PMCA для высокопроизводительного обнаружения прионов с помощью ультразвукового устройства UIP400MTP

Ультразвуковое устройство UIP400MTP для многолуночных планшетов предлагает мощное решение для высокопроизводительной подготовки образцов при циклической амплификации неправильно свернутых белков (PMCA). Обеспечивая равномерное распределение энергии между множеством лунок и поддерживая точные параметры обработки ультразвуком, эта система позволяет одновременно обрабатывать многочисленные образцы с исключительной воспроизводимостью. Эти возможности имеют решающее значение для оптимизации PMCA с целью обнаружения прионов в низких концентрациях в сложных биологических образцах, таких как слюна, где ингибиторы анализа могут затруднять интерпретацию результатов.

Прионные заболевания, такие как хроническая изнуряющая болезнь (CWD) у представителей семейства оленевых и болезнь Крейтцфельдта–Якоба (CJD) у людей, представляют собой нейродегенеративные заболевания, вызываемые неправильно свернутыми прионными белками (PrP^Sc). Эти заболевания часто характеризуются низким содержанием инфекционных прионов в биологических жидкостях, таких как слюна, кровь и моча, что затрудняет диагностику и исследования. Горизонтальная передача CWD через прионы, выделяемые в объекты окружающей среды, имеет особенно значимые последствия для управления популяциями диких животных и экологического благополучия. Аналогичным образом, при таких заболеваниях, как болезнь Крейтцфельдта–Якоба, надежная амплификация неправильно свернутых прионных белков из образцов человека имеет решающее значение для развития диагностики и понимания прогрессирования заболевания.

Применение модифицированного протокола PMCA позволяет обойти действие распространенных ингибиторов анализа (например, муцинов в слюне) и достичь высокой чувствительности обнаружения прионов, которые иначе невозможно было бы обнаружить или результаты обнаружения которых были бы неоднозначными при использовании таких методов, как конверсия, индуцированная встряхиванием, в реальном времени (RT-QuIC). Эти достижения улучшают обнаружение прионов при различных заболеваниях, делая PMCA незаменимым инструментом для исследования и диагностики прионов. Ультразвуковое устройство UIP400MTP для многолуночных планшетов облегчает проведение высокопроизводительной PMCA, обрабатывая ультразвуком многочисленные образцы в микропланшетах (например, 6-, 24- или 96-луночных планшетах) или флаконах в штативе для пробирок.

Протокол высокопроизводительной циклической амплификации неправильно свернутых белков (PMCA)

Следующий протокол позволяет эффективно обрабатывать большое количество образцов в строго одинаковых условиях для получения надежных результатов исследований.

Подготовка образцов

Исходный материал:
Подготовьте образцы следующим образом:

• Ресуспендируйте осадки, полученные при экстракции саркозилом, в субстрате для PMCA.
• Непосредственно внесите прионные затравки в гомогенаты мозга или образцы крови.

Субстрат:

• Используйте 10% (масса/объем) гомогенат мозга, приготовленный из трансгенных мышей со сверхэкспрессией PrP^C (например, Tg-мышей).
• Гомогенизируйте ткань мозга в:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Храните субстрат при -80ºC до использования.

Размещение образцов в микропланшете или пробирках:
Пробирки:

• Добавьте 90 μL субстрата на основе гомогената мозга и внесите в качестве затравки 10 μL образца (например, крови, гомогената мозга или осадка, полученного с помощью саркозила).
• Поместите 3 тефлоновых шарика (диаметром 1,59 mm или 2,38 mm) в каждую пробирку объемом 0,2 mL.
• Установите пробирки в штатив, совместимый с ультразвуковым устройством UIP400MTP.

6-луночный микропланшет:

• Добавьте в каждую лунку 5 mL субстрата на основе гомогената мозга и внесите в качестве затравки 500 μL образца.
• Добавьте по 3 тефлоновых шарика в каждую лунку.

Процедура PMCA

Размещение:
Поместите штатив с пробирками или 6-луночный микропланшет в ультразвуковое устройство UIP400MTP в соответствии с инструкциями производителя.

Программа циклов:
Выполните 144 цикла PMCA следующим образом:

• Инкубация: 29 минут и 30 секунд при 37°C.
• Обработка ультразвуком: 30 секунд при амплитуде 60%.
• Контролируйте температуру: используйте подключаемый датчик температуры для контроля температуры образцов и запрограммируйте UIP400MTP на максимальную температуру 48–50°C.

Последующие раунды:
После завершения первого раунда из 144 циклов перенесите аликвоту амплифицированного материала:

• Разведите в 10 раз в свежем субстрате на основе гомогената мозга трансгенных мышей.
• В последующих раундах выполняйте по 96 циклов PMCA, сохраняя те же параметры обработки ультразвуком.
• Продолжайте до достижения нужного количества раундов (обычно до 5).

Обнаружение PrP^Sc

1. Расщепление протеиназой K:
   – Обработайте образцы протеиназой K (50 μg/mL) при 37°C в течение 1 часа.
   – Прекратите расщепление, добавив буфер для образцов с SDS и прокипятив в течение 10 минут.
2. Вестерн-блот-анализ:
   – Проанализируйте образцы после расщепления, используя:
   – антитела 6H4 или PRC1 против PrP.
   – Выполните SDS-PAGE и перенос на PVDF-мембраны для обнаружения.

 

Hielscher UIP400MTP – универсальный ультразвуковой аппарат для многолуночных планшетов, планшетов для ПЦР и пробирок с образцами. Благодаря непрерывной мощности ультразвуковой обработки 400 ватт он подходит для таких задач, как лизис клеток, эмульгирование, экстракция белков, фрагментация ДНК / РНК, дезагломерация, экстракция из образцов FFPE, отделение клеток и биоплёнок, а также эмульгирование. UIP400MTP – не ультразвуковая ванна. Это высокоинтенсивный чашечный излучатель для направленной ультразвуковой обработки. Этот мощный бесконтактный аппарат обеспечивает равномерную ультразвуковую обработку во всех лунках стандартного планшета. Вы можете точно регулировать амплитуду, мощность и импульсный режим. Встроенный таймер и датчик температуры обеспечивают воспроизводимость результатов. Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для планшетов охлаждает образцы с помощью водяной бани; внешний охладитель предлагается дополнительно.

 

Обрабатывайте больше образцов для получения более надежных результатов

Ультразвуковое устройство UIP400MTP для многолуночных планшетов значительно повышает эффективность и масштабируемость циклической амплификации неправильно свернутых белков (PMCA), решая проблему традиционно высокой продолжительности этой процедуры. Позволяя одновременно обрабатывать до 96 образцов в 96-луночном планшете, система оптимизирует рабочие процессы PMCA, поддерживая при этом точные и одинаковые условия обработки ультразвуком во всех лунках. Эта высокая производительность сводит к минимуму ручные операции, сокращает трудоемкие этапы и обеспечивает воспроизводимость, делая устройство незаменимым инструментом для исследования прионов. При исследовании как хронической изнуряющей болезни, так и болезни Крейтцфельдта–Якоба UIP400MTP облегчает проведение крупномасштабных исследований с большей эффективностью, позволяя исследователям удовлетворять требования современных диагностических и научных задач.

---

---

Литература / Ссылки

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.