Fragmentacija alfa-sinukleina s sonikatorjem VialTweeter
Fibrile in trakovi α-sinukleina se v znanstvenih raziskavah fragmentirajo, da nastanejo manjši fragmenti fibril ali celo posamezne beljakovinske molekule, ki jih je mogoče lažje analizirati z različnimi eksperimentalnimi tehnikami. Sonikator VialTweeter je eden najpogosteje uporabljanih ultrazvočnih procesorjev za učinkovito in zanesljivo fragmentacijo alfa-sinukleina.
α-sinuklein v raziskavah
Fibrile alfa-sinukleina so beljakovinski agregati, ki so močno povezani z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot so Parkinsonova bolezen in nekatere oblike demence, vključno z demenco z Lewyjevimi telesci. Raziskave fibril alfa-sinukleina so namenjene razumevanju njihove vloge pri napredovanju bolezni in razvoju morebitnih terapevtskih ukrepov. Z razbijanjem fibril alfa-sinukleina na manjše fragmente lahko raziskovalci preučujejo njihove specifične strukturne značilnosti. Fragmentacija fibril alfa-sinukleina raziskovalcem na primer omogoča preučevanje njihovih interakcij z drugimi molekulami, kot so beljakovine, lipidi ali majhne molekule. S pripravo manjših fragmentov je mogoče učinkoviteje preučevati vezavna mesta in afiniteto do teh interakcijskih partnerjev. Manjše fibrile in trakovi α-Syn lahko kažejo tudi spremenjeno toksičnost in biokemične učinke. Zato je ključna zanesljiva in učinkovita tehnika fragmentacije, ki s hitro in preprosto obdelavo vzorcev zagotavlja ponovljive rezultate.
Ultrazvočna fragmentacija Alpha-Syn: Sonikator VialTweeter je uveljavljen ultrazvočni sistem za pripravo vzorcev, ki sočasno sonificira do 10 vial v povsem enakih pogojih. Nastavitve, ki jih je mogoče programirati, omogočajo preprosto in hitro ponovitev istih poskusov, kar zagotavlja zelo zanesljive in ponovljive rezultate pri fragmentaciji fibril alfa-sinukleina.
Sonikator VialTweeter za sočasno ultrazvočno fragmentacijo več vzorcev alfa-sinukleina.
Priprava vzorcev α-sinukleina s sonikatorjem
Eden od pristopov k preučevanju fibril alfa-sinukleina vključuje njihovo ekstrakcijo in fragmentacijo s tehnikami, kot je sonikacija. Sonikacija je postopek, pri katerem se z visokointenzivnimi nizkofrekvenčnimi ultrazvočnimi valovi razrušijo in razbijejo beljakovinski agregati, kar povzroči sproščanje manjših fibril ali posameznih beljakovinskih molekul. Sonikator VialTweeter je v raziskavah α-sinukleina pogosto uporabljena naprava za ta namen.
Številne raziskave opisujejo natančne protokole priprave vzorcev s sonikacijo fibril alfa-sinukleina, pri katerih se za učinkovito in zanesljivo fragmentacijo fibril α-sinukleina uporablja Hielscher VialTweeter. Z ultrazvočno fragmentacijo fibril lahko raziskovalci analizirajo nastale produkte ter preučujejo njihovo strukturo, toksičnost in interakcije z drugimi molekulami. Te raziskave omogočajo pomemben vpogled v mehanizme nevrodegeneracije in lahko pomagajo prepoznati nove terapevtske tarče. Dobro uveljavljeni protokoli sonikacije α-sinukleina s sonikatorjem VialTweeter omogočajo zanesljive in ponovljive rezultate.
Zgornje slike: nefragmentirane fibrile alfa-sinukleina
Spodnje slike: fibrile alfa-sinukleina, ultrazvočno fragmentirane s sonikatorjem VialTweeter
(raziskava in slike: ©Dieriks et al., 2022)
Ultrazvočna fragmentacija fibril α-sinukleina – protokoli
Ker številni raziskovalci sonikator VialTweeter uporabljajo kot prednostno tehniko fragmentacije za pripravo enakomernih fragmentov fibril α-sinukleina, so uveljavljeni protokoli zlahka dostopni. Spodaj je nekaj primerov protokolov fragmentacije.
Priprava jeder ClearTau: Fibrile ClearTau so razredčili na 10 μM v dH2O in jih v epruveti sonificirali s sonikatorjem UP200St z VialTweeter pri 70 % amplitudi 50 s s ciklom 1 s VKLOP in 1 s IZKLOP. Jedra so karakterizirali z elektronsko mikroskopijo.
Merjenje fluorescence ThS: Fibrile ClearTau so razredčili na 2,5 μM v dH2O in jih v epruveti sonificirali z UP200St z VialTweeter pri 70 % amplitudi 50 s s ciklom 1 s VKLOP in 1 s IZKLOP. Kot kontrolo so uporabili 2,5 μM monomera Tau 4R2N polne dolžine. Reakcijski zmesi s prostornino 100 μl so dodali 100 μl ThS (10 μM), s čimer so dosegli končne koncentracije beljakovin 1,25 μM. Fluorescenco ThS v eni časovni točki so izmerili s ploščami s 96 vdolbinicami s prozornim dnom, nameščenimi v čitalnik mikrotitrskih plošč FLUOstar Omega, pri vzbujanju pri 445 nm, emisijo pa so zabeležili pri 485 nm.
(prim. Limorenko et al., 2023)
Enakomerna dolžina α-sinukleina s sonikacijo: Heterogenost dolžine fibril in trakov α-syn so zmanjšali s sonikacijo 20 min na ledu v 2-ml epruvetah Eppendorf v napravi VialTweeter, nastavljeni na 75% amplitudo in 0,5 s impulze.
(prim. Bousset et al., 2013)
Izvedli so kontrolo kakovosti človeškega rekombinantnega monomernega a-Syn WT ali S129A in fibrilarnih polimorfov, ki jih tvorita, ter a-Syn 1–110. Nato so fibrilarne polimorfe fragmentirali s sonikacijo 20 min v 2-mL epruvetah Eppendorf v ultrazvočnem procesorju VialTweeter, da so nastali fibrilarni delci s povprečno velikostjo 42–52 nm, primerni za endocitozo.
(prim. Shrivastava et al., 2020)
Karakterizacija petih fibrilarnih polimorfov α-Syn. (A) Prikazani so posnetki negativno obarvanih fibrilarnih polimorfov α-Syn fibrils, ribbons, fibrils-91, fibrils-65 in fibrils-110, pridobljeni s transmisijsko elektronsko mikroskopijo pred fragmentacijo z VialTweeter (zgornja vrstica) in po njej (spodnja vrstica). (B) Prikazana je porazdelitev dolžin fragmentiranih fibrilarnih polimorfov. Navedeno je število (n) fibrilarnih skupkov, na podlagi katerih so bili izdelani histogrami.
(raziskava in slike: Shrivastava et al., 2020)
Fibrile α-Syn so fragmentirali s sonikacijo 20 min v 2 ml epruvetah Eppendorf v napravi VialTweeter, da so nastali fibrilarni delci s povprečno velikostjo 42–52 nm, določeno z analizo TEM.
(prim. Negrini et al., 2022)
Resuspendirane fibrils91 (v PBS) so pred dodajanjem celičnim kulturam fragmentirali s sonikacijo 20 min v 2 mL epruvetah Eppendorf s sonikatorjem Vial Tweeter, razdelili na alikvote, hitro zamrznili v tekočem dušiku in do uporabe shranili pri -80 ̊C.
(prim. Vajhøj et al., 2021)
Sonikator UIP400MTP za fragmentacijo fibril alfa-sinukleina v ploščah z več vdolbinicami.
VialTweeter in laboratorijski sonikatorji za fragmentacijo α-Syn
Hielscher Ultrasonics je po vsem svetu priznan kot vodilni proizvajalec najsodobnejših ultrazvočnih procesorjev. Naši ultrazvočni procesorji, ki jim zaupajo in jih uporabljajo v vodilnih raziskovalnih laboratorijih po svetu, ponujajo neprimerljivo kakovost in zmogljivost za vaše ključne poskuse.
S Hielscher VialTweeter in katerim koli drugim sonikatorjem Hielscher boste izkusili neprimerljivo udobje pri uporabi, saj so premišljeno zasnovani za ponovljive rezultate, preprosto uporabo in nemoteno delovanje. Funkcije samodejnega beleženja podatkov vam omogočajo, da se osredotočite na svoje raziskave, medtem ko naši ultrazvočni procesorji skrbno beležijo ključne podatke za ponovljivost in natančnost.
Z zaupanjem dosegajte dosledne in ponovljive rezultate!
Naši ultrazvočni procesorji so zasnovani in izdelani v Nemčiji. Nemška natančnost in najvišja kakovost inženirske zasnove zagotavljata vsakokratno zanesljivo in natančno pripravo vzorcev, kot je fragmentacija fibril alfa-sinukleina. Nič več skrbi zaradi nedoslednih rezultatov – naša ultrazvočna tehnologija zagotavlja, da vaše raziskave ostajajo v ospredju znanstvenega napredka.
A to še ni vse! Naša zavezanost odličnosti presega naše izdelke. Ponosni smo na izjemno podporo strankam, pri kateri zagotavljamo strokovno pomoč pri vseh vprašanjih ali pomislekih, ki jih morda imate. Naša predana ekipa vam pomaga na vsakem koraku vašega raziskovalnega dela in skrbi, da naše ultrazvočne procesorje kar najbolje izkoristite.
Izberite inovativnost, zanesljivost in izjemno uporabniško izkušnjo – izberite naše laboratorijske sonikatorje, kot je VialTweeter za fragmentacijo fibril alfa-sinukleina. Izkoristite že uveljavljene protokole in se pridružite vodilnim raziskovalcem, ki pri svojih ključnih raziskavah zaupajo naši tehnologiji. Dvignite svoje raziskave na višjo raven in z našimi najsodobnejšimi ultrazvočnimi procesorji raziščite nova področja raziskovanja demence in nevrodegenerativnih bolezni.
- visoka učinkovitost
- najsodobnejša tehnologija
- zanesljivost in robustnost
- ponovljivost
- prilagodljivo, natančno krmiljenje procesa
- za katero koli prostornino
- inteligentna programska oprema
- pametne funkcije (npr. možnost programiranja, beleženje podatkov, daljinsko upravljanje)
- preprosto in varno upravljanje
- malo vzdrževanja
- CIP (čiščenje na mestu)
Zasnova, proizvodnja in svetovanje – kakovost, izdelana v Nemčiji
Ultrazvočni procesorji Hielscher so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključitev naših ultrazvočnih procesorjev v industrijske obrate. Ultrazvočni procesorji Hielscher brez težav obvladujejo težke pogoje in zahtevna okolja.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim procesorjem z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Sonikatorji Hielscher so seveda skladni z zahtevami CE ter izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Spodnja tabela prikazuje približno zmogljivost obdelave naših laboratorijskih ultrazvočnih procesorjev:
| Priporočene naprave | Prostornina šarže | Pretok |
|---|---|---|
| UIP400MTP | plošče z več vdolbinicami / mikrotitrske plošče | n.a. |
| Ultrasonic CupHorn | CupHorn za viale ali čašo | n.a. |
| GDmini2 | ultrazvočni mikropretočni reaktor | n.a. |
| VialTweeter | 0,5 do 1,5mL | n.a. |
| UP100H | 1 do 500mL | 10 do 200mL/min |
| UP200Ht, UP400St | 10 do 2000mL | 20 do 400mL/min |
Stopite v stik z nami! / Vprašajte nas!
VialTweeter se pogosto uporablja za fragmentacijo fibrile alfa-sinukleina kot korak predanalitske priprave vzorcev
Literatura / viri
- Emil Dandanell Agerschou, Marie P. Schützmann, Nikolas Reppert, Michael M. Wördehoff, Hamed Shaykhalishahi, Alexander K. Buell, Wolfgang Hoyer (2021): β-Turn exchanges in the α-synuclein segment 44-TKEG-47 reveal high sequence fidelity requirements of amyloid fibril elongation. Biophysical Chemistry, Volume 269, 2021.
- Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G. et al. (2013): Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature Communications 4, 2575 (2013).
- Vajhøj, Charlott; Schmid, Benjamin; Alik, Ania; Melki, Ronald; Fog, Karina; Holst, Bjørn; Stummann, Tina (2021): Establishment of a human induced pluripotent stem cell neuronal model for identification of modulators of A53T α-synuclein levels and aggregation. PLOS ONE 16, 2021.
- Dieriks B.V.; Highet B.; Alik A.; Bellande T.; Stevenson T.J.; Low V.; Park T.I.; Correia J.; Schweder P.; Faull R.L.M.; Melki R.; Curtis M.A.; Dragunow M. (2022): Human pericytes degrade diverse α-synuclein aggregates. PLoS One, Nov 18;17(11), 2022.
- Amulya Nidhi Shrivastava, Luc Bousset, Marianne Renner, Virginie Redeker, Jimmy Savistchenko, Antoine Triller, Ronald Melki (2020): Differential Membrane Binding and Seeding of Distinct α-Synuclein Fibrillar Polymorphs. Biophysical Journal, Volume 118, Issue 6, 2020. 1301-1320.
- Negrini M, Tomasello G, Davidsson M, Fenyi A, Adant C, Hauser S, Espa E, Gubinelli F, Manfredsson FP, Melki R, Heuer A. (2022): Sequential or Simultaneous Injection of Preformed Fibrils and AAV Overexpression of Alpha-Synuclein Are Equipotent in Producing Relevant Pathology and Behavioral Deficits. Journal of Parkinsons Disease 12(4), 2022. 1133-1153.
- Limorenko G, Tatli M, Kolla R, Nazarov S, Weil MT, Schöndorf DC, Geist D, Reinhardt P, Ehrnhoefer DE, Stahlberg H, Gasparini L, Lashuel HA (2023): Fully co-factor-free ClearTau platform produces seeding-competent Tau fibrils for reconstructing pathological Tau aggregates. Nature Communications 4;14(1), July 2023.
Pogosta vprašanja
Ali je alfa-sinuklein amiloid?
Da, alfa-sinuklein lahko tvori amiloidu podobne fibrile. Je ključna sestavina Lewyjevih telesc, patološkega označevalca Parkinsonove bolezni in drugih sinukleinopatij. Njegova agregacija poteka po procesu polimerizacije, odvisnem od nukleacije, podobno kot pri klasičnih amiloidih.
Kakšna je razlika med amiloidom beta in alfa-sinukleinom?
Amiloid beta (Aβ) in alfa-sinuklein (α-syn) sta različni beljakovini, ki pri nevrodegenerativnih boleznih tvorita patološke agregate. Aβ, ki nastane iz amiloidnega prekurzorskega proteina (APP), je predvsem povezan z Alzheimerjevo boleznijo in tvori zunajcelične plake. Nasprotno je α-syn presinaptična nevronska beljakovina, ki se pri Parkinsonovi bolezni in sorodnih boleznih agregira znotraj celic. Čeprav oba tvorita amiloidne strukture, bogate z β-ploskvami, se razlikujeta po svojih zaporedjih, poteh agregacije in patologiji, značilni za posamezno bolezen.
Kakšna vrsta beljakovine je amiloid?
Amiloid je nepravilno zvita fibrilarna beljakovina, ki privzame strukturo s prečno razporejenimi β-ploskvami in se agregira v netopne fibrile. Te beljakovine običajno nastanejo iz sicer topnih prekurzorjev, ki doživijo konformacijske spremembe, kar vodi v samosestavljanje in odlaganje. Amiloidi so povezani z različnimi nevrodegenerativnimi in sistemskimi boleznimi, pri katerih njihova agregacija prispeva k celični toksičnosti in poškodbam tkiv. Spoznajte, kako sonikator za plošče s 96 vdolbinicami UIP400MTP pomaga pri hitrem tvorjenju standardiziranih amiloidnih fibril za raziskovalne namene!
Katere bolezni povzročajo amiloidi?
Amiloidi so vpleteni v številne bolezni, ki jih skupno imenujemo amiloidoze. Te vključujejo:
- Nevrodegenerativne bolezni: Alzheimerjevo bolezen (Aβ), Parkinsonovo bolezen (α-syn), Huntingtonovo bolezen (mutirani huntingtin) in prionske bolezni (PrPSc). (Preberite več o PMCA s pomočjo sonikacije za zaznavanje prionov z visoko zmogljivostjo obdelave vzorcev!)
- Sistemske amiloidoze: Amiloidozo lahkih verig (AL), transtiretinsko amiloidozo (ATTR) in sekundarno amiloidozo (AA).
- Lokalizirane amiloidoze: Amiloidni polipeptid otočkov (IAPP) pri sladkorni bolezni tipa 2.
Za vsako bolezen, povezano z amiloidi, so značilni nepravilno zvijanje, agregacija in odlaganje beljakovin, kar vodi v motnje delovanja celic in toksičnost.
Hielscher Ultrasonics izdeluje visokozmogljive ultrazvočne homogenizatorje od laboratorijske do industrijske velikosti.