Proizvodnja hitina in hitozana iz gob

Ultrazvočna obdelava je zelo učinkovita metoda za sproščanje hitina in hitozana iz glivnih virov, kot so gobe. Za pridobitev visokokakovostnega biopolimera je treba hitin in hitozan v nadaljnjih postopkih obdelave depolimerizirati in deacetilirati. Depolimerizacija in deacetilacija s pomočjo ultrazvoka sta zelo učinkovita, preprosta in hitra tehnika, s katero pridobimo visokokakovostne hitozane z visoko molekulsko maso in boljšo biološko uporabnostjo.

Pridobivanje hitina in hitozana iz gob z ultrazvočno obdelavo

Užitne in zdravilne gobe, kot so Lentinus edodes (šitake), Ganoderma lucidum (lingzhi ali reiši), Inonotus obliquus (čaga), Agaricus bisporus (dvotrosni kukmak), Hericium erinaceus (levja griva), Cordyceps sinensis (gosenicina gliva), Grifola frondosa (velika zraščenka), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, pisana ploskocevka), in številne druge vrste gliv se pogosto uporabljajo kot hrana in za ekstrakcijo bioaktivnih spojin. Te gobe in ostanke predelave (odpadke gob) je mogoče uporabiti za proizvodnjo hitozana. Ultrazvočna obdelava ne spodbuja le sproščanja hitina iz strukture glivne celične stene, temveč tudi pretvorbo hitina v dragoceni hitozan z depolimerizacijo in deacetilacijo s pomočjo ultrazvoka.

Sonikacija spodbuja depolimerizacijo in deacetilacijo hitina v hitozan

Intenzivna ultrazvočna obdelava z ultrazvočnim sistemom s sondo je tehnika, ki se uporablja za spodbujanje depolimerizacije in deacetilacije hitina, kar vodi do nastanka hitozana. Hitin je naravno prisoten polisaharid, ki ga najdemo v zunanjih skeletih rakov in žuželk ter v celičnih stenah nekaterih gliv. Hitozan pridobimo iz hitina z odstranitvijo acetilnih skupin iz molekule hitina.

Ultrazvočni postopek pretvorbe glivnega hitina v hitozan

Pri uporabi intenzivne ultrazvočne obdelave za proizvodnjo hitozana iz hitina se suspenzija hitina sonikira z ultrazvočnimi valovi visoke intenzivnosti in nizke frekvence, običajno v območju od 20 kHz do 30 kHz. Postopek povzroča intenzivno akustično kavitacijo, ki pomeni nastajanje, rast in sesedanje mikroskopskih vakuumskih mehurčkov v tekočini. Kavitacija v tekočini okoli kavitacijskih mehurčkov lokalno ustvarja izjemno velike strižne sile, visoke temperature (do več tisoč stopinj Celzija) in tlake (do več sto atmosfer). Te skrajne razmere prispevajo k razgradnji hitinskega polimera in poznejši deacetilaciji.
 

Posnetki SEM hitinov in hitozanov iz dveh vrst gob: a) hitin iz L. vellereus; b) hitin iz P. ribis; c) hitozan iz L.vellereus; d) hitozan iz P. ribis.
slika in študija: © Erdoğan et al., 2017

Ultrazvočna depolimerizacija hitina

Depolimerizacija hitina poteka s kombiniranim delovanjem mehanskih sil, kot sta mikrotok in nastajanje tekočinskih curkov, ter z ultrazvočno sproženimi kemičnimi reakcijami, ki jih povzročajo prosti radikali in druge reaktivne zvrsti, nastale med kavitacijo. Visokotlačni valovi, ki nastajajo med kavitacijo, povzročijo strižne napetosti v hitinskih verigah, zaradi česar se polimer razcepi na manjše fragmente.

Ultrazvočna deacetilacija hitina

Poleg depolimerizacije intenzivna ultrazvočna obdelava spodbuja tudi deacetilacijo hitina. Deacetilacija vključuje odstranjevanje acetilnih skupin iz molekule hitina, kar vodi do nastanka hitozana. Intenzivna ultrazvočna energija, zlasti visoke temperature in tlaki, ki nastajajo med kavitacijo, pospešuje reakcijo deacetilacije. Reaktivne razmere, ki jih ustvarja kavitacija, pomagajo prekiniti acetilne vezi v hitinu, kar povzroči sproščanje ocetne kisline in pretvorbo hitina v hitozan.
Intenzivna ultrazvočna obdelava torej izboljšuje tako depolimerizacijo kot deacetilacijo, saj zagotavlja potrebno mehansko in kemično energijo za razgradnjo hitinskega polimera in olajša pretvorbo v hitozan. Ta tehnika omogoča hitro in učinkovito proizvodnjo hitozana iz hitina za številne uporabe v različnih panogah, vključno s farmacijo, kmetijstvom in biomedicinskim inženirstvom.

Industrijska proizvodnja hitozana iz gob z visokozmogljivim ultrazvokom

Komercialna proizvodnja hitina in hitozana temelji predvsem na odpadkih pomorskih dejavnosti (tj. ribolova, nabiranja školjk itd.). Različni viri surovin dajejo hitin in hitozan različne kakovosti, kar zaradi sezonskih sprememb pri ribolovu povzroča nihanja v proizvodnji in kakovosti. Poleg tega naj bi imel hitozan iz glivnih virov v primerjavi s hitozanom iz morskih virov boljše lastnosti, kot sta enakomerna dolžina polimera in večja topnost. (prim. Ghormade et al., 2017) Za zagotavljanje hitozana enotne kakovosti je ekstrakcija hitina iz glivnih vrst postala stabilna alternativna možnost proizvodnje. Proizvodnjo hitina in hitozana iz gliv je mogoče preprosto in zanesljivo izvajati s tehnologijo ultrazvočne ekstrakcije in deacetilacije. Intenzivna sonikacija poruši celične strukture, da se sprosti hitin, ter spodbuja prenos snovi v vodnih topilih za večji izkoristek hitina in večjo učinkovitost ekstrakcije. Naknadna ultrazvočna deacetilacija pretvori hitin v dragoceni hitozan. Tako ultrazvočno ekstrakcijo hitina kot deacetilacijo v hitozan je mogoče linearno povečati na kateri koli obseg komercialne proizvodnje.

Sonikacija intenzivira proizvodnjo glivnega hitozana ter jo naredi učinkovitejšo in gospodarnejšo.
(slika in študija: © Zhu et al., 2019)

Rezultati raziskav ultrazvočne deacetilacije hitina in hitozana

Zhu et al. (2018) v svoji študiji ugotavljajo, da se je ultrazvočna deacetilacija izkazala za ključen preboj, saj pretvori β-hitin v hitozan s 83–94% deacetilacijo pri nižjih reakcijskih temperaturah. Slika na levi prikazuje posnetek SEM ultrazvočno deacetiliranega hitozana (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (slika in študija: © Zhu et al., 2018)
V njihovem protokolu so raztopino NaOH (20 w/v %) pripravili z raztapljanjem kosmičev NaOH v deionizirani vodi. Alkalno raztopino so nato v centrifugirni epruveti dodali sedimentu GLSP (0,5 g) pri razmerju med trdno in tekočo fazo 1:20 (g: mL). Hitozan so dodali NaCl (40 mL, 0,2 M) in ocetni kislini (0,1 M) pri prostorninskem razmerju raztopin 1:1. Suspenzijo so nato 60 min izpostavljali ultrazvoku pri zmerni temperaturi 25°C z ultrazvočno napravo s sondo (250W, 20kHz). (prim. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) so ugotovili, da koncentracije kisline, uporabljene za raztapljanje polimera, redko vplivajo na hitrost razgradnje raztopin hitozana, ki je v veliki meri odvisna od temperature, intenzivnosti ultrazvočnih valov in ionske jakosti medijev, uporabljenih za raztapljanje polimera. (prim. Pandit et al., 2021)
 
V drugi študiji so Zhu et al. (2019) kot glivno surovino uporabili prah trosov Ganoderma lucidum ter raziskovali deacetilacijo s pomočjo ultrazvoka in vpliv procesnih parametrov, kot so čas sonikacije, razmerje med trdno in tekočo fazo, koncentracija NaOH in moč obsevanja, na stopnjo deacetilacije (DD) hitozana. Najvišjo vrednost DD so dosegli pri naslednjih ultrazvočnih parametrih: 20 min sonikacije pri 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Površinsko morfologijo, kemične skupine, toplotno stabilnost in kristaliničnost ultrazvočno pridobljenega hitozana so preučili z metodami SEM, FTIR, TG in XRD. Raziskovalna skupina poroča o znatnem povečanju stopnje deacetilacije (DD), dinamične viskoznosti ([η]) in molekulske mase (Mv¯) ultrazvočno proizvedenega hitozana. Rezultati so poudarili, da je tehnika ultrazvočne deacetilacije gliv zelo učinkovita metoda za proizvodnjo hitozana, primernega za biomedicinsko uporabo. (prim. Zhu et al., 2019)

Vrhunska kakovost hitozana z ultrazvočno depolimerizacijo in deacetilacijo

Ultrazvočno vodene postopke ekstrakcije in depolimerizacije hitina / hitozana je mogoče natančno nadzorovati, ultrazvočne procesne parametre pa prilagoditi surovinam in ciljni kakovosti končnega izdelka (npr. molekulski masi, stopnji deacetilacije). To omogoča prilagoditev ultrazvočnega postopka zunanjim dejavnikom in nastavitev optimalnih parametrov za boljši rezultat in večjo učinkovitost.
Ultrazvočno deacetilirani hitozan izkazuje odlično biološko uporabnost in biokompatibilnost. Pri primerjavi biomedicinskih lastnosti ultrazvočno pripravljenih hitozanskih biopolimerov s toplotno pridobljenim hitozanom ultrazvočno proizvedeni hitozan izkazuje znatno boljšo viabilnost fibroblastov (celic L929) in okrepljeno protibakterijsko delovanje tako proti Escherichia coli (E. coli) kot proti Staphylococcus aureus (S. aureus).
(prim. Zhu et al., 2018)
 

Posnetki z vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) pri povečavi 100×: a) gladij, b) ultrazvočno obdelani gladij, c) β-hitin, d) ultrazvočno obdelani β-hitin in e) hitozan (vir: Preto et al. 2017)

Visokozmogljiva ultrazvočna oprema za obdelavo hitina in hitozana

Fragmentacija hitina in deacetilacija hitina v hitozan zahtevata zmogljivo in zanesljivo ultrazvočno opremo, ki lahko zagotavlja visoke amplitude, omogoča natančen nadzor procesnih parametrov ter deluje 24/7 pri veliki obremenitvi in v zahtevnih okoljih. Paleta izdelkov Hielscher Ultrasonics zanesljivo izpolnjuje te zahteve. Poleg izjemne ultrazvočne zmogljivosti se ultrazvočne naprave Hielscher ponašajo z visoko energijsko učinkovitostjo, kar je pomembna gospodarska prednost – zlasti pri uporabi v komercialni proizvodnji velikega obsega.
Ultrazvočne naprave Hielscher so visokozmogljivi sistemi, ki jih je mogoče opremiti z dodatki, kot so sonotrode, ojačevalniki amplitude, reaktorji ali pretočne celice, da optimalno ustrezajo potrebam vašega procesa.
 Z digitalnim barvnim zaslonom, možnostjo prednastavitve sonikacijskih ciklov, samodejnim zapisovanjem podatkov na vgrajeno kartico SD, oddaljenim upravljanjem prek brskalnika in številnimi drugimi funkcijami ultrazvočne naprave Hielscher zagotavljajo najvišjo raven nadzora procesa in prijaznosti do uporabnika. Ultrazvočni sistemi Hielscher so zaradi robustnosti in sposobnosti delovanja pri velikih obremenitvah vaš zanesljivi delovni konj v proizvodnji. 
Fragmentacija in deacetilacija hitina zahtevata zmogljiv ultrazvok za doseganje ciljne pretvorbe in visokokakovostnega končnega hitozanskega izdelka. Visoke amplitude in povišani tlaki so ključni zlasti za fragmentacijo hitinskih kosmičev in korake depolimerizacije / deacetilacije. Industrijski ultrazvočni procesorji Hielscher Ultrasonics zlahka zagotavljajo zelo visoke amplitude. Amplitude do 200µm je mogoče neprekinjeno vzdrževati pri delovanju 24/7. Za še višje amplitude so na voljo ultrazvočne sonotrode po meri. Razpoložljiva moč ultrazvočnih sistemov Hielscher omogoča učinkovito in hitro depolimerizacijo in deacetilacijo v varnem in uporabniku prijaznem postopku.
 

Sinergijska obdelava hitina, izboljšana z ultrazvočno obdelavo

Za odpravo pomanjkljivosti (tj. nizke učinkovitosti, visokih stroškov energije, dolgega časa obdelave in strupenih topil) tradicionalne kemične in encimske deacetilacije hitina je bil v obdelavo hitina in hitozana vključen ultrazvok visoke intenzivnosti. Sonikacija visoke intenzivnosti in posledični učinki akustične kavitacije povzročijo hitro cepljenje polimernih verig in zmanjšajo polidisperznost ter s tem spodbujajo sintezo hitozana. Poleg tega ultrazvočne strižne sile intenzivirajo prenos snovi v raztopini, kar izboljša kemične, hidrolitične ali encimske reakcije. Ultrazvočno obdelavo hitina je mogoče kombinirati z obstoječimi tehnikami obdelave hitina, kot so kemične metode, hidroliza ali encimski postopki.

Kemična deacetilacija in depolimerizacija s pomočjo ultrazvoka

Ker je hitin nereaktiven in netopen biopolimer, mora za pridobitev topnega in biološko dostopnega hitozana prestati procesne korake demineralizacije, deproteinizacije in depolimerizacije / deacetilacije. Ti procesni koraki vključujejo obdelavo z močnimi kislinami, kot je HCl, in močnimi bazami, kot sta NaOH in KOH. Ker so ti običajni procesni koraki neučinkoviti, počasni in zahtevajo veliko energije, intenziviranje procesa s sonikacijo znatno izboljša proizvodnjo hitozana. Uporaba visokozmogljivega ultrazvoka poveča izkoristek in kakovost hitozana, skrajša postopek z več dni na nekaj ur, omogoča uporabo blažjih topil in poveča energijsko učinkovitost celotnega postopka.

Deproteinizacija hitina, izboljšana z ultrazvokom

Vallejo-Dominguez et al. (2021) so v svoji raziskavi deproteinizacije hitina ugotovili, da je »uporaba ultrazvoka za proizvodnjo biopolimerov zmanjšala vsebnost beljakovin in velikost delcev hitina. S pomočjo ultrazvoka je bil proizveden hitozan z visoko stopnjo deacetilacije in srednjo molekulsko maso.«

Ultrazvočna hidroliza za depolimerizacijo hitina

Pri kemični hidrolizi se za deacetilacijo hitina uporabljajo kisline ali alkalije, vendar se alkalna deacetilacija (npr. z natrijevim hidroksidom NaOH) uporablja pogosteje. Kislinska hidroliza je alternativna metoda tradicionalni kemični deacetilaciji, pri kateri se raztopine organskih kislin uporabljajo za depolimerizacijo hitina in hitozana. Metoda kislinske hidrolize se večinoma uporablja, kadar mora biti molekulska masa hitina in hitozana enotna. Ta običajni postopek hidrolize je znan po počasnosti ter visoki porabi energije in visokih stroških. Potreba po močnih kislinah, visokih temperaturah in tlakih je dejavnik, zaradi katerega je hidrolitični postopek pridobivanja hitozana zelo drag in dolgotrajen. Uporabljene kisline zahtevajo nadaljnje postopke, kot sta nevtralizacija in razsoljevanje.
Z vključitvijo visokozmogljivega ultrazvoka v postopek hidrolize je mogoče znatno znižati zahtevane temperature in tlake za hidrolitično cepljenje hitina in hitozana. Poleg tega sonikacija omogoča nižje koncentracije kislin ali uporabo blažjih kislin. S tem postane postopek bolj trajnosten, učinkovitejši, stroškovno ugodnejši in okolju prijaznejši.

Kemična deacetilacija s pomočjo ultrazvoka

Kemična razgradnja in deacetilacija hitina in hitozana se večinoma izvajata z obdelavo hitina ali hitozana z mineralnimi kislinami (npr. klorovodikovo kislino HCl), natrijevim nitritom (NaNO₂) ali vodikovim peroksidom (H₂O₂). Ultrazvok poveča hitrost deacetilacije in tako skrajša reakcijski čas, potreben za doseganje ciljne stopnje deacetilacije. To pomeni, da sonikacija skrajša potrebni čas obdelave z 12–24 ur na nekaj ur. Poleg tega sonikacija omogoča znatno nižje koncentracije kemikalij, na primer 40% (w/w) natrijevega hidroksida pri uporabi sonikacije, medtem ko je brez uporabe ultrazvoka potrebnih 65% (w/w).

Ultrazvočno-encimska deacetilacija

Čeprav je encimska deacetilacija blag in okolju prijazen način obdelave, je z vidika učinkovitosti in stroškov negospodarna. Zaradi zahtevne, delovno intenzivne in drage naknadne izolacije ter čiščenja encimov iz končnega izdelka se encimska deacetilacija hitina ne izvaja v komercialni proizvodnji, temveč se uporablja le v znanstvenoraziskovalnih laboratorijih.
Ultrazvočna predobdelava pred encimsko deacetilacijo fragmentira molekule hitina, s čimer poveča površino in encimom omogoči dostop do večje površine. Visokozmogljiva sonikacija pomaga izboljšati encimsko deacetilacijo in poveča gospodarnost postopka.