Образование амилоидных фибрилл с помощью ультразвукового устройства для микропланшетов UIP400MTP

Амилоидные фибриллы, подобно кристаллам, образуются в процессе нуклеации и последующего роста. Однако из-за высокого барьера свободной энергии нуклеации спонтанное образование амилоидных фибрилл происходит только после продолжительной лаг-фазы. Обработка ультразвуком стала мощным инструментом для индукции нуклеации амилоида, тем самым значительно ускоряя образование фибрилл. В сочетании с микропланшетным ридером, использующим флуоресценцию тиофлавина T (ThT), обработка ультразвуком позволяет проводить высокопроизводительное обнаружение амилоидных фибрилл одновременно в нескольких образцах.

Образование амилоидных фибрилл, индуцированное ультразвуком, с помощью устройства для микропланшетов UIP400MTP

С помощью ультразвукового устройства для многолуночных планшетов UIP400MTP можно быстро синтезировать амилоидные фибриллы одинакового качества в больших количествах для исследовательских целей. Этот эффективный подход позволяет изучать амилоидогенность белков. Метод способствует быстрому и воспроизводимому образованию амилоидных фибрилл, что было продемонстрировано на примере β2-microglobulin (β2-m) – амилоидогенного белка, связанного с диализ-ассоциированным амилоидозом.

Простой экспериментальный подход: образование амилоидных фибрилл, индуцированное ультразвуком

Для индукции образования фибрилл 96-луночный микропланшет помещали в центр ультразвукового устройства для многолуночных планшетов UIP400MTP, обеспечивающего равномерное воздействие ультразвука во всех лунках. Условия эксперимента были следующими:

1. Каждая лунка содержала 0,2 ml раствора β2-microglobulin (0,3 mg/ml, pH 2,5) с добавлением 5 μM ThT.
2. Планшет подвергали циклической обработке ультразвуком, например обработке ультразвуком в течение 1 минуты с последующей паузой в течение 9 минут.
3. После обработки ультразвуком флуоресценцию ThT измеряли с помощью микропланшетного ридера.

(см. So et al., 2011)

Сравнение с обычным перемешиванием

По сравнению с традиционными методами перемешивания обработка ультразвуком резко сократила лаг-фазу образования фибрилл. При обычном встряхивании микропланшета только в 1 из 10 лунок наблюдалось повышение флуоресценции ThT спустя 20 часов. Напротив, при циклической обработке ультразвуком (15 минут обработки ультразвуком с последующими 5 минутами покоя) значительное повышение флуоресценции ThT обнаруживалось сразу после первой обработки ультразвуком.

Резкое ускорение кинетики фибриллообразования

Результаты So et al. (2011) показали, что обработка ультразвуком позволяет сократить время спонтанного образования фибрилл β2-microglobulin при pH 2,5 с нескольких часов до всего 10–15 минут.
Изображения, полученные методом атомно-силовой микроскопии (АСМ), подтвердили, что фибриллы, образованные при 10-минутной обработке ультразвуком каждые 15 минут, морфологически неотличимы от фибрилл, образованных при 1-минутной обработке ультразвуком каждые 10 минут. Это подчёркивает воспроизводимость и устойчивость процесса образования амилоидных фибрилл, индуцированного ультразвуком.

АСМ-изображения амилоидных фибрилл, полученных при 1-минутной обработке ультразвуком каждые 10 минут (i), при 10-минутной обработке ультразвуком каждые 15 минут (ii) и в результате реакции с внесением затравки без обработки ультразвуком (iii). Белая масштабная линейка соответствует 1 μm.
Исследование и изображения: ©So et al., 2011

Фибриллообразование при нейтральном pH

Даже при нейтральном pH образование фибрилл достигалось после лаг-фазы продолжительностью 1,5 часа, что демонстрирует значительное снижение энергетического барьера нуклеации и роста при обработке ультразвуком. Это дополнительно подтверждает гипотезу о том, что образование амилоидных фибрилл представляет собой преимущественно физическую реакцию, в значительной степени ограниченную энергетическим барьером нуклеации, который обработка ультразвуком эффективно снижает.

Влияние на исследования заболеваний, связанных с амилоидом

Простое и надёжное образование амилоидных фибрилл с помощью ультразвукового устройства для микропланшетов UIP400MTP имеет большое значение для исследований болезни Альцгеймера (БА) и других заболеваний, связанных с амилоидом, таких как болезнь Паркинсона, сахарный диабет II типа и системные амилоидозы. При БА агрегация амилоида-β (Aβ) является ключевым патологическим признаком, однако изучение кинетики его фибриллообразования остаётся сложной задачей из-за длительных лаг-фаз и вариабельности результатов при использовании традиционных методов. Образование фибрилл под воздействием ультразвука ускоряет нуклеацию, обеспечивая высокую воспроизводимость и снижение вариабельности, что имеет решающее значение для скрининга потенциальных ингибиторов и понимания амилоидогенных механизмов. Кроме того, высокая производительность UIP400MTP позволяет проводить масштабные исследования неправильного сворачивания и агрегации белков, способствуя открытию терапевтических средств, способных модулировать образование фибрилл и потенциально замедлять прогрессирование нейродегенерации.

Это исследование подтверждает, что обработка ультразвуком с помощью устройства для многолуночных планшетов UIP400MTP является высокоэффективным методом ускорения образования амилоидных фибрилл. Ключевые преимущества этого подхода включают:

• Резкое сокращение лаг-фазы фибриллообразования.
• Равномерное воздействие ультразвука во всех лунках, обеспечивающее воспроизводимое образование фибрилл.
• Возможность высокопроизводительного скрининга, благодаря которой метод подходит для полногеномного поиска амилоидогенности белков.

Объединяя обработку ультразвуком с обнаружением флуоресценции ThT, этот метод обеспечивает быструю, масштабируемую и надёжную платформу для изучения образования амилоидных фибрилл. Благодаря своей эффективности и потенциалу высокой производительности этот подход может облегчить синтез амилоидных фибрилл для биофизических и фармацевтических исследований, предоставляя перспективный инструмент для исследований, связанных с амилоидом, и скрининга лекарственных средств.