Virusna cepiva na osnovi celičnih kultur – učinkovito razbijanje celic s sonikacijo
Sonikatorji Hielscher olajšajo razbijanje in solubilizacijo celičnih kultur, okuženih z virusi (npr. Vero), za pridobivanje virusa pri proizvodnji cepiv. Izkoristite zanesljivo, učinkovito lizo celičnih kultur z visokozmogljivo sonikacijo!
Razbijanje celic za pridobivanje virusa pri cepivih na osnovi celičnih kultur
Proizvodnja cepiv na osnovi celičnih kultur, npr. v celičnih linijah Vero, MDCK, EB66, CHO ali PER.C6, zahteva pridobitev virusa iz kulture ob koncu okužbenega cikla. Glede na virus je velik delež pridobljenega virusa povezan s celicami, bodisi znotrajcelično bodisi vezan na celično membrano. Popolno in nežno pridobivanje zato zahteva učinkovito razbijanje celic in solubilizacijo celične mase. Ultrazvočna liza je zanesljiva in dolgo uveljavljena metoda za razbijanje celic ter nato sproščanje virusov, virusnih beljakovin, DNK in RNK. Pri obdelavi celičnih kultur, okuženih z virusi, sonikacija – uporaba ultrazvoka visoke intenzivnosti – odpre celice, loči virusne delce od membran in celičnih ostankov ter homogenizira pridobljeni material v črpljivo suspenzijo z nizko viskoznostjo, ki jo je mogoče neposredno dovajati na čiščenje, centrifugiranje in kromatografijo.
Kako deluje sonikacija?
Ultrazvočno razbijanje celic temelji izključno na mehanskih silah. Akustična kavitacija ustvarja intenzivno lokalno strižno obremenitev in mikrotokove, ki prebijejo celične membrane in spodbujajo prenos snovi med notranjostjo celice in okolnim medijem.
Ultrazvočni sistem za proizvodnjo cepiv: Industrijski sonikator UIP2000hdT z reaktorjem iz nerjavnega jekla
Kakšne so prednosti ultrazvočnega razbijanja celic?
Ta delovni mehanizem daje sonikaciji odločilno prednost pred kemijsko lizo: ne potrebujete detergentov, lizocima, proteinaze K ali drugih litičnih reagentov, ki lahko spremenijo lizat, motijo nadaljnje čiščenje ali jih je treba pred nadaljnjo obdelavo odstraniti. Encimsko razbijanje pa nasprotno zahteva dolge inkubacijske čase in pogosto daje neponovljive rezultate. Ker je intenzivnost ultrazvočne obdelave mogoče natančno prilagoditi biološkemu vzorcu, se izognemo pretirani obdelavi, razgradnji in izgubi izkoristka.
Sonikacijo uporabite za:
- razbijanje in lizo celic, okuženih z virusi, v adherentnih in suspenzijskih kulturah
- sproščanje znotrajceličnih virusnih delcev in delcev, povezanih z membrano
- solubilizacijo celične mase in zmanjšanje viskoznosti pridobljenega materiala
- homogenizacijo in deaglomeracijo celičnih ostankov za lažje čiščenje
- dispergiranje virusnih skupkov v enotno suspenzijo
- inaktivacijo patogenov pri določeni amplitudi, tlaku in času izpostavljenosti
- okrepitev korakov lize na osnovi detergentov ali encimov, kjer so ti potrebni
Ultrazvočno razbijanje celic v industrijskem obsegu: Sonikator UIP6000hdT s pretočno celico iz nerjavnega jekla za neprekinjeno obdelavo celičnih kultur, okuženih z virusi.
Sonikator UP400St s pretočno celico FC22K za vgrajeno razbijanje celic
Zakaj uporabiti sonikacijo za pridobivanje virusa?
Shema vgrajene obdelave monovalentne rotavirusne surovine. Surovino so aseptično obdelovali neposredno iz kulturne posode (CF-10), jo s peristaltično črpalko prečrpavali skozi pretočno celico sonikatorja, da bi razbili preostale celične ostanke. Sonikirani material so nato očistili s filtracijo, preden so ga shranili v vmesno posodo za stabilizacijo.
Študija in slika: Langston in sod., 2026.
Prednosti
- natančno prilagodljivo procesu
- povsem mehanska liza brez kemikalij
- čista in higienska obdelava, pretočne celice, združljive s CIP/SIP
- visoka ponovljivost s samodejnim beleženjem podatkov
- linearno povečevanje obsega od laboratorija do proizvodnje
- enostavno in varno delovanje, daljinsko upravljanje prek brskalnika
- zanesljiva in robustna oprema za delovanje 24/7
- visoka energijska učinkovitost, pribl. 80–90% od vtičnice do tekočine
Tipična postavitev procesa za pridobivanje virusa
- Pridobivanje in koncentriranje. Pridobite okuženo celično kulturo (juha po pridobivanju, postrgane celice iz bioreaktorjev s fiksno plastjo ali za enkratno uporabo ali centrifugirana celična usedlina, resuspendirana v pufru).
- Priprava. Prilagodite pufer, pH in temperaturo. Sonikacija tudi izboljša mešanje in raztapljanje sestavin lizirnega pufra, če se uporablja korak s pomočjo pufra ali detergenta.
- Ultrazvočno razbijanje. Suspenzijo speljite skozi pretočno celico s plaščem in nadzorom temperature (recirkulacija pri šaržnem delu, enojni ali večkratni prehod pri neprekinjeni vgrajeni obdelavi). Amplitudo in zadrževalni čas nastavite na minimum, ki doseže ciljno stopnjo razbitja, da se virusni antigeni ohranijo.
- Neobvezna inaktivacija. Uporabite višjo amplitudo, povišan tlak in daljšo izpostavljenost ali termosonikacijo za inaktivacijo patogenov v skladu s strategijo cepiva.
- Nadaljnja obdelava. Očistite, centrifugirajte in/ali filtrirajte zdaj nizkoviskozni, homogeni lizat, nato sledijo kromatografija, koncentriranje in formulacija.
Po pridobivanju: formulacija z isto tehnologijo
Ista platforma Hielscher, ki razbija celice, opravlja tudi korake formulacije cepiva. Ultrazvočno dispergiranje in deaglomeracija ustvarjata enotne suspenzije antigenov, vključno s celičnimi fragmenti in beljakovinskimi antigeni, v polimerih ali liposomskih kapsulacijah. Adjuvansi na osnovi aluminija, kot je Alhydrogel™, so sestavljeni iz drobnih primarnih delcev, ki se zlahka agregirajo; ultrazvočno dispergiranje zagotavlja homogeno porazdelitev antigenov in adjuvansa, ki je potrebna za uspešno integracijo. Sonikatorji Hielscher se poleg tega uporabljajo za formulacijo zdravil in cepiv v liposome in nanostrukturirane nosilce, kot so trdni lipidni nanodelci, z natančnim nadzorom velikosti nosilca, izboljšano obremenitvijo z zdravilom in povečano stabilnostjo. Razplinjevanje končne suspenzije pred polnjenjem v viale ali brizge je še en standardni ultrazvočni korak.
Več podrobnosti najdete tukaj: Ultrazvok za proizvodnjo cepiv.
Varno, čisto in pripravljeno za regulirano proizvodnjo
- Deli, ki so v stiku z medijem, iz titana ali nerjavnega jekla, primerni za avtoklaviranje
- Na voljo so reaktorji s pretočno celico, združljivi s CIP/SIP
- Ohišja iz protibakterijske plastike ali nerjavnega jekla za namestitev v čiste prostore
- Samodejna dokumentacija procesa na kartici SD/USB, pri kateri so posegi razvidni
- Neprekinjeno delovanje 24/7, nizko vzdrževanje, brez prisilnega hlajenja
- Brez potrošnih kroglic, brez mlevnih komor, brez navzkrižne kontaminacije med serijami
Zasnova, proizvodnja in svetovanje – kakovost, narejena v Nemčiji
Ultrazvočne naprave Hielscher so znane po najvišji kakovosti in konstrukcijskih standardih. Robustnost in enostavno delovanje omogočata gladko vključitev naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Ultrazvočne naprave Hielscher z lahkoto obvladajo težke pogoje in zahtevna okolja.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in posebej poudarja visokozmogljive ultrazvočne naprave z najsodobnejšo tehnologijo in uporabniško prijaznostjo. Ultrazvočne naprave Hielscher seveda ustrezajo CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Namestitev 2x UIP1000hdT (vsak 1kW, 20kHz) za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov
Pogosta vprašanja o ultrazvočnem razbijanju celic za proizvodnjo cepiv na osnovi virusov
Kaj je ultrazvočno razbijanje celic?
Ultrazvočno razbijanje celic uporablja ultrazvok visoke intenzivnosti, običajno v območju od 20 do 30 kHz, za razbijanje celičnih membran in sproščanje znotrajceličnega materiala. Visokozmogljivi ultrazvočni valovi v tekočini ustvarjajo kavitacijske mehurčke. Ko ti mehurčki kolabirajo, ustvarjajo intenzivne lokalne strižne sile in mikrotokove, ki mehansko razbijejo celice in spodbujajo prenos snovi med notranjostjo celice in okolnim medijem. Pri proizvodnji cepiv se to uporablja za lizo celičnih kultur, okuženih z virusi, in za sproščanje znotrajceličnih virusnih delcev in delcev, povezanih z membrano, v pridobljeni material.
Zakaj za pridobivanje virusa uporabiti sonikacijo namesto kemijske ali encimske lize?
Sonikacija deluje izključno z mehanskimi silami. Ne potrebujete detergentov, lizocima, proteinaze K ali drugih litičnih reagentov, ki bi lahko spremenili lizat, motili nadaljnje čiščenje ali bi jih bilo treba pred nadaljnjo obdelavo odstraniti. Kemijski reagenti običajno zahtevajo zamudno večstopenjsko pripravo, da se prepreči zaviranje poznejših testov in drugih korakov nadaljnje obdelave. Encimsko razbijanje zahteva dolge inkubacijske čase in pogosto daje neponovljive rezultate. Ultrazvočna liza tudi združuje korake resuspendiranja, razbijanja in ekstrakcije v eno neprekinjeno operacijo. Kjer vaš proces zahteva korak s pomočjo detergenta ali encima, ga sonikacija okrepi, namesto da bi ga nadomestila: kavitacija oslabi membrane in izboljša enakomerno izpostavljenost vseh celic reagentu.
Kako se sonikacija primerja z mehanskimi metodami homogenizacije?
Sonikatorji s sondo prenašajo ultrazvočno energijo neposredno in učinkovito, ker je sonotroda v neposrednem stiku z vzorcem. Mehansko gnane tehnike homogenizacije pogosto povzročijo nižjo učinkovitost prenosa energije. Ultrazvočna obdelava ne potrebuje potrošnih mlevnih kroglic ali vrtljivih tesnil v toku izdelka, ne šob ali komor, ki se lahko zamašijo z viskozno celično maso, in ne povzroča navzkrižne kontaminacije med serijami.
Ali lahko sonikacija poškoduje virus ali antigen?
To je ključna optimizacijska naloga in jo je mogoče nadzorovati. S prilagajanjem parametrov ultrazvočne obdelave je mogoče učinke sonikacije natančno nadzorovati: nizka amplituda in kratka sonikacija imata zelo nežne učinke, visoke amplitude, povišan tlak in daljše trajanje sonikacije pa vodijo do intenzivne obdelave. Ker je intenzivnost mogoče natančno prilagoditi biološkemu vzorcu, se izognemo pretirani obdelavi, razgradnji in izgubi izkoristka. V praksi se amplituda, zadrževalni čas in število prehodov nastavijo na minimum, ki doseže ciljno stopnjo razbitja, ob neprekinjenem spremljanju temperature in hlajenju.
Ali ultrazvočna obdelava zmanjša viskoznost pridobljenega materiala?
Da. Gosti pridobljeni materiali z visoko gostoto celic so viskozni in jih je težko črpati zaradi sproščene, nefragmentirane DNK gostiteljskih celic. Ultrazvočna obdelava striže in fragmentira DNK in RNK ter solubilizira celično maso in deaglomerira celične ostanke. Rezultat je homogena, črpljiva suspenzija, ki učinkoviteje napaja čiščenje, centrifugiranje in kromatografijo. Fragmentacija DNK in RNK z nadzorovano sonikacijo je dobro uveljavljena laboratorijska uporaba iste tehnologije.
Ali lahko proces izvajam v neprekinjenem vgrajenem načinu?
Da. Sonikatorji Hielscher so zasnovani za neprekinjeno delovanje 24/7 v industrijskih okoljih in jih je mogoče konfigurirati s pretočnimi celicami in reaktorji za neprekinjeno vgrajeno sonikacijo, recirkulacijske zanke ali vključitev v proizvodne module in procesne linije. Mogoče je delovanje z enojnim in večkratnim prehodom.
Kako iz laboratorija preiti na proizvodnjo?
Linearno, na podlagi merljivega vnosa energije. Vse rezultate sonikacije, dosežene s homogenizatorjem Hielscher, je mogoče linearno povečati na višje pretoke v industrijski proizvodnji; parametre sonikacije, razvite z namiznim sonikatorjem, je mogoče neposredno prenesti na večje sisteme Hielscher. Merilo za povečevanje obsega je specifični vnos energije na prostornino skupaj z amplitudo, zadrževalnim časom in temperaturo. Procesno svetovanje Hielscher vključuje priporočila za optimizacijo parametrov (amplituda, specifična energija E/V, zadrževalni čas, nadzor temperature in tlaka), povezana z merljivim vnosom energije.
Ali je ultrazvočno razbijanje celic primerno za čiste prostore in proizvodnjo v slogu GMP?
Ultrazvočne naprave Hielscher je mogoče enostavno namestiti v laboratorije s čistimi prostori in proizvodne obrate. Ohišja so izdelana iz protibakterijske plastike ali nerjavnega jekla. Vsi deli, ki so v stiku z medijem, kot so sonotrode in pretočne celice, so izdelani iz titana ali nerjavnega jekla in jih je mogoče avtoklavirati. Na voljo so posebni reaktorji s pretočno celico, ki izpolnjujejo napredne zahteve CIP (clean-in-place) in SIP (sterilize-in-place). Pretvornik industrijske serije UIP ima zaščito IP64 in ga je mogoče namestiti v zahtevna okolja, medtem ko je generator nameščen ločeno. Ker sonikatorji Hielscher električno energijo pretvarjajo v mehansko nihanje z zelo visokim izkoristkom približno 80–90% od vtičnice do tekočine, je mogoče pretvornik vgraditi v zaprta ohišja brez zračnikov, prisilno hlajenje, na primer s stisnjenim zrakom ali vodo, pa ni potrebno. To pomeni tudi, da hladilni medij ne pride v stik s procesom. Samodejna dokumentacija procesa podpira sledljivost in ponovljivost v regulirani proizvodnji.
Ali lahko sonikacija tudi inaktivira virus za inaktivirano cepivo?
Da. Močni ultrazvok se uporablja za inaktivacijo patogenov, kot so bakterije in virusi. Z ustreznim odmerkom in intenzivnostjo sonikacije je mogoče celice in mikrobe obdelati v skladu s ciljem procesa, tako da ista platforma služi tako lizi za pridobivanje kot inaktivaciji. Kombinacija sonikacije in toplote, znana kot termosonikacija, ponuja hitrejšo stopnjo sterilizacije pri bistveno zmanjšani toplotni intenzivnosti in trajanju, kar je ugodno za ohranjanje toplotno občutljivih spojin, kot so beljakovine in antigeni. Ultrazvočna inaktivacija se običajno uporablja v kombinaciji z uveljavljeno inaktivacijsko kemijo, popolno kinetiko inaktivacije pa je treba validirati za vsak posamezen virus.
Ali je mogoče isti sistem uporabiti za korake formulacije po pridobivanju?
Da. Ista platforma opravlja dispergiranje antigenov v suspenzije, polimere ali liposomske kapsulacije, deaglomeracijo in enotno porazdelitev antigenov in adjuvansov na osnovi aluminija, kot je Alhydrogel™, formulacijo cepiv v liposome in trdne lipidne nanodelce z natančnim nadzorom velikosti nosilca ter korak razplinjevanja pred polnjenjem v viale ali brizge.
Literatura / viri
- Langston J. W.; Carroll M.; Whalen M. M.; Jaw, T. M.; Rojas L. V.; Hertel C. C.; Gote V., Balasundaram W.; Serbzhinzhskiy D.; Kapre S.; Olave, I. A. (2026): Novel non-aqueous rotavirus vaccine: Formulated for thermostability and easy administration. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 22(1), 2026.
- Mohsen, M.O., Rothen, D., Balke, I. et al. (2021): Neutralization of MERS coronavirus through a scalable nanoparticle vaccine. npj Vaccines 6, 107 (2021).
- Mohsen M.O., Balke I., Zinkhan S. et al. (2022): A scalable and highly immunogenic virus-like particle-based vaccine against SARS-CoV-2. Allergy Vol 77, Issue 1; 2022. 243–257.
- Brittney Mott; Sanjay Thamake; Jamboor Vishwanatha; Harlan P. Jones (2013): Intranasal delivery of nanoparticle-based vaccine increases protection against S. pneumoniae. J Nanopart Res (2013) 15:1646.
Hielscher Ultrasonics proizvaja visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje od laboratorijskih do industrijskih velikosti.