Nastajanje amiloidnih vlaken z uporabo UIP400MTP Microplate Sonicator

Amiloidne fibrile, podobno kot kristali, nastanejo s procesom nukleacije in kasnejše rasti. Vendar pa se zaradi visoke prostoenergijske pregrade nukleacije spontana tvorba amiloidnih vlaken pojavi šele po daljši fazi zaostanka. Ultrasonication se je pojavil kot močno orodje za induciranje nukleacije amiloida, s čimer se znatno pospeši tvorba fibril. V kombinaciji z čitalnikom mikroplošč, ki uporablja fluorescenco tioflavin T (ThT), ultrazvok omogoča visoko zmogljivo odkrivanje amiloidnih vlaken v več vzorcih hkrati.

Ultrazvočno inducirana tvorba amiloidnih vlaken z zvočnim aparatom UIP400MTP mikroplošče

Z UIP400MTP sonikatorjem z več vdolbicami se lahko amiloidna vlakna enake kakovosti v velikih količinah hitro sintetizirajo za raziskovalne namene. Ta učinkovit pristop omogoča preučevanje amiloidogenečnosti beljakovin. Ta tehnika omogoča hitro in ponovljivo amiloidno fibrilacijo, kot je dokazano z β2-mikroglobulinom (β2-m), amiloidogenim proteinom, povezanim z amiloidozo, povezano z dializo.

Preprost eksperimentalni pristop: ultrazvočno inducirana amiloidna fibrilacija

Da bi spodbudili nastajanje fibril, je bila v središču UIP400MTP sonicatorja z več vdolbinicami postavljena mikroplošča z 96 vdolbinicami, ki zagotavlja enakomerno ultrazvočno izpostavljenost v vseh vdolbinicah. Eksperimentalni pogoji so bili naslednji:

1. Vsaka jaminica je vsebovala 0,2 ml raztopine β2-mikroglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5), dopolnjene s 5 μM ThT.
2. Plošča je bila podvržena ultrazvočnim ciklom, kot je 1-minutna ultrazvočna obdelava, ki ji je sledilo 9 minut premora.
3. Po sonikaciji je bila fluorescenca ThT izmerjena z bralnikom mikroplošč.

(prim. So et al., 2011)

Primerjava s konvencionalnim mešanjem

V primerjavi s tradicionalnimi metodami mešanja je ultrazvočna razlaga drastično zmanjšala fazo zaostajanja pri nastajanju fibril. V običajnih pogojih stresanja mikroplošč je le 1 od 10 vdolbin po 20 urah pokazala povečano fluorescenco ThT. V nasprotju s tem je bilo z uporabo ciklične ultrazvočne ultrazvočne razbijanje (15-minutno ultrazvočno razbijanje, ki mu sledi 5-minutno mirovanje) takoj po prvem ultrazvočnem zdravljenju zaznano znatno povečanje fluorescence ThT.

Hitro pospeševanje kinetike fibrilacije

(2011) so pokazali, da se lahko spontana tvorba fibril β2-mikroglobulina pri pH 2,5 pospeši z nekaj ur na samo 10–15 minut z ultrazvokom.
Slike mikroskopije atomskih sil (AFM) so potrdile, da se fibrile, ki nastanejo z 10-minutno ultrasonicacijo vsakih 15 minut, morfološko ne razlikujejo od tistih, ki so nastale z uporabo 1-minutne ultrazvočne razlage vsakih 10 minut. To poudarja ponovljivost in robustnost ultrazvočno inducirane amiloidne fibrilacije.

AFM slike amiloidnih vlakenj, ki nastanejo z 1-minutno ultrazvočno razbijanjem vsakih 10 minut (i), z 10-minutno ultrazvočno razbijanjem vsakih 15 minut (ii) in z reakcijo sejanja brez ultrazvočne razprave (iii). Bela lestvica predstavlja 1 μm.
Študija in slike: ©So et al., 2011

Fibrilacija pri nevtralnih pH pogojih

Tudi v pogojih nevtralnega pH je bila tvorba fibril dosežena po 1,5 uri zamika, kar dokazuje, da ultrazvočna razširitev znatno zmanjša energetsko oviro za nukleacijo in rast. To nadalje podpira hipotezo, da je amiloidna fibrilacija predvsem fizična reakcija, ki jo v veliki meri omejuje nukleacijska energijska pregrada, ki jo ultrasonication učinkovito zmanjša.

Vpliv na raziskave bolezni, povezanih z amiloidom,

Enostavno in zanesljivo nastajanje amiloidnih vlaken z uporabo UIP400MTP ultraploščnega sonikatorja ima pomembne posledice za raziskave Alzheimerjeve bolezni (AD) in druge motnje, povezane z amiloidom, kot so Parkinsonova bolezen, sladkorna bolezen tipa II in sistemske amiloidoze. Pri AD je agregacija amiloid-β (Aβ) ključna patološka značilnost, vendar preučevanje njegove kinetike fibrilacije ostaja zahtevno zaradi dolgih faz zaostankov in variabilnosti v konvencionalnih metodah. Ultrazvočna tvorba fibril pospešuje nukleacijo, zagotavlja visoko obnovljivost in zmanjšano variabilnost, kar je ključnega pomena za presejanje potencialnih zaviralcev in razumevanje amiloidogenih mehanizmov. Poleg tega visoko zmogljiva zmogljivost UIP400MTP omogoča obsežne preiskave napačnega zlaganja in agregacije beljakovin, kar olajša odkrivanje terapevtskih sredstev, ki lahko modulirajo tvorbo fibril in potencialno ublažijo nevrodegenerativno napredovanje.

Ta študija vzpostavlja ultrazvok z uporabo UIP400MTP sonikatorja z več vdolbicami kot zelo učinkovito metodo za pospeševanje nastajanja amiloidnih vlakenj. Ključne prednosti tega pristopa so:

• Dramatično zmanjšanje časa zamika za fibrilacijo.
• Enakomerna ultrazvočna izpostavljenost v vseh vdolbinicah, kar omogoča ponovljivo tvorbo vlakenj.
• Visoko zmogljiva presejalna zmogljivost, zaradi česar je primerna za iskanje amiloidogenečnosti beljakovin v celotnem genomu.

Z integracijo ultrasonication s fluorescenčno detekcijo ThT ta metoda zagotavlja hitro, razširljivo in zanesljivo platformo za preučevanje amiloidne fibrilacije. Glede na svojo učinkovitost in visoko zmogljiv potencial lahko ta pristop olajša enostavno sintezo amiloidnih vlaken za biofizikalne in farmacevtske raziskave, kar ponuja obetavno orodje za študije, povezane z amiloidi, in presejalne preglede zdravil.