Ультразвуковое производство высокоочищенных бета-глюканов шизофиллана

Шизофиллан – грибной β-глюкан с иммуномодулирующими свойствами. Для достижения высокой лечебной активности шизофиллан должен иметь низкую молекулярную массу, обеспечивающую улучшенную биодоступность. Доказано, что обработка ультразвуком снижает молекулярную массу шизофиллана. Обработка ультразвуком – надежный и эффективный метод, который можно легко применять для производства низкомолекулярного шизофиллана.

Грибы Schizophyllum и ультразвуковая экстракция бета-глюканов

Виды грибов Schizophyllum растут в природе на разлагающихся деревьях после сезонов дождей. Плодовые тела собирают в следующий сухой сезон. Виды Schizophyllum богаты биохимическими соединениями, такими как глюканы, и поэтому используются в пищу и в лечебных целях, особенно в тропических странах. Благодаря своим иммуномодулирующим, противогрибковым, противоопухолевым и противовирусным свойствам Schizophyllum commune, также известный как щелелистник обыкновенный, привлек внимание биотехнологических и фармацевтических компаний.
Полисахарид шизофиллан, также известный как сизофиран, сонифилан или сизофилан, является основным β-глюканом, содержащимся в грибах Schizophyllum, которые служат источником высокоэффективного биоактивного β-глюкана шизофиллана.
Грибы Schizophyllum commune растут в природе на деревьях; мицелий также можно культивировать в ферментационной среде. Для фармацевтического и косметического применения низкомолекулярный шизофиллан намного эффективнее высокомолекулярного шизофиллана. Это обусловлено тем, что низкомолекулярный шизофиллан обладает значительно лучшей биодоступностью и более высокой скоростью всасывания. Кроме того, применение высокомолекулярного шизофиллана часто сопряжено с проблемами, поскольку его водные растворы имеют высокую вязкость.
Ультразвуковое уменьшение размера – высокоэффективный и надежный метод снижения молекулярной массы шизофиллана, который тем самым повышает качество молекулы β-глюкана.

Протокол производства низкомолекулярного шизофиллана

Поскольку шизофиллан с молекулярной массой демонстрирует значительно лучшую биодоступность и свойства при применении, исследовательская группа Smirnou изучила обработку ультразвуком для расщепления и уменьшения размера молекулы β-глюкана шизофиллана.

Обработка шизофиллана ультразвуком

β-1.3(1.6)-Glucan шизофиллан (SPG) получали путем глубинного культивирования гриба S. commune в биореакторе с использованием сахарозы в качестве субстрата.
После завершения культивирования культуральную жидкость разбавляли деминерализованной водой до концентрации шизофиллана 2 g/L и обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового процессора UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Германия) в режиме рециркуляции при следующих параметрах и условиях: расход среды 50 mL/s, частота 20 kHz, выходная мощность 2000 W, сонотрод типа BS2d22, бустер типа B2-1.4 и амплитуда 100%. Температура культуральной жидкости в начале обработки ультразвуком составляла 25°C. Обработанную ультразвуком культуральную жидкость (удельный подвод энергии 100 Ws/mL) фильтровали через глубинный фильтр Seitz HS800 под давлением 1,5 bar при 40°C. Для определения химических характеристик обработанный ультразвуком шизофиллан (uSPG) осаждали из фильтрата тройным количеством изопропилового спирта при лабораторной температуре и сушили при 60°C в течение 12h. Растворы uSPG для иммунологических исследований готовили следующим образом: (1) фильтрат обработанной ультразвуком культуральной жидкости подвергали диафильтрации через кассету Pall Centramate T-series PES площадью 0,1m2 (порог отсечения 100 kDa) при 0,8 bar; диафильтрацию продолжали до достижения электропроводности ретентата 20 μS/cm; (2) раствор концентрировали путем диафильтрации до концентрации uSPG 1 g/L и стерилизовали автоклавированием при 120°C/20 min. Денатурированный uSPG готовили аналогичным способом, за исключением того, что в фильтрат культуральной жидкости добавляли NaOH до концентрации 0,2 M и перед диафильтрацией инкубировали подщелоченный раствор в течение 30 min при лабораторной температуре.

Аналитические методы

Выход мицелия оценивали гравиметрически: культуральную жидкость разбавляли водой в соотношении 1:4, центрифугировали при 10 000 × g и 25°C в течение 20 min, осадок промывали тройным количеством воды, сушили при 60°C и взвешивали. Шизофиллан осаждали из надосадочной жидкости тройным количеством изопропилового спирта, сушили при 60°C в течение 24h и определяли его выход гравиметрически. pO2 в культуральной жидкости измеряли оптическим датчиком Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Швейцария).
Динамическую вязкость культуральной жидкости измеряли на HAAKE Visco Tester 6L со шпинделями 1L и 2L при 4°C и скорости вращения 30 rpm. Скорость фильтрации рассчитывали по времени фильтрации 500 mL культуральной жидкости через глубинный фильтр Seitz HS800 размером 200 × 200 mm (Pall, США) под давлением 1,5 bar при 40°C.
Молекулярную массу uSPG измеряли методом SEC-MALLS на системе ВЭЖХ Alliance (Waters) с последовательно соединенными колонками PL aquagel OH60 и PL aquagel OH40, а детектор miniDAWN TREOS (Wyatt) концентрировали путем диафильтрации до концентрации uSPG 1 g/L и стерилизовали автоклавированием при 120°C/20 min. Денатурированный uSPG готовили аналогичным способом, за исключением того, что в фильтрат культуральной жидкости добавляли NaOH до концентрации 0,2 M и перед диафильтрацией инкубировали подщелоченный раствор в течение 30 min при лабораторной температуре.

Результаты:
Обработку ультразвуком применяли непосредственно к культуральной жидкости S. commune после 144-h культивирования, содержащей мицелий, для облегчения последующих стадий переработки SPG.
 
Характеристики шизофиллана, обработанного ультразвуком: Обработанный ультразвуком шизофиллан (uSPG) осаждали спиртом из фильтрата культуральной жидкости и определяли его характеристики. По оценке методом SEC-MALLS, Mw uSPG составляла около 1 MDa. Средняя молекулярная масса шизофиллана, полученного при жидкофазной ферментации, составляет приблизительно 5 MDa, тогда как при твердофазном культивировании она может достигать 10 MDa. При сравнении молекулярной массы обработанного ультразвуком шизофиллана с молекулярной массой нативного необработанного шизофиллана можно наблюдать снижение молекулярной массы в 5–10 раз вследствие обработки ультразвуком.
Обработанный ультразвуком полисахарид uSPG содержал 0,7%w/w белка и 1,0%w/w остатка после прокаливания. Гидролизат uSPG состоял из глюкозы более чем на 99%. Результаты анализа показывают, что обработка ультразвуком случайным образом расщепляет основную цепь β-глюкана, при этом боковые ответвления остаются неповрежденными, что уменьшает размер и молекулярную массу шизофиллана. Иммунологические исследования uSPG, практически не содержащего белка и эндотоксинов, показали, что обработанный ультразвуком шизофиллан с низкой Mw обладает выраженной иммуномодулирующей активностью.

 
Снижение вязкости: Обработка ультразвуком привела к значительному снижению вязкости культуральной жидкости. Во время обработки ультразвуком вязкость культуральной жидкости изменялась нелинейно: в начале обработки вязкость снижалась быстро, но затем снижение замедлялось. Удельного подвода энергии 100 Ws/mL было достаточно для снижения вязкости культуральной жидкости почти в 7 раз.

Улучшение фильтрации: Обработанная ультразвуком культуральная жидкость проходила через фильтр быстрее, чем необработанная культуральная жидкость (удельный подвод энергии 0 Ws/mL) с высокомолекулярным SPG. Кроме того, обработка ультразвуком значительно снизила потери продукта при фильтрации. Фильтрат необработанной культуральной жидкости с высокомолекулярным SPG (удельный подвод энергии 0 Ws/mL) содержал 0,3 ± 0,07 g/L SPG, тогда как концентрация SPG до глубинной фильтрации составляла 2 g/L. Напротив, фильтрат культуральной жидкости, обработанной ультразвуком при 100 Ws/mL, содержал SPG в концентрации 2,2 ± 0,2 g/L, что соответствует практически нулевым потерям продукта.

Заключение: В своем заключении исследовательская группа подводит итог: обработка ультразвуком является эффективной технологией производства низкомолекулярного шизофиллана, который затем можно использовать в косметике и медицине. Применение обработки ультразвуком ко всей культуральной жидкости вместе с мицелием дает определенные преимущества при производстве шизофиллана. Оно снижает потери продукта на последующих стадиях переработки и позволяет производить высокоочищенный полисахарид благодаря эффективному использованию ультрафильтрации.
Кроме того, исследователи установили, что обработка шизофиллана ультразвуком легко масштабируется. Один ультразвуковой дезинтегратор UIP2000hdT в составе пилотной установки обработал 1 Liter культуральной жидкости за 110 s в проточном режиме. Производительность системы можно легко увеличить путем последовательного подключения дополнительных ультразвуковых аппаратов.

 
Узнайте больше о простом масштабировании экстракции из грибов!
 

Высокопроизводительное ультразвуковое оборудование для обработки грибных глюканов

Фрагментацию полисахаридов, таких как глюканы, а также других биоактивных соединений, таких как хитин и хитозан, можно надежно осуществлять с помощью высокопроизводительного ультразвукового оборудования Hielscher. Наши ультразвуковые аппараты обеспечивают высокие амплитуды, позволяют точно контролировать параметры процесса и могут работать 24/7 под высокой нагрузкой и в сложных условиях. Оборудование Hielscher Ultrasonics надежно удовлетворяет этим требованиям. Помимо выдающейся эффективности ультразвуковой обработки, ультразвуковые аппараты Hielscher отличаются высокой энергоэффективностью, что дает существенное экономическое преимущество – особенно при использовании в коммерческом крупномасштабном производстве.
Ультразвуковые аппараты Hielscher – высокопроизводительные системы, которые можно оснащать такими принадлежностями, как сонотроды, бустеры, реакторы или проточные ячейки, для оптимального соответствия требованиям вашего процесса.
Цифровой цветной дисплей, возможность предварительной настройки циклов обработки ультразвуком, автоматическая запись данных на встроенную SD-карту, дистанционное управление через браузер и множество других функций обеспечивают высочайший уровень контроля процесса и удобства использования. В сочетании с прочностью и способностью выдерживать высокие нагрузки ультразвуковые системы Hielscher становятся вашей надежной рабочей лошадкой на производстве.
Снижение молекулярной массы β-глюканов, таких как шизофиллан, требует мощного ультразвука для достижения целевого расщепления и получения высококачественного конечного продукта шизофиллана, который можно использовать в фармацевтических целях.
 
Здесь вы найдете дополнительную информацию об ультразвуковой экстракции бета-глюканов из грибов, включая пошаговые инструкции!
 
В таблице ниже приведена ориентировочная производительность обработки наших ультразвуковых аппаратов: