PMCA для высокопроизводительного обнаружения прионов с помощью ультразвукового аппарата UIP400MTP
Многолуночный ультразвуковой аппарат UIP400MTP представляет собой мощное решение для высокопроизводительной пробоподготовки в условиях циклической амплификации неправильного сворачивания белка (PMCA). Обеспечивая равномерное распределение энергии по нескольким скважинам и поддерживая точные параметры ультразвуковой обработки, эта система позволяет одновременно обрабатывать множество образцов с исключительной воспроизводимостью. Эти возможности имеют решающее значение для оптимизации PMCA для обнаружения прионов в низких концентрациях в сложных биологических образцах, таких как слюна, где ингибиторы анализа могут исказить результаты.
Прионные заболевания, такие как хроническая болезнь истощения (CWD) у цервидов и болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD) у человека, являются нейродегенеративными расстройствами, вызванными неправильно свернутыми прионными белками (PrPSc). Эти заболевания часто связаны с низким уровнем инфекционных прионов в жидкостях организма, таких как слюна, кровь и моча, что затрудняет диагностику и исследования. Горизонтальная передача CWD через прионы, выделенные в экологических матрицах, имеет особенно значительные последствия для управления дикой природой и экологического здоровья. Аналогичным образом, при таких заболеваниях, как болезнь Крейтцфельдта-Якоба, надежная амплификация неправильно свернутых прионных белков из человеческих образцов имеет решающее значение для улучшения диагностики и понимания прогрессирования заболевания.
Высокоэффективная амплификация неправильного сворачивания белка с высокопроизводительным ультразвуковым аппаратом UIP400MTP
Применение модифицированного протокола PMCA позволяет обойти распространенные ингибиторы анализа (например, муцины в слюне) и достичь высокой чувствительности при обнаружении прионов, которые в противном случае были бы необнаруживаемыми или неоднозначными, с помощью таких методов, как конверсия, индуцированная дрожанием в реальном времени (RT-QuIC). Эти достижения улучшают обнаружение прионов при различных заболеваниях, что делает PMCA незаменимым инструментом для исследования и диагностики прионов. Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP обеспечивает высокопроизводительное ультразвуковое исследование PMCA многочисленных образцов в микропланшетах (например, 6-, 24- или 96-луночных планшетах) или во флаконах в штативе для пробирок.
Протокол для высокопроизводительной циклической амплификации неправильного сворачивания белка (PMCA)
Следующий протокол позволяет эффективно обрабатывать большое количество образцов в точно таких же условиях для получения надежных результатов исследований.
Подготовка образцов
Исходный материал:
Подготовьте образцы следующим образом:
- Ресуспендирование гранул экстракции саркозила в субстрате PMCA.
- Непосредственно спайковые гомогенаты мозга или образцы крови с семенами прионов.
Субстрат:
- Используйте 10% (масс./об.) гомогената мозга, полученного из трансгенных мышей с чрезмерной экспрессией PrPC (например, Tg мышей).
- Гомогенизация мозговой ткани в:
– 1× ПБС.
– 150 мМ NaCl.
– 1% Тритон Х-100. - Храните субстрат при температуре -80ºC до использования.
Установка образца в микропланшет или пробирки:
Трубы:
- Добавьте 90 мкл субстрата гомогената мозга и семена с 10 мкл образца (например, кровь, гомогенат мозга или гранулы саркозила).
- Поместите 3 тефлоновых шарика (диаметром 1,59 мм или 2,38 мм) в каждую пробирку объемом 0,2 мл.
- Установите трубки в стойку, совместимую с ультразвуковым аппаратом UIP400MTP.
6-луночный микропланшет:
- Добавьте 5 мл субстрата гомогената мозга и семена с 500 мкл образца в лунку.
- Добавьте в каждую лунку по 3 тефлоновые бусины.
Процедура PMCA
Размещение:
Поместите штатив для пробирок или 6-луночный микропланшет в ультразвуковой аппарат UIP400MTP в соответствии с инструкциями производителя.
Программа велоспорта:
Выполните 144 цикла PMCA следующим образом:
- Инкубация: 29 минут 30 секунд при 37°C.
- Ультразвуковая обработка: 30 секунд при амплитуде 60%.
- Контролируйте температуру: используйте вставной датчик температуры для контроля температуры образца и программирования UIP400MTP на максимальную температуру 48–50 °C.
Последующие раунды:
После завершения первого цикла из 144 циклов перенесите аликвоту амплифицированного материала:
- Разведите в 10 раз в свежий трансгенный гомогенат мозга мыши.
- Выполните 96 циклов PMCA для последующих раундов, сохраняя те же параметры ультразвука.
- Продолжайте в течение желаемого количества раундов (обычно до 5).
Выявление PrPSc
- Пищеварение протеиназы К:
– Обрабатывайте образцы протеиназой К (50 мкг/мл) при 37°C в течение 1 часа.
– Завершите сбраживание, добавив SDS-буфер для образца и варя в течение 10 минут. - Анализ вестерн-блоттинга:
– Анализируйте обработанные образцы с помощью:
– Антитела к PrP 6H4 или PRC1.
– Выполните SDS-PAGE и передайте на мембраны PVDF для обнаружения.
UIP400MTP обеспечивает надежную подготовку образцов и простую интеграцию с существующими лабораторными рабочими процессами
UIP400MTP не является ультразвуковой ванной. Это чашечный рупор высокой интенсивности для сфокусированной ультразвуковой обработки. Этот мощный бесконтактный ультразвуковой аппарат обеспечивает равномерную ультразвуковую обработку во всех лунках стандартной луночной пластины. У вас есть точный контроль над амплитудой, мощностью и пульсацией. Встроенный таймер и датчик температуры обеспечивают стабильные результаты. Ультразвуковой аппарат UIP400MTP пластины охлаждает образцы на водяной бане (внешний охладитель опционально).
Обрабатывайте больше образцов для получения более надежных результатов
Многолуночный ультразвуковой аппарат UIP400MTP значительно повышает эффективность и масштабируемость циклической амплификации неправильного сворачивания белка (PMCA), решая традиционно трудоемкий характер процедуры. Позволяя одновременно обрабатывать до 96 образцов в 96-луночном планшете, система оптимизирует рабочие процессы PMCA, сохраняя при этом точные и однородные условия ультразвуковой обработки во всех скважинах. Эта высокая пропускная способность сводит к минимуму ручную обработку, сокращает трудоемкие операции и обеспечивает воспроизводимость, что делает его незаменимым инструментом для исследований прионов. Будь то исследование хронической болезни истощения или болезни Крейтцфельдта-Якоба, UIP400MTP способствует крупномасштабным исследованиям с большей эффективностью, позволяя исследователям соответствовать требованиям современных диагностических и научных приложений.
Литература / Литература
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Ультразвуковой аппарат для микропланшетов UIP400MTP для высокопроизводительных PMCA
Часто задаваемые вопросы
Что такое прионы?
Прионы — это неправильно свернутые белки, способные вызывать аномальное сворачивание нормальных клеточных белков, особенно в мозге. В отличие от бактерий или вирусов, прионы не имеют нуклеиновых кислот и размножаются по механизму самосовершенствования, что приводит к прогрессирующим нейродегенеративным заболеваниям, таким как болезнь Крейтцфельдта-Якоба, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (коровье бешенство) и скрейпи у овец. Их устойчивость к стандартным процессам стерилизации подчеркивает их уникальную патогенность и создает серьезные проблемы в медицинских и исследовательских условиях.
Что такое техника PMCA?
Циклическая амплификация неправильного сворачивания белка (PMCA) — это лабораторный метод, используемый для амплификации неправильно свернутых прионных белков (PrP^Sc) in vitro. Он имитирует превращение нормального клеточного прионного белка (PrP^C) в его неправильно свернутую инфекционную форму (PrP^Sc), что является отличительной чертой прионных заболеваний. Этот процесс включает в себя циклы инкубации и ультразвуковой обработки для ускорения агрегации PrP^Sc, что делает его мощным инструментом для обнаружения низких уровней прионов.
Какое неправильное сворачивание белка вызывает болезнь Крейтцфельдта-Якоба?
Болезнь Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ) вызывается неправильным сворачиванием прионного белка (PrP). Нормальная изоформа (PrPC) принимает аномальную конформацию, богатую β листами (PrPSc), который становится инфекционным, образуя амилоидные агрегаты в мозге, что приводит к нейродегенерации.
Что такое циклическая амплификация инфекционных прионов при неправильном сворачивании белка?
Циклическая амплификация неправильного сворачивания белка (PMCA) — метод амплификации инфекционной формы прионов (PrP)Sc) путем многократной инкубации нормального PrPC с небольшими дозами PrPSc. Во время каждого цикла PrPSc катализирует неправильное сворачивание PrPC, и фрагменты ультразвука агрегируются, создавая больше сайтов затравки. Это имитирует репликацию прионов in vivo и позволяет проводить чувствительное обнаружение прионов в биологических образцах.
Что приводит к неправильному сворачиванию PrP?
Неправильное сворачивание PrP в патогенный PrPSc Форма может быть активирована следующими причинами:
- Спонтанное неправильное сворачивание при спорадических прионных заболеваниях.
- Генетические мутации в гене PRNP (например, семейные прионные заболевания).
- Контакт с инфекционным PrPSc через зараженную пищу, медицинские процедуры или другие средства.
- Факторы окружающей среды или структурные факторы, такие как pH, ионы металлов или сопутствующие факторы, которые дестабилизируют PrPC.
Что такое тест RT-QuIC?
Конверсия, индуцированная землетрясением в реальном времени (RT-QuIC) — это высокочувствительный диагностический анализ прионных заболеваний. Он обнаруживает PrPSc за счет усиления его способности преобразовывать рекомбинантный PrPC в неправильно сложенные агрегаты. В тесте используется флуоресцентное обнаружение образования амилоидных фибрилл, что делает его полезным для диагностики таких заболеваний, как болезнь Крейцфельда-Якоба в спинномозговой жидкости (СМЖ) или других тканях.
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лаборатория Кому промышленного размера.