavo hitina ali hitozana z mineralnimi kislinami (npr. klorovodikovo kislino HCl), natrijevim nitritom (NaNO₂) ali vodikov peroksid (H₂O₂). Ultrazvok izboljša hitrost deacetilacije in s tem skrajša reakcijski čas, potreben za doseganje ciljne stopnje deacetilacije. To pomeni, da ultrazvočna obdelava skrajša potreben čas obdelave 12-24 ur na nekaj ur. Poleg tega ultrazvočna razbijanje omogoča bistveno nižje kemične koncentracije, na primer 40% (m/w) natrijevega hidroksida z uporabo ultrazvoka, medtem ko je 65% (w? w) potrebnih brez uporabe ultrazvoka.

Ultrazvočno-encimska deacetilacija

Medtem ko je encimska deacetilacija blaga, okolju prijazna oblika predelave, so njena učinkovitost in stroški neekonomični. Zaradi kompleksne, delovno intenzivne in drage izolacije in čiščenja encimov iz končnega izdelka se encimska deacetilacija hitina ne izvaja v komercialni proizvodnji, temveč se uporablja le v znanstvenoraziskovalnem laboratoriju.
Ultrazvočna predobdelava pred encimsko deacetlitacijo fragmentira molekule hitina, s čimer se poveča površina in postane več površine na voljo encimom. Visoko zmogljiva ultrazvočna razbijanja pomaga izboljšati encimsko deacetilacijo in naredi postopek bolj ekonomičen.