Образование амилоидных фибрилл с помощью ультразвукового аппарата UIP400MTP Microplate

Амилоидные фибриллы, как и кристаллы, образуются в процессе зарождения и последующего роста. Однако из-за высокого барьера свободной энергии для зарождения спонтанное образование амилоидных фибрилл происходит только после длительной запаздывающей фазы. Ультразвуковая технология стала мощным инструментом для индуцирования амилоидного зародышеобразования, тем самым значительно ускоряя образование фибрилл. В сочетании со считывателем микропланшетов, использующим флуоресценцию тиофлавина T (ThT), ультразвуковое исследование позволяет с высокой пропускной способностью обнаруживать амилоидные фибриллы в нескольких образцах одновременно.

Ультразвуковое индуцированное образование амилоидных фибрилл с помощью ультразвукового аппарата UIP400MTP Microplate Sononicator

С помощью многолуночного ультразвукового аппарата UIP400MTP можно быстро синтезировать амилоидные фибриллы одинакового качества в больших количествах для исследовательских целей. Такой эффективный подход позволяет изучать амилоидогенность белка. Этот метод способствует быстрой и воспроизводимой фибрилляции амилоида, как показано на примере β2-микроглобулина (β2-m), амилоидогенного белка, связанного с амилоидозом, связанным с диализом.

Простой экспериментальный подход: ультразвуковая фибрилляция амилоида

Для индуцирования образования фибрилл в центр UIP400MTP многолуночного ультразвукового аппарата был помещен 96-луночный микропланшет, который обеспечивает равномерное ультразвуковое воздействие на все лунки. Условия эксперимента были следующими:

1. Каждая лунка содержала 0,2 мл раствора β2-микроглобулина (0,3 мг/мл, pH 2,5) с добавлением 5 мкМ ThT.
2. Пластина подвергалась циклам ультразвука, таким как 1-минутное ультразвуковое исследование с последующей 9-минутной паузой.
3. После ультразвуковой обработки флуоресценцию ThT измеряли с помощью считывателя микропланшетов.

(ср. Со и др., 2011)

Сравнение с обычным перемешиванием

По сравнению с традиционными методами перемешивания, ультразвуковая обработка значительно сократила фазу запаздывания образования фибрилл. В обычных условиях встряхивания микропланшетов только в 1 из 10 лунок наблюдалась повышенная флуоресценция ThT через 20 часов. Напротив, при использовании циклической ультразвукизации (15 минут ультразвука с последующим 5 минутами покоя) значительное увеличение флуоресценции ThT было обнаружено сразу после первой обработки ультразвуком.

Быстрое ускорение кинетики фибрилляции

Результаты, полученные в работе So et al. (2011), показали, что спонтанное образование фибрилл β2-микроглобулина при pH 2,5 может быть ускорено с нескольких часов до 10–15 минут с помощью ультразвука.
Изображения атомно-силовой микроскопии (АСМ) подтвердили, что фибриллы, образованные с помощью 10-минутного ультразвука каждые 15 минут, морфологически неотличимы от фибрилл, образованных с помощью 1-минутного ультразвука каждые 10 минут. Это подчеркивает воспроизводимость и надежность ультразвуковой фибрилляции амилоида.

АСМ изображения амилоидных фибрилл, полученные с помощью ультразвукового исследования с точностью до 1 минуты каждые 10 минут (i), с помощью ультразвуковой обработки через 10 минут каждые 15 минут (ii) и с помощью реакции посева без ультразвукового исследования (iii). Белая масштабная линейка соответствует 1 мкм.
Исследование и изображения: ©Со и др., 2011

Фибрилляция при нейтральном pH

Даже в условиях нейтрального pH образование фибрилл было достигнуто с задержкой в 1,5 часа, что свидетельствует о том, что ультразвуковая обработка значительно снижает энергетический барьер для зарождения и роста. Это еще раз подтверждает гипотезу о том, что фибрилляция амилоида является в первую очередь физической реакцией, в значительной степени ограниченной энергетическим барьером зародышеобразования, который ультразвук эффективно сокращает.

Влияние на исследования заболеваний, связанных с амилоидом

Легкое и надежное образование амилоидных фибрилл с помощью ультразвукового аппарата UIP400MTP имеет большое значение для исследований болезни Альцгеймера (БА) и других заболеваний, связанных с амилоидом, таких как болезнь Паркинсона, диабет II типа и системные амилоидозы. При болезни Альцгеймера агрегация амилоид-β (Aβ) является ключевым патологическим признаком, однако изучение кинетики ее фибрилляции остается сложной задачей из-за длительных фаз задержки и вариабельности традиционных методов. Образование фибрилл под действием ультразвука ускоряет зарождение, обеспечивая высокую воспроизводимость и сниженную вариабельность, что имеет решающее значение для скрининга потенциальных ингибиторов и понимания амилоидогенных механизмов. Кроме того, высокая пропускная способность UIP400MTP позволяет проводить крупномасштабные исследования неправильного сворачивания и агрегации белков, способствуя открытию терапевтических агентов, которые могут модулировать образование фибрилл и потенциально смягчать нейродегенеративное прогрессирование.

В этом исследовании установлено, что ультразвуковая обработка с использованием многолуночного ультразвукового аппарата UIP400MTP является высокоэффективным методом ускорения образования амилоидных фибрилл. К ключевым преимуществам такого подхода можно отнести:

• Значительное сокращение времени задержки фибрилляции.
• Равномерное ультразвуковое воздействие на все скважины, обеспечивающее воспроизводимое образование фибрилл.
• Высокая пропускная способность скрининга, что делает его пригодным для полногеномного поиска амилоидогенности белка.

Интегрируя ультразвук с обнаружением флуоресценции ThT, этот метод обеспечивает быструю, масштабируемую и надежную платформу для изучения фибрилляции амилоида. Учитывая его эффективность и высокую пропускную способность, этот подход может способствовать легкому синтезу амилоидных фибрилл для биофизических и фармацевтических исследований, предлагая многообещающий инструмент для исследований, связанных с амилоидом, и скрининга лекарств.