Ultrazvuk na zlepšenie narúšania buniek rias a extrakcie

Riasy, makroriasy aj mikroriasy, obsahujú mnohé cenné zlúčeniny, ktoré sa používajú ako výživné potraviny, prídavné látky do potravín, palivo alebo surovina na výrobu palív. Na uvoľnenie cieľových látok z bunky riasy je potrebná výkonná a účinná technika narúšania buniek. Ultrazvukové extraktory sú vysoko účinné a spoľahlivé pri extrakcii bioaktívnych zlúčenín z rastlín, rias a húb. Ultrazvukové extraktory Hielscher, dostupné v laboratórnom, stolovom aj priemyselnom vyhotovení, sa osvedčili pri výrobe extraktov z buniek v potravinárskej a farmaceutickej výrobe a pri výrobe biopalív.

Riasy ako cenný zdroj pre výživu a výrobu palív

Bunky rias sú všestranným zdrojom bioaktívnych a energeticky bohatých zlúčenín, ako sú bielkoviny, sacharidy, lipidy a ďalšie bioaktívne látky, ako aj alkány. Vďaka tomu sú riasy zdrojom potravín a výživových zložiek, ako aj palív.
Mikroriasy sú ceneným zdrojom lipidov, ktoré sa používajú vo výžive a ako surovina na výrobu biopalív (napr. bionafty). Kmene morského fytoplanktónu rodu Dicrateria, napríklad Dicrateria rotunda, sú známe ako riasy produkujúce benzín, ktoré dokážu syntetizovať rad nasýtených uhľovodíkov (n-alkánov) od C₁₀H₂₂ do C₃₈H₇₈, ktoré sa zaraďujú medzi benzín (C10–C15), motorovú naftu (C16–C20) a vykurovacie oleje (C21–C38).
Vďaka svojej výživovej hodnote sa riasy používajú ako „funkčné potraviny“ alebo „nutraceutiká“. Medzi významné mikroživiny extrahované z rias patria karotenoidy astaxantín, fukoxantín a zeaxantín, fukoidán, laminari a ďalšie glukány, ktoré sa spolu s mnohými ďalšími bioaktívnymi látkami používajú ako výživové doplnky a liečivá. Karagénan, alginát a ďalšie hydrokoloidy sa používajú ako prídavné látky do potravín. Lipidy z rias sa používajú ako vegánsky zdroj omega-3 mastných kyselín a tiež ako palivo alebo surovina na výrobu bionafty.

Narúšanie buniek rias a extrakcia pomocou výkonového ultrazvuku

Ultrazvukové extraktory, alebo jednoducho ultrazvukové procesory, sa používajú na extrakciu cenných zlúčenín z malých vzoriek v laboratóriu, ako aj na komerčnú veľkovýrobu.
Bunky rias sú chránené zložitými matricami bunkových stien, ktoré pozostávajú z lipidov, celulózy, bielkovín, glykoproteínov a polysacharidov. Základ väčšiny bunkových stien rias tvorí mikrofibrilárna sieť v gélovitej bielkovinovej matrici; niektoré mikroriasy však majú pevnú anorganickú stenu tvorenú schránkami z opálového oxidu kremičitého alebo uhličitanom vápenatým. Na získanie bioaktívnych zlúčenín z biomasy rias je potrebná účinná technika narúšania buniek. Okrem technologických faktorov extrakcie (t. j. metódy extrakcie a zariadenia) účinnosť narúšania buniek rias a extrakcie výrazne ovplyvňujú aj rôzne faktory závisiace od rias, napríklad zloženie bunkovej steny, umiestnenie požadovanej biomolekuly v bunkách mikrorias a rastové štádium mikrorias počas zberu.

Ako funguje ultrazvukové narúšanie buniek rias a extrakcia?

Keď sa ultrazvukové vlny s vysokou intenzitou prenášajú cez ultrazvukovú sondu (známu aj ako ultrazvukový roh alebo sonotróda) do kvapaliny alebo suspenzie, zvukové vlny sa šíria kvapalinou a vytvárajú pritom striedajúce sa cykly vysokého a nízkeho tlaku. Počas týchto cyklov vysokého a nízkeho tlaku vznikajú nepatrné vákuové bubliny alebo dutiny. Kavitačné bubliny vznikajú, keď lokálny tlak počas cyklov nízkeho tlaku klesne dostatočne hlboko pod tlak nasýtených pár, ktorého hodnota je daná pevnosťou kvapaliny v ťahu pri určitej teplote. Tieto bubliny rastú počas niekoľkých cyklov. Keď tieto vákuové bubliny dosiahnu veľkosť, pri ktorej už nedokážu absorbovať viac energie, počas cyklu vysokého tlaku prudko implodujú. Implózia kavitačných bublín je prudký proces s vysokou hustotou energie, ktorý v kvapaline vytvára intenzívne rázové vlny, turbulencie a mikroprúdy. Okrem toho lokálne vznikajú veľmi vysoké tlaky a veľmi vysoké teploty. Tieto extrémne podmienky dokážu ľahko narušiť bunkové steny a membrány a účinne, efektívne a rýchlo uvoľniť vnútrobunkové zlúčeniny. Pomocou výkonového ultrazvuku tak možno účinne extrahovať vnútrobunkové zlúčeniny, ako sú proteíny, polysacharidy, lipidy, vitamíny, minerály a antioxidanty.

Ultrazvuková kavitácia na narúšanie buniek a extrakciu

Pri vystavení intenzívnej ultrazvukovej energii sa stena alebo membrána akéhokoľvek typu bunky (vrátane rastlinných buniek, buniek cicavcov, rias, húb, baktérií atď.) naruší a mechanické sily ultrazvukovej kavitácie s vysokou hustotou energie roztrhajú bunku na menšie fragmenty. Po porušení bunkovej steny sa bunkové metabolity, ako sú proteíny, lipidy, nukleové kyseliny a chlorofyl, uvoľnia z matrice bunkovej steny aj z vnútra bunky a prechádzajú do okolitého kultivačného média alebo rozpúšťadla.
Vyššie opísaný mechanizmus ultrazvukovej / akustickej kavitácie výrazne narúša celé bunky rias alebo plynové a kvapalné vakuoly v bunkách. Ultrazvuková kavitácia, vibrácie, turbulencie a mikroprúdenie podporujú prenos hmoty medzi vnútrom bunky a okolitým rozpúšťadlom, takže sa biomolekuly (t. j. metabolity) účinne a rýchlo uvoľňujú. Sonikácia je totiž čisto mechanické spracovanie, ktoré nevyžaduje agresívne, toxické a/alebo drahé chemikálie.
Vysokointenzívny nízkofrekvenčný ultrazvuk vytvára extrémne podmienky s vysokou hustotou energie, ktoré sa vyznačujú vysokými tlakmi, teplotami a veľkými šmykovými silami. Tieto fyzikálne sily podporujú narušenie bunkových štruktúr s cieľom uvoľniť vnútrobunkové zlúčeniny do média. Preto sa nízkofrekvenčný ultrazvuk vo veľkej miere používa na extrakciu bioaktívnych látok a palív z rias. V porovnaní s konvenčnými extrakčnými metódami, ako sú extrakcia rozpúšťadlom, guľôčkové mletie alebo vysokotlaková homogenizácia, ultrazvuková extrakcia vyniká uvoľnením väčšiny bioaktívnych zlúčenín (ako sú lipidy, proteíny, polysacharidy a mikroživiny) z bunky, ktorá prešla sonoporáciou a narušením. Pri použití správnych procesných podmienok poskytuje ultrazvuková extrakcia vyššie extrakčné výťažky za veľmi krátky čas spracovania. Napríklad vysokovýkonné ultrazvukové extraktory dosahujú vynikajúce výsledky pri extrakcii z rias, ak sa používajú s vhodným rozpúšťadlom. V kyslom alebo zásaditom prostredí sa bunková stena rias stáva pórovitou a zvrásnenou, čo vedie k vyšším výťažkom pri nízkej teplote (pod 60°C) a krátkom čase sonikácie (menej ako 3 hodiny). Krátke trvanie extrakcie pri miernych teplotách zabraňuje degradácii fukoidánu, takže sa získava vysoko bioaktívny polysacharid.
Ultrazvukové spracovanie je tiež metódou na premenu fukoidánu s vysokou molekulovou hmotnosťou na fukoidán s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorý je vďaka svojej štruktúre s odstránenými bočnými reťazcami výrazne bioaktívnejší. Vďaka vysokej bioaktivite a biologickej prístupnosti je fukoidán s nízkou molekulovou hmotnosťou zaujímavou zlúčeninou pre liečivá a systémy na podávanie liečiv.

Prípadové štúdie: Ultrazvuková extrakcia zlúčenín z rias

Účinnosť ultrazvukovej extrakcie a optimalizácia jej parametrov boli predmetom rozsiahleho výskumu. Nižšie nájdete príklady výsledkov extrakcie z rôznych druhov rias pomocou ultrazvuku.

Extrakcia proteínov zo spiruliny pomocou manotermosonikácie

Výskumná skupina prof. Chemata (Avignonská univerzita) skúmala účinky manotermosonikácie (MTS) na extrakciu bielkovín (napríklad fykocyanínu) zo suchých siníc Arthrospira platensis (známych aj ako spirulina). Manotermosonikácia (MTS) je aplikácia ultrazvuku v kombinácii so zvýšeným tlakom a teplotou s cieľom zintenzívniť proces ultrazvukovej extrakcie.
„Podľa experimentálnych výsledkov MTS podporila prenos hmoty (vysoká efektívna difuzivita, De) a umožnila získať o 229% viac bielkovín (28,42 ± 1,15 g/100 g DW) než konvenčný proces bez ultrazvuku (8,63 ± 1,15 g/100 g DW). Pri obsahu 28,42 g bielkovín v extrakte na 100 g suchej biomasy spiruliny sa kontinuálnym procesom MTS dosiahla 50% výťažnosť bielkovín za 6 minút účinného spracovania. Mikroskopické pozorovania ukázali, že akustická kavitácia pôsobila na vlákna spiruliny rôznymi mechanizmami, ako sú fragmentácia, sonoporácia a narušenie textúry. Tieto rôzne javy uľahčujú extrakciu, uvoľňovanie a solubilizáciu bioaktívnych zlúčenín spiruliny.“ [Vernès et al., 2019]

Snímky celých vlákien spiruliny vystavených spracovaniu MTS v priebehu času, získané optickou mikroskopiou. Mierka (obrázok A) = 50 μm pre všetky obrázky.
obrázok a štúdia: ©Vernès et al. 2019

Ultrazvuková extrakcia fukoidánu a glukánov z Laminaria digitata

Výskumná skupina Dr. Tiwariho z TEAGASC skúmala extrakciu polysacharidov, t. j. fukoidánu, laminarínu a celkových glukánov, z makroriasy Laminaria digitata pomocou ultrazvukového prístroja UIP500hdT. Skúmané parametre extrakcie podporovanej ultrazvukom (UAE) preukázali významný vplyv na hodnoty fukózy, FRAP a DPPH. Pri optimalizovaných podmienkach teploty (76◦C), času (10 min) a amplitúdy ultrazvuku (100%) s použitím 0,1 M HCl ako rozpúšťadla sa pre fukózu, celkové glukány, FRAP a DPPH dosiahli hodnoty 1060,75 mg/100 g ds, 968,57 mg/100 g ds, 8,70 μM trolox/mg fde a 11,02% v uvedenom poradí. Opísané podmienky UAE sa následne úspešne použili aj pri ďalších hospodársky významných hnedých makroriasach (L. hyperborea a A. nodosum) na získanie extraktov bohatých na polysacharidy. Táto štúdia preukazuje použiteľnosť UAE na zlepšenie extrakcie bioaktívnych polysacharidov z rôznych druhov makrorias.

Ultrazvuková extrakcia fytochemikálií z F. vesiculosus a P. canaliculata

Výskumný tím García-Vaquera porovnával rôzne nové extrakčné techniky vrátane vysokovýkonnej ultrazvukovej extrakcie, ultrazvukovo-mikrovlnnej extrakcie, mikrovlnnej extrakcie, hydrotermálne podporovanej extrakcie a extrakcie podporovanej vysokým tlakom s cieľom vyhodnotiť účinnosť extrakcie z druhov hnedých mikrorias Fucus vesiculosus a Pelvetia canaliculata. Na sonikáciu použili ultrazvukový extraktor Hielscher UIP500hdT. Analýza extrakčných výťažkov odhalila, že ultrazvukovou extrakciou sa dosiahli najvyššie výťažky väčšiny fytochemikálií z oboch F. vesiculosus. To znamená, že najvyššie výťažky zlúčenín extrahovaných z F. vesiculosus pomocou ultrazvukového extraktora UIP500hdT boli: celkový obsah fenolových látok (445,0 ± 4,6 mg ekvivalentov kyseliny galovej/g), celkový obsah florotanínov (362,9 ± 3,7 mg ekvivalentov floroglucinolu/g), celkový obsah flavonoidov (286,3 ± 7,8 mg ekvivalentov kvercetínu/g) a celkový obsah tanínov (189,1 ± 4,4 mg ekvivalentov katechínu/g).
Vo svojej výskumnej štúdii tím dospel k záveru, že použitie extrakcie podporovanej ultrazvukom „v kombinácii s 50% etanolovým roztokom ako extrakčným rozpúšťadlom by mohlo byť sľubnou stratégiou zameranou na extrakciu TPC, TPhC, TFC a TTC pri súčasnom znížení spoločnej extrakcie nežiaducich sacharidov z F. vesiculosus aj P. canaliculata, so sľubnými možnosťami využitia týchto zlúčenín ako liečiv, nutraceutík a kozmeceutík.“ [García-Vaquero et al., 2021]

Zväčšovanie mierky manotermosonikácie na Avignonskej univerzite pomocou ultrazvukových prístrojov Hielscher: od laboratórneho zariadenia UIP1000hdT (A) po poloprevádzkové zariadenie UIP4000hdT (B, C a D). Na obrázku D je schematicky znázornený priečny rez ultrazvukovou prietokovou celou FC100K.
obrázok a štúdia: ©Vernès et al. 2019

Vysokovýkonné ultrazvukové extraktory na narúšanie rias

Najmodernejšie ultrazvukové zariadenia Hielscher umožňujú úplnú kontrolu nad procesnými parametrami, ako sú amplitúda, teplota, tlak a prívod energie.
Pri ultrazvukovej extrakcii možno meniť a optimalizovať parametre, ako sú veľkosť častíc suroviny, typ rozpúšťadla, pomer tuhej látky k rozpúšťadlu a čas extrakcie, aby sa dosiahli najlepšie výsledky.
Keďže ultrazvuková extrakcia je netepelná extrakčná metóda, predchádza sa tepelnej degradácii bioaktívnych zložiek prítomných v surovine, napríklad v riasach.
Celkovo výhody, ako sú vysoký výťažok, krátky čas extrakcie, nízka teplota extrakcie a malé množstvá rozpúšťadla, robia zo sonikácie nadradenú extrakčnú metódu.

Ultrazvuková extrakcia: zavedená v laboratóriách aj priemysle

Ultrazvuková extrakcia sa vo veľkej miere používa na extrakciu akéhokoľvek druhu bioaktívnych zlúčenín z rastlinných materiálov, rias, baktérií a cicavčích buniek. Ultrazvuková extrakcia sa etablovala ako jednoduchá, nákladovo efektívna a vysoko účinná technika, ktorá prekonáva ostatné tradičné extrakčné techniky vyššími výťažkami extrakcie a kratším časom spracovania.
Vďaka ľahkej dostupnosti laboratórnych, stolových a plne priemyselných ultrazvukových systémov je dnes ultrazvuková extrakcia osvedčenou a dôveryhodnou technológiou. Ultrazvukové extraktory Hielscher sú nainštalované po celom svete v priemyselných spracovateľských prevádzkach, ktoré vyrábajú bioaktívne zlúčeniny v potravinárskej a farmaceutickej kvalite.

Štandardizácia procesu s Hielscher Ultrasonics

Extrakty získané z rias, ktoré sa používajú v potravinách, liečivách alebo kozmetike, sa musia vyrábať v súlade so správnou výrobnou praxou (GMP) a podľa štandardizovaných špecifikácií spracovania. Digitálne extrakčné systémy Hielscher Ultrasonics sú vybavené inteligentným softvérom, ktorý uľahčuje presné nastavenie a riadenie procesu sonikácie. Automatický záznam údajov ukladá všetky parametre ultrazvukového procesu, ako sú ultrazvuková energia (celková a čistá energia), amplitúda, teplota a tlak (ak sú namontované snímače teploty a tlaku), spolu s dátumovou a časovou pečiatkou na zabudovanú SD kartu. To vám umožňuje spätne skontrolovať každú ultrazvukom spracovanú šaržu. Zároveň je zabezpečená reprodukovateľnosť a trvalo vysoká kvalita produktu.

Nasledujúca tabuľka poskytuje predstavu o približnej spracovateľskej kapacite našich ultrazvukových procesorov: