Tvorba amiloidnih fibril s sonikatorjem za mikrotitrske plošče UIP400MTP

Amiloidne fibrile, podobno kot kristali, nastajajo s procesom nukleacije in nadaljnje rasti. Vendar zaradi visoke pregrade proste energije pri nukleaciji spontana tvorba amiloidnih fibril nastopi šele po podaljšani fazi zamika. Ultrazvočna sonikacija se je uveljavila kot učinkovito orodje za sprožanje nukleacije amiloida, s čimer znatno pospeši tvorbo fibril. V kombinaciji s čitalnikom mikrotitrskih plošč, ki meri fluorescenco tioflavina T (ThT), ultrazvočna sonikacija omogoča visokozmogljivo odkrivanje amiloidnih fibril v več vzorcih hkrati.

Ultrazvočno sprožena tvorba amiloidnih fibril s sonikatorjem za mikrotitrske plošče UIP400MTP

S sonikatorjem za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP je mogoče za raziskovalne namene hitro sintetizirati velike količine amiloidnih fibril enake kakovosti. Ta učinkovit pristop omogoča preučevanje amiloidogenosti beljakovin. Tehnika omogoča hitro in ponovljivo amiloidno fibrilizacijo, kot je bilo dokazano z β2-mikroglobulinom (β2-m), amiloidogeno beljakovino, povezano z amiloidozo zaradi dialize.

Preprost eksperimentalni pristop: ultrazvočno sprožena amiloidna fibrilizacija

Za sprožitev tvorbe fibril so mikrotitrsko ploščo s 96 vdolbinicami postavili v središče sonikatorja za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP, ki zagotavlja enakomerno izpostavljenost ultrazvoku v vseh vdolbinicah. Eksperimentalni pogoji so bili naslednji:

1. Vsaka vdolbinica je vsebovala 0,2 ml raztopine β2-mikroglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) z dodatkom 5 μM ThT.
2. Ploščo so obdelali s cikli ultrazvočne sonikacije, na primer z 1-minutno ultrazvočno sonikacijo, ki ji je sledilo 9 minut premora.
3. Po sonikaciji so fluorescenco ThT izmerili s čitalnikom mikrotitrskih plošč.

(prim. So et al., 2011)

Primerjava z običajnim mešanjem

V primerjavi s tradicionalnimi metodami mešanja je ultrazvočna sonikacija močno skrajšala fazo zamika pri tvorbi fibril. Pri običajnih pogojih stresanja mikrotitrskih plošč je le 1 od 10 vdolbinic po 20 urah pokazala povečano fluorescenco ThT. Nasprotno pa so pri ciklični ultrazvočni sonikaciji (15 minut sonikacije, ki jim je sledilo 5 minut mirovanja) znatno povečanje fluorescence ThT zaznali takoj po prvi sonikacijski obdelavi.

Hitro pospeševanje kinetike fibrilizacije

Rezultati raziskave So et al. (2011) so pokazali, da je mogoče spontano tvorbo fibril β2-mikroglobulina pri pH 2,5 z ultrazvočno sonikacijo pospešiti z več ur na zgolj 10–15 minut.
Posnetki, pridobljeni z mikroskopijo na atomsko silo (AFM), so potrdili, da se fibrile, nastale z 10-minutno ultrazvočno sonikacijo vsakih 15 minut, morfološko niso razlikovale od tistih, nastalih z 1-minutno ultrazvočno sonikacijo vsakih 10 minut. To poudarja ponovljivost in robustnost ultrazvočno sprožene amiloidne fibrilizacije.

Posnetki AFM amiloidnih fibril, nastalih z 1-minutno ultrazvočno sonikacijo vsakih 10 min (i), z 10-minutno sonikacijo vsakih 15 min (ii) in z reakcijo z dodanimi zametki brez ultrazvočne sonikacije (iii). Bela merilna oznaka predstavlja 1 μm.
Raziskava in posnetki: ©So et al., 2011

Fibrilizacija pri nevtralnem pH

Tudi pri nevtralnem pH je bila tvorba fibril dosežena po času zamika 1,5 ure, kar dokazuje, da ultrazvočna sonikacija znatno zniža energijsko pregrado za nukleacijo in rast. To dodatno podpira hipotezo, da je amiloidna fibrilizacija predvsem fizikalna reakcija, ki jo v veliki meri omejuje energijska pregrada nukleacije, ultrazvočna sonikacija pa jo učinkovito znižuje.

Vpliv na raziskave bolezni, povezanih z amiloidom

Preprosta in zanesljiva tvorba amiloidnih fibril s sonikatorjem za mikrotitrske plošče UIP400MTP je zelo pomembna za raziskave Alzheimerjeve bolezni (AD) in drugih motenj, povezanih z amiloidom, kot so Parkinsonova bolezen, sladkorna bolezen tipa II in sistemske amiloidoze. Pri AD je agregacija amiloida-β (Aβ) ključna patološka značilnost, vendar preučevanje kinetike njegove fibrilizacije ostaja zahtevno zaradi dolgih faz zamika in variabilnosti običajnih metod. Tvorba fibril, sprožena z ultrazvočno sonikacijo, pospeši nukleacijo ter zagotavlja visoko ponovljivost in manjšo variabilnost, kar je ključno za presejanje potencialnih zaviralcev in razumevanje amiloidogenih mehanizmov. Poleg tega visoka zmogljivost obdelave vzorcev z UIP400MTP omogoča obsežne raziskave nepravilnega zvijanja in agregacije beljakovin ter olajšuje odkrivanje terapevtskih učinkovin, ki lahko uravnavajo tvorbo fibril in potencialno ublažijo napredovanje nevrodegeneracije.

Ta raziskava potrjuje ultrazvočno sonikacijo s sonikatorjem za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP kot zelo učinkovito metodo za pospeševanje tvorbe amiloidnih fibril. Ključne prednosti tega pristopa vključujejo:

• Močno skrajšanje časa zamika pri fibrilizaciji.
• Enakomerno izpostavljenost ultrazvoku v vseh vdolbinicah, kar omogoča ponovljivo tvorbo fibril.
• Zmožnost visokozmogljivega presejanja, zaradi katere je pristop primeren za iskanje amiloidogenosti beljakovin na ravni celotnega genoma.

Ta metoda z združevanjem ultrazvočne sonikacije in zaznavanja fluorescence ThT zagotavlja hitro, razširljivo in zanesljivo platformo za preučevanje amiloidne fibrilizacije. Zaradi svoje učinkovitosti in potenciala za visoko zmogljivost obdelave vzorcev lahko ta pristop olajša preprosto sintezo amiloidnih fibril za biofizikalne in farmacevtske raziskave ter ponuja obetavno orodje za raziskave, povezane z amiloidom, in presejanje zdravil.