PMCA za visoko zmogljivo zaznavanje prionov z uporabo UIP400MTP Sonicatorja

Sonikator z več vdolbicami UIP400MTP ponuja zmogljivo rešitev za visoko zmogljivo pripravo vzorcev pri ciklični amplifikaciji napačnega zlaganja beljakovin (PMCA). Z zagotavljanjem enakomerne porazdelitve energije v več vrtinah in ohranjanjem natančnih parametrov ultrazvočne razbijanje ta sistem omogoča hkratno obdelavo številnih vzorcev z izjemno ponovljivostjo. Te zmogljivosti so ključnega pomena za optimizacijo PMCA za odkrivanje prionov pri nizkih koncentracijah v zahtevnih bioloških vzorcih, kot je slina, kjer lahko zaviralci testov zakrijejo rezultate.

Prionske bolezni, kot so kronična bolezen propadanja (CWD) pri jelenih in Creutzfeldt-Jakobova bolezen (CJD) pri ljudeh, so nevrodegenerativne motnje, ki jih povzročajo napačno zloženi prionski proteini (PrP^Sc). Te bolezni pogosto vključujejo nizke ravni nalezljivih prionov v telesnih tekočinah, kot so slina, kri in urin, kar otežuje diagnozo in raziskave. Horizontalni prenos CWD skozi prione, ki se izločajo v okoljskih matrikah, ima še posebej pomembne posledice za upravljanje prostoživečih živali in ekološko zdravje. Podobno je pri boleznih, kot je Creutzfeldt-Jakobova bolezen, zanesljivo pomnoževanje napačno zloženih prionskih beljakovin iz človeških vzorcev ključnega pomena za napredovanje diagnostike in razumevanje napredovanja bolezni.

Uporaba spremenjenega protokola PMCA omogoča izogibanje običajnim zaviralcem testa (npr. Mucini v slini) in doseganje visoke občutljivosti pri odkrivanju prionov, ki bi bili sicer nezaznavni ali dvoumni z uporabo tehnik, kot je pretvorba, ki jo povzroča tresenje v realnem času (RT-QuIC). Ti napredki izboljšujejo odkrivanje prionov za različne bolezni, zaradi česar je PMCA nepogrešljivo orodje za raziskave in diagnostiko prionov. Sonikator z več vdolbicami UIP400MTP omogoča visoko zmogljivo PMCA ultrazvočno razbijanje številnih vzorcev v mikroploščah (npr. 6-, 24- ali 96-jamicah plošče) ali vialah v stojalu za cevi.

Protokol za ciklično umnoževanje napačnega zlaganja beljakovin z visoko zmogljivostjo (PMCA)

Naslednji protokol omogoča učinkovito obdelavo velikega števila vzorcev pod popolnoma enakimi pogoji za robustne rezultate raziskav.

Priprava vzorca

Izhodni material:
Pripravite vzorce z:

• Resuspendiranje peletov za ekstrakcijo sarkozila v substratu PMCA.
• Neposredno obremenitev možganskih homogenatov ali vzorcev krvi s prionskimi semeni.

Substrat:

• Uporabite 10% (mas / vol) možganski homogenat, pripravljen iz transgenih miši, ki prekomerno izražajo PrP^C (npr. Tg miši).
• Homogenizirajte možgansko tkivo v:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Podlaga shranjujte pri -80 °C do uporabe.

Nastavitev vzorca v mikroplošči ali epruvetah:
Cevi:

• Dodamo 90 μl substrata možganskega homogenata in seme z 10 μl vzorca (npr. krvi, možganskega homogenata ali sarkozilne pelete).
• V vsako 0,2 ml epruveto položite 3 teflonske kroglice (premera 1,59 mm ali 2,38 mm).
• Cevi namestite v stojalo, ki je združljivo z UIP400MTP sonicatorjem.

Mikroplošča s 6 jamicami:

• Dodamo 5 ml substrata za homogenat možganov in seme s 500 μl vzorca na jamico.
• V vsako vdolbinico dodajte 3 teflonske kroglice.

Postopek PMCA

Umestitev:
Postavite stojalo za cevi ali mikroploščo s 6 jamicami v zvočni UIP400MTP v skladu z navodili proizvajalca.

Kolesarski program:
Izvedite 144 ciklov PMCA, kot sledi:

• Inkubacija: 29 minut in 30 sekund pri 37 °C.
• Sonication: 30 sekund pri 60% amplitudi.
• Spremljajte temperaturo: Uporabite vtični temperaturni senzor za spremljanje temperature vzorca in programirajte UIP400MTP na najvišjo temperaturo 48–50 °C.

Naslednji krogi:
Po končanem prvem krogu 144 ciklov prenesemo alikvot amplifikovanega materiala:

• Razredčite 10-krat v svež transgeni substrat homogenata mišjih možganov.
• Izvedite 96 ciklov PMCA za naslednje kroge, pri čemer ohranite enake parametre ultrazvočne obdelave.
• Nadaljujte za želeno število krogov (običajno do 5).

Odkrivanje PrP^Sc

1. Prebava proteinaze K:
   – Vzorce obdelajte z proteinazo K (50 μg/ml) pri 37 °C 1 uro.
   – Razgradnja se konča z dodajanjem pufra za vzorce SDS in vrenjem 10 minut.
2. Analiza Western Blot:
   – Analizirajte prebavljene vzorce z uporabo:
   – 6H4 ali PRC1 protitelesa proti PrP.
   – Izvedite SDS-PAGE in prenesite na PVDF membrane za detekcijo.

 

 

Obdelava več vzorcev za robustnejše rezultate

Sonikator UIP400MTP z več vdolbicami znatno poveča učinkovitost in razširljivost cikličnega poudarka napačnega zlaganja beljakovin (PMCA), kar obravnava tradicionalno zamudno naravo postopka. Z omogočanjem hkratne obdelave do 96 vzorcev v 96-jamični plošči sistem racionalizira potek dela PMCA, hkrati pa ohranja natančne in enotne pogoje ultrazvočne razbijanje v vseh vdolbinicah. Ta zmogljivost z visoko zmogljivostjo zmanjšuje ročno rokovanje, zmanjšuje delovno intenzivne korake in zagotavlja ponovljivost, zaradi česar je nepogrešljivo orodje za raziskave prionov. Ne glede na to, ali raziskuje kronično bolezen ali Creutzfeldt-Jakobovo bolezen, UIP400MTP omogoča obsežne študije z večjo učinkovitostjo, kar raziskovalcem omogoča, da izpolnijo zahteve sodobnih diagnostičnih in znanstvenih aplikacij.

---

---

Literatura / Reference

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.