Virusna cepiva na osnovi celičnih kultur – Učinkovito razbijanje celic s sonikacijo

Pogosta vprašanja o ultrazvočnem razbijanju celic pri proizvodnji cepiv na osnovi virusov

Kaj je ultrazvočno razbijanje celic?

Ultrazvočno razbijanje celic uporablja visokointenzivni ultrazvok, običajno v območju od 20 do 30 kHz, za pretrganje celičnih membran in sproščanje intracelularne vsebine. Visokozmogljivi ultrazvočni valovi v tekočini ustvarjajo kavitacijske mehurčke. Ko se ti mehurčki sesedejo, ustvarijo močne lokalne strižne sile in mikrotoke, ki mehansko razbijejo celice ter spodbujajo prenos mase med notranjostjo celice in okoliškim medijem. Pri proizvodnji cepiv se ta postopek uporablja za lizo celičnih kultur, okuženih z virusom, ter za sproščanje intracelularnih in z membrano povezanih virusnih delcev v končni proizvod.

Zakaj za pridobivanje virusov uporabljati ultrazvok namesto kemične ali encimske lize?

Ultrazvok deluje izključno na podlagi mehanskih sil. Ni potrebno uporabljati detergentov, lizozima, proteinaze K ali drugih reagentov za lizo, ki bi lahko spremenili lizat, motili nadaljnje čiščenje ali jih bilo treba odstraniti pred nadaljnjo obdelavo. Kemični reagenti običajno zahtevajo dolgotrajno večstopenjsko pripravo, da se prepreči zaviranje nadaljnjih testov in drugih korakov po obdelavi. Enzimska razgradnja zahteva dolge inkubacijske čase in pogosto prinaša nereproducibilne rezultate. Ultrazvočna liza združuje korake resuspenzije, razgradnje in ekstrakcije v en sam neprekinjen postopek. Kadar vaš postopek zahteva korak z detergentom ali encimom, ga ultrazvok okrepi, namesto da ga nadomesti: kavitacija oslabi membrane in izboljša enakomerno izpostavljenost vseh celic reagentu.

Kako se ultrazvočna obdelava razlikuje od mehanskih metod homogenizacije?

Ultrazvočni aparati s sondo prenašajo ultrazvočno energijo neposredno in učinkovito, saj je sonotroda v neposrednem stiku z vzorcem. Pri mehansko pogonjenih tehnikah homogenizacije je učinkovitost prenosa energije pogosto nižja. Ultrazvočna obdelava ne potrebuje potrošnih mlevnih kroglic ali vrtljivih tesnil v toku proizvoda, niti šob ali komor, ki se lahko zamašijo z viskozno celično maso, niti ne povzroča navzkrižne kontaminacije med serijami.

Ali lahko ultrazvok poškoduje virus ali antigen?

To je ključna naloga optimizacije, ki jo je mogoče nadzorovati. S prilagajanjem parametrov ultrazvočne obdelave je mogoče natančno nadzorovati učinke sonikacije: nizka amplituda in kratka sonikacija imata zelo blage učinke, medtem ko visoke amplitude, povečan tlak in daljše trajanje sonikacije povzročajo intenzivno obdelavo. Ker je mogoče intenzivnost natančno prilagoditi biološkemu vzorcu, se izognemo prekomerni obdelavi, razgradnji in izgubi donosa. V praksi se amplituda, čas zadrževanja in število prehodov nastavijo na najmanjšo vrednost, s katero se doseže ciljna stopnja razgradnje, ob neprekinjenem spremljanju temperature in hlajenju.

Ali ultrazvočna obdelava zmanjša viskoznost pridelka?

Da. Goste pridelke z visoko gostoto celic zaznamuje viskoznost, zaradi česar jih je težko črpati, saj se iz njih sprošča nefragmentirana DNK gostiteljske celice. Ultrazvočna obdelava razreže in fragmentira DNK in RNK, hkrati pa raztopi celično maso in razgradi celične ostanke. Rezultat je homogena, črpana suspenzija, ki omogoča učinkovitejše čiščenje, centrifugiranje in kromatografijo. Fragmentacija DNK in RNK s kontrolirano ultrazvočno obdelavo je uveljavljena laboratorijska uporaba iste tehnologije.

Ali lahko proces izvajam v neprekinjenem vgrajenem načinu?

Da. Ultrazvočni aparati Hielscher so zasnovani za neprekinjeno delovanje 24 ur na dan, 7 dni na teden v industrijskih okoljih in jih je mogoče opremiti s pretočnimi celicami in reaktorji za neprekinjeno vgrajeno ultrazvočno obdelavo, recirkulacijskimi zankami ali vgradnjo v proizvodne skide in predelovalne linije. Mogoče je tako enoprehodno kot večprehodno delovanje.

Kako lahko preidem iz laboratorija v serijsko proizvodnjo?

Linearno, na podlagi merljivega vnosa energije. Vse rezultate ultrazvočne obdelave, pridobljene z ultrazvočnim homogenizatorjem Hielscher, je mogoče linearno povečati na večje zmogljivosti v industrijski proizvodnji; parametre ultrazvočne obdelave, razvite z namiznim ultrazvočnim aparatom, je mogoče neposredno prenesti na večje sisteme Hielscher. Merilo za povečanje obsega je specifični vnos energije na volumen, skupaj z amplitudo, časom zadrževanja in temperaturo. Svetovanje podjetja Hielscher na področju procesov vključuje priporočila za optimizacijo parametrov (amplituda, specifična energija E/V, čas zadrževanja, temperatura in nadzor tlaka), vezana na merljiv vnos energije.

Ali je ultrazvočno razbijanje celic primerno za proizvodnjo v čistih prostorih in v skladu s standardi GMP?

Ultrazvočne naprave Hielscher se lahko enostavno namestijo v laboratorijih s čistimi prostori in proizvodnih obratih. Ohišja so izdelana iz antibakterijske plastike ali nerjavečega jekla. Vsi deli, ki pridejo v stik s tekočino, kot so sonotrode in pretočne celice, so izdelani iz titana ali nerjavečega jekla in jih je mogoče sterilizirati v avtoklavu. Na voljo so posebni pretočni celični reaktorji, ki izpolnjujejo napredne zahteve CIP (clean-in-place) in SIP (sterilize-in-place). Pretvornik iz industrijske serije UIP ima stopnjo zaščite IP64 in se lahko namesti v zahtevna okolja, medtem ko je generator nameščen na daljavo. Ker Hielscherjevi sonikatorji pretvarjajo električno energijo v mehansko nihanje z zelo visokim izkoristkom, približno 80–90 %, od vtičnice do tekočine, je mogoče pretvornik vgraditi v zaprta ohišja brez rešetk, pri čemer ni potrebno prisilno hlajenje, kot sta stisnjen zrak ali voda. To pomeni tudi, da hladilno sredstvo ne pride v stik s procesom. Avtomatska dokumentacija procesa omogoča sledljivost in ponovljivost v regulirani proizvodnji.

Ali lahko ultrazvok inaktivira virus tudi za izdelavo inaktiviranega cepiva?

Da. Visokozmogljivi ultrazvok se uporablja za inaktivacijo patogenov, kot so bakterije in virusi. Z ustreznim odmerkom in intenzivnostjo ultrazvoka je mogoče celice in mikrobe obdelati v skladu s ciljem postopka, tako da ista platforma omogoča tako lizo za pridobivanje kot tudi inaktivacijo. Kombinacija ultrazvoka in toplote, znana kot termo-ultrazvok, omogoča hitrejšo sterilizacijo z znatno zmanjšano toplotno intenzivnostjo in trajanjem, kar je ugodno za ohranjanje toplotno občutljivih spojin, kot so beljakovine in antigeni. Ultrazvočna inaktivacija se običajno uporablja v kombinaciji z uveljavljeno kemijo inaktivacije, pri čemer je treba za vsak posamezen virus validirati celotno kinetiko inaktivacije.

Ali je mogoče isti sistem uporabiti tudi za postopke priprave po žetvi?

Da. Ista platforma omogoča dispergiranje antigenov v suspenzije, polimerov ali liposomskih inkapsulacij, razpad aglomeratov in enakomerno porazdelitev antigenov ter adjuvantov na osnovi aluminija, kot je Alhydrogel™, pripravo cepiv v liposome in trdne lipidne nanodelce z natančnim nadzorom velikosti nosilcev ter postopek razplinjevanja pred polnjenjem v viale ali brizge.