Ультразвуковое производство высокоочищенных шизофиллан-бета-глюканов

Шизофиаллан – грибковый β-глюкан с иммуномодулирующими свойствами. Для получения высокоактивных лекарственных эффектов шизофиллан должен иметь низкую молекулярную массу, чтобы демонстрировать улучшенную биодоступность. Было доказано, что ультразвуковое исследование снижает молекулярную массу шизофиллана. Являясь надежным и эффективным методом, ультразвуковая обработка может быть легко применена для производства низкомолекулярного шизофиллана.

Шизофиллумовые грибы и ультразвуковая экстракция бета-глюканом

Виды гриба Schizophyllum растут в природе на гниющих деревьях после сезонов дождей. Плодовые тела собирают в следующий засушливый сезон. Виды Schizophyllum богаты биохимическими соединениями, такими как глюканы, и поэтому употребляются особенно в тропических странах в пищу и лекарства. Благодаря своим иммуномодулирующим, противогрибковым, противоопухолевым и противовирусным свойствам, Schizophyllum commune, также известный как гриб Splitgill, привлек биотехнологические и фармацевтические компании.
Полисахарид шизофиллан, также известный как сизофиран, сонифилан или сизофилан, является основным β-глюканом, содержащимся в грибах Schizophyllum, которые содержат высокоэффективный биоактивный β-глюкан шизофиллан.
Грибы Schizophyllum commune произрастают в природе на деревьях, мицеллиум также можно культивировать в ферментационном отваре. Для фармацевтических и косметических применений низкомолекулярный шизофиллан намного более эффективен, чем высокомолекулярный шизофиллан. Это связано с тем, что низкомолекулярный шизофиллан показывает значительно лучшую биодоступность и скорость абсорбции. Кроме того, высокомолекулярный шизофиллан часто проблематичен в применении, поскольку он приводит к высокой вязкости его водных растворов.
Ультразвуковое уменьшение размеров является высокоэффективным и надежным методом снижения молекулярной массы шизофиллана, тем самым повышая качество молекулы β-глюкана.

Протокол производства низкомолекулярного шизофиллана

Поскольку шизофиллан с молекулярной массой демонстрирует значительно лучшую биодоступность и свойства применения, исследовательская группа Смирну исследовала ультразвук для расщепления и уменьшения размера молекулы β-глюкана шизофиллана.

Ультразвуковое исследование шизофилланов

β-1.3(1.6)-Глюкан шизофиллан (SPG) был получен путем погружного культивирования гриба S. commune в биореакторе с использованием сахарозы в качестве субстрата.
После окончания культивирования отвар культуры разбавляли деминерализованной водой до шизофиллановой концентрации 2 г/л и подвергали ультразвуковой обработке ультразвуковой процессор UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Германия) в режиме рециркуляции при следующих параметрах и условиях: расход среды 50 мл/с, частота 20 кГц, мощность 2000 Вт, сонотрод типа BS2d22, усилитель типа В2-1,4 и амплитуда 100%. Температура отвара культуры в начале ультразвуковой обработки составляла 25°С. Ультразвуковой культуральный бульон (удельная потребляемая энергия 100 Вт/мл) фильтровали через глубинный фильтр Seitz HS800 под давлением 1,5 бар при 40°С. Ультразвуковой шизофиллан (uSPG) для определения химических характеристик осаждали из фильтрата с тройным количеством изопропилового спирта при лабораторной температуре и сушили при 60°C в течение 12 ч растворы uSPG для иммунологических исследований готовили следующим образом: (1) ультразвуковой фильтрат культурального бульона диафильтровали через 0,1 м2 кассету Pall Centramate T-series PES (отсечка 100 кДа) при давлении 0,8 бар и дифильтрацию продолжали до тех пор, пока ретентатная проводимость не составила 20 мкСм/см; (2) раствор концентрировали диафильтрацией до концентрации uSPG 1 г/л и стерилизовали автоклавированием при 120°С/20 мин. Денатурированный uSPG получали аналогичным образом, за исключением того, что NaOH добавляли к фильтрату культурального бульона в концентрации 0,2 М и подщелачиваемый раствор инкубировали в течение 30 мин при лабораторной температуре перед диафильтрацией.

Аналитические методы

Выход мицелия оценивали гравиметрически: отвар культуры разбавляли водой в соотношении 1:4, центрифугировали 10000 × г при 25°С в течение 20 мин, осадок промывали тройным количеством воды, сушили при 60°С и взвешивали. Шизофиллан осаждали из надосадочной жидкости с тройным количеством изопропилового спирта, сушили при 60°С в течение 24 ч и определяли его выход гравиметрическим путем. pO2 в культуральном бульоне определяли с помощью оптического зонда Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Швейцария).
Динамическую вязкость культурального бульона измеряли на тестере HAAKE Visco Tester 6L с веретенами 1L и 2L при 4°C и скорости вращения 30 об/мин. Скорость фильтрации рассчитывалась от времени фильтрации 500 мл питательного бульона через 200 × глубинным фильтром Seitz HS800 (Pall, США) 200 мм при давлении 1,5 бар и 40°C.
Молекулярную массу uSPG измеряли методом SEC-MALLS на системе ВЭЖХ Alliance (Waters) с последовательно соединенными колонками PL aquagel OH60 и PL aquagel OH40, а детектор miniDAWN TREOS (Wyatt) концентрировали диафильтрацией до концентрации uSPG 1 г/л и стерилизовали автоклавированием при 120°C/20 мин. Денатурированный uSPG получали аналогичным образом, за исключением того, что NaOH добавляли к фильтрату культурального бульона в концентрации 0,2 М и подщелачиваемый раствор инкубировали в течение 30 мин при лабораторной температуре перед диафильтрацией.

Результаты:
Ультразвуковая обработка применялась непосредственно к культуральному бульону S. commune 144-h с мицелием для облегчения последующей обработки SPG.
 
Характеристики ультразвукового шизофиллана: Ультразвуковой шизофиллан (УЗПГ) осаждали из фильтрата культурального бульона спиртом и характеризовали. По оценкам SEC-MALLS, МВт uSPG составляет около 1 MDa. Средняя молекулярная масса шизофиллана при жидкой ферментации составляет примерно 5 МДа, в то время как при твердотельном культивировании она может достигать до 10 МДа. Сравнивая молекулярную массу шизофиллана, обработанного ультразвуком, с молекулярной массой нативного шизофиллана, полученную в результате ультразвуковой обработки, можно наблюдать уменьшение молекулярной массы в 5-10 раз.
Ультразвуковой полисахарид uSPG содержал 0,7% белка и 1,0% остаточного белка после воспламенения. Гидролизат uSPG более чем на 99% состоит из глюкозы. Результаты анализа показывают, что ультразвуковая обработка расщепляет β-глюкановый остов случайным образом, а боковые ветви остаются неповрежденными, тем самым уменьшая размер и молекулярную массу шизофиллана. Иммунологические исследования по преимущественно свободному от белка и эндотоксинов uSPG показали, что ультразвуковой шизофиллан с низким Mw обладает выраженной иммуномодулирующей активностью.

 
Пониженная вязкость: Ультразвуковое воздействие приводило к значительному снижению вязкости культурального бульона. При ультразвуковой обработке вязкость культурального бульона изменялась нелинейно: в начале ультразвуковой обработки вязкость снижалась быстро, но в дальнейшем замедлялась. Удельный расход энергии 100 Вт/мл был достаточен для снижения вязкости культурального бульона почти в 7 раз.

Улучшенная фильтрация: Обработанный ультразвуком бульон протекал через фильтр быстрее, чем необработанный бульон (удельная потребляемая энергия 0 Вт/мл) с высокомолекулярным SPG. Кроме того, ультразвуковое воздействие значительно снижает потери продукта при фильтрации. Фильтрат необработанного культурального бульона с высокомолекулярным SPG (удельный расход энергии 0 Вт/мл) содержал 0,3 ± 0,07 г/л SPG, в то время как концентрация SPG до глубинной фильтрации составляла 2 г/л. Напротив, фильтрат ультразвуковой культуры с концентрацией 100 Вт/мл содержал SPG в концентрации 2,2 ± 0,2 г/л, что соответствует практически нулевым потерям продукта.

Заключение: В своем заключении исследовательская группа делает вывод о том, что ультразвуковая обработка является эффективной технологией получения низкомолекулярного шизофиллана, который затем может быть использован в косметике и медицине. Ультразвуковая обработка при применении на цельном культуральном бульоне с мицелием приносит определенные преимущества для производства шизофилланов. Это снижает потери продукта при последующей переработке и делает возможным производство высокоочищенного полисахарида за счет эффективного использования ультрафильтрации.
Кроме того, исследователи обнаружили, что ультразвуковая обработка шизофиллана легко масштабируется. Одна установка опытной установки ультразвукового дезинтегратора УИП2000HDT перерабатывает 1 литр питательного бульона за 110 с в проточном режиме. Производительность системы может быть легко увеличена за счет последовательного подключения дополнительных ультразвуковых блоков.

 
Узнайте больше о простом масштабировании экстракции грибов!
 

Высокопроизводительное ультразвуковое оборудование для переработки грибкового глюкана

Фрагментация полисахаридов, таких как глюканы, а также других биологически активных соединений, таких как хитин и хитозан, может быть надежно обработана с помощью высокопроизводительного ультразвукового оборудования Hielscher. Наши ультразвуковые аппараты могут обеспечивать высокую амплитуду, обеспечивают точную управляемость параметрами процесса и могут работать в режиме 24/7 при большой нагрузке и в сложных условиях. Линейка оборудования Hielscher Ultrasonics надежно выполняет эти требования. Помимо выдающихся ультразвуковых характеристик, ультразвуковые аппараты Hielscher могут похвастаться высокой энергоэффективностью, что является значительным экономическим преимуществом – особенно при использовании на коммерческом крупносерийном производстве.
Ультразвуковые аппараты Hielscher – это высокопроизводительные системы, которые могут быть оснащены такими аксессуарами, как сонотроды, бустеры, реакторы или проточные ячейки, чтобы оптимально соответствовать потребностям вашего технологического процесса. Благодаря цифровому цветному дисплею, возможности предварительной настройки прогонов ультразвука, автоматической записи данных на встроенную SD-карту, удаленному управлению через браузер и многим другим функциям, обеспечивается высочайший уровень управления процессом и удобство для пользователя. В сочетании с прочностью и высокой несущей способностью, ультразвуковые системы Hielscher являются вашей надежной рабочей лошадкой в производстве. Снижение молекулярной массы β-глюканов, таких как шизофиллан, требует мощного ультразвука для получения целевого расщепления и конечного продукта шизофиллана высокого качества, который может быть использован в фармацевтических целях.
 
Узнайте больше информации об ультразвуковой экстракции бета-глюкана из грибов, включая пошаговые инструкции здесь!
 
В таблице ниже приведена примерная производительность обработки наших ультразвуковых аппаратов: