Sonicare pentru liza celulară: Perturbarea celulelor și extracția
Liza celulară cu ultrasunete este o tehnică de preparare a probelor aplicată pe scară largă în laboratoarele moderne de biotehnologie. Scopul său principal este de a întrerupe membranele celulare sau celule întregi pentru a elibera componente intracelulare, cum ar fi proteine, acizi nucleici sau organite. În activitatea zilnică de laborator, aceasta înseamnă că sonicarea este o metodă standard pentru întreruperea celulară controlată și extragerea eficientă a biomoleculelor. Avantajul principal al sonicatoarelor constă în capacitatea lor de a modula cu precizie parametrii critici ai procesului, inclusiv intensitatea ultrasunetelor, pulsația și controlul temperaturii. Acest control permite cercetătorilor să obțină o liză fiabilă, minimizând în același timp deteriorarea termică sau mecanică a biomoleculelor sensibile, rezultând un proces de extracție delicat, dar extrem de eficient.
Liza celulară cu ajutorul Sonicatoarelor
Liza celulară cu ultrasunete utilizează cavitarea acustică pentru a întrerupe membranele celulare și a elibera molecule intracelulare. Hielscher Ultrasonics oferă sonicatorul clasic de tip sondă, precum și sonicatoare cu mai multe eșantioane pentru prelucrarea sterilă: VialTweeter pentru mai multe tuburi și flacoane și 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP pentru microplăci standard.
Hielscher Ultrasonics furnizează sonicatori puternici non-contact pentru pregătirea probei și analiza clinică. Sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP, The VialTweeter, CupHorn și sonicatorul de debit GDmini2 prelucrați probele în condiții sterile.
Omogenizatoare cu ultrasunete UP100H (100 wați) și UP400St (400 wați): Sonicare pentru liza celulară și extracție.
Omogenizatoare cu ultrasunete pentru liza celulară și extracție
| Tip dispozitiv cu ultrasunete | Concentrarea pe aplicații | Volumul eșantionului | Caz tipic de utilizare | Avantaje | Exemple de modele |
|---|---|---|---|---|---|
| Sondă tip Sonicators | Sonicarea unei singure probe | 0.1 mL până la ~1000 mL | Liza celulară, extracția proteinelor, fragmentarea ADN/ARN | Control precis al energiei; diferite sonotrozi; optim pentru probe mici și medii | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Prelucrarea paralelă a mai multor flacoane sigilate | 8-10 flacoane (~1-20 ml fiecare) | Liza standardizată a suspensiilor celulare multiple | Sonicare uniformă; evită contaminarea încrucișată; rezultate reproductibile | VialTweeter, Cuphorn |
| Sonicator pentru plăci cu 96 de puțuri | Sonicarea plăcilor multiwell și microtiter | Format microplacă | Screening de înaltă performanță, proteomică, teste celulare | Sonicare simultană și uniformă în toate godeurile; ideală pentru fluxurile de lucru cu mai multe eșantioane | UIP400MTP |
| reactoare cu celule de flux | Sonicare continuă pentru volume mai mari | >1 L, scalabil | Distrugerea celulelor la scară industrială, producția de extracte | Procesare continuă; scalabil; control complet al procesului (amplitudine, presiune, temperatură) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + celulă de debit |
| Sisteme de sonicare sterile / indirecte | Prelucrarea probelor fără contaminare | Dependent de flacon/tub/microplacă | Probe sensibile, medii sterile, medii de reglementare | Fără contact cu sonda; evită transferul; efort minim de curățare | VialTweeter, Cuphorn, UIP400MTP |
Avantajele utilizării sonicare pentru liza celulară
În comparație cu alte metode de liză celulară și extracție, liza celulară cu ultrasunete are mai multe avantaje:
- Viteză: Liza și extracția celulelor cu ultrasunete este o metodă rapidă care poate sparge celulele deschise în câteva secunde. Acest lucru este mult mai rapid decât alte metode, cum ar fi omogenizarea, congelarea-dezghețarea sau măcinarea mărgelelor.
- Eficiență: Liza și extracția celulelor cu ultrasunete pot fi utilizate pentru a trata probe mici, mari sau multiple simultan, făcându-l mai eficient decât alte metode care necesită prelucrarea individuală a probelor mici.
- Fără substanțe chimice: Liza și extracția celulelor cu ultrasunete este o metodă neinvazivă care nu necesită utilizarea de substanțe chimice dure sau enzime. Acest lucru îl face ideal pentru aplicații în care integritatea conținutului celular trebuie menținută. Contaminarea nedorită a probelor poate fi evitată.
- Randament ridicat: Liza și extracția celulelor cu ultrasunete poate extrage un randament ridicat de conținut celular, inclusiv ADN, ARN și proteine. Acest lucru se datorează faptului că undele sonore de înaltă frecvență sparg pereții celulari și eliberează conținutul în soluția înconjurătoare.
- Controlul temperaturii: Ultrasonciatoarele sofisticate permit controlul precis al temperaturii probei. Hielscher sonicatoare digitale sunt echipate cu un senzor de temperatură pluggable și software de monitorizare a temperaturii.
- Reproductibile: Protocoalele pentru liza celulelor cu ultrasunete pot fi ușor reproduse și chiar potrivite la diferite volume de probe mai mari sau mai mici printr-o simplă scalare liniară.
- Versatil: Liza celulelor cu ultrasunete și extracția pot fi utilizate pentru a extrage o gamă largă de tipuri de celule, inclusiv bacterii, drojdie, ciuperci, celule de plante și mamifere. Acesta poate fi, de asemenea, utilizat pentru a extrage diferite tipuri de molecule, inclusiv proteine, ADN, ARN și lipide.
- Pregătirea simultană a numeroaselor probe: Hielscher Ultrasonics oferă mai multe soluții pentru a procesa confortabil numeroase probe în exact aceleași condiții de proces. Acest lucru face ca etapa de pregătire a probei de liză și extracție să fie extrem de eficientă și să economisească timp.
- Ușor de utilizat: Liza celulară cu ultrasunete și echipamentul de extracție este ușor de utilizat și necesită o pregătire minimă. Echipamentul este, de asemenea, economic, deoarece este o investiție unică, fără a fi necesară răscumpărarea eliminărilor. Acest lucru îl face atractiv pentru o gamă largă de cercetători și laboratoare.
În general, liza și extracția celulelor cu ultrasunete este o metodă rapidă, eficientă, precis controlabilă și versatilă pentru extragerea conținutului celular. Avantajele sale față de metodele alternative îl fac o alegere atractivă pentru o gamă largă de aplicații industriale și de cercetare.
Principiul de lucru al lizei celulelor cu ultrasunete
Liza și extracția celulelor cu ultrasunete utilizează unde sonore de înaltă frecvență pentru a perturba celulele și a extrage conținutul lor. Undele sonore creează schimbări de presiune în lichidul înconjurător, provocând formarea și prăbușirea bulelor mici într-un proces cunoscut sub numele de cavitație. Aceste bule generează forțe mecanice localizate extrem de intense care pot sparge celulele deschise și pot elibera conținutul lor în soluția înconjurătoare.
Liza celulară folosind un ultrasonicator implică de obicei următorii pași:
- Eșantionul este plasat într-un tub sau recipient cu un tampon lichid.
- O sondă ultrasonică este introdusă în eșantion și se aplică unde sonore de înaltă frecvență cu aproximativ 20-30 kHz.
- Undele cu ultrasunete provoacă oscilații și cavitații în lichidul înconjurător, generând forțe localizate care sparg celulele deschise și eliberează conținutul lor.
- Proba este centrifugată sau filtrată pentru a îndepărta orice resturi celulare, iar conținutul extras este colectat pentru analiza din aval.
Dezavantaje ale metodelor comune de liză
În timpul lucrului dvs. în laboratoare, este posibil să fi experimentat deja dificultatea lizei celulare folosind protocoale tradiționale de liză mecanică sau chimică.
- Liza mecanică: Metodele de liză mecanică, cum ar fi măcinarea cu mortar și pistil sau omogenizarea folosind o presă franceză, o moară de mărgele sau un sistem rotor-stator nu au adesea opțiuni de control și reglare a precice. Aceasta înseamnă că utilizarea măcinării și măcinării poate genera rapid căldură și forțe de forfecare care pot deteriora proba și pot denatura proteinele. Ele pot fi, de asemenea, consumatoare de timp și necesită cantități mari de materie primă.
- Liza chimică: Metodele de liză chimică, cum ar fi liza pe bază de detergent, pot deteriora proba prin perturbarea bistratului lipidic și denaturarea proteinelor. Acestea pot necesita, de asemenea, mai multe etape și pot lăsa contaminanți reziduali care interferează cu aplicațiile din aval. Găsirea dozei optime de detergent este o provocare suplimentară.
- Cicluri de îngheț-dezgheț: Ciclurile de congelare-dezghețare pot provoca ruperea membranelor celulare, dar ciclurile repetate pot provoca, de asemenea, denaturarea și degradarea proteinelor. Această metodă poate necesita, de asemenea, mai multe cicluri, care pot fi consumatoare de timp și adesea duc la randamente mai mici.
- Liza enzimatică: Metodele de liză enzimatică pot fi specifice anumitor tipuri de celule și necesită mai mulți pași, ceea ce le face consumatoare de timp. De asemenea, generează deșeuri și necesită o optimizare atentă pentru a evita degradarea probei. Kiturile de liză enzimatică sunt adesea scumpe. Dacă procedura curentă de liză enzimatică dă rezultate insuficiente, sonicare ca metodă sinergică poate fi aplicată pentru a intensifica perturbarea celulelor.
Spre deosebire de metodele convenționale mecanice și chimice de liză celulară, sonicare este un instrument foarte eficient și fiabil pentru dezintegrarea celulelor, care permite un control complet asupra parametrilor sonicare. Acest lucru asigură o selectivitate ridicată în ceea ce privește eliberarea materialelor și puritatea produsului. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Este potrivit pentru toate tipurile de celule și ușor de aplicat la scară mică și mare – întotdeauna în condiții controlate. Ultrasonicators sunt ușor de curățat. Un omogenizator cu ultrasunete dispune întotdeauna de funcția clean-in-place (CIP) și sterilize-in-place (SIP). Sonotrode constă într-un corn masiv de titan, care pot fi șterse sau spălate în apă sau solvent (în funcție de mediul de lucru). Întreținerea ultrasonicators se datorează robusteții lor aproape neglijabile.
Liza cu ultrasunete și întreruperea celulelor
În general, liza probelor în laborator va dura între 15 secunde și 2 minute. Deoarece intensitatea sonicare este foarte ușor de ajustat prin stabilirea amplitudinii un timp de sonicare, precum și prin alegerea echipamentului potrivit, este posibil să se perturbe membranele celulare foarte ușor sau foarte brusc, în funcție de structura celulară și de scopul lizei (de exemplu, extracția ADN-ului necesită sonicare mai moale, extracția completă a proteinelor bacteriilor necesită un tratament cu ultrasunete mai intens). Temperatura în timpul procesului poate fi monitorizată de un senzor de temperatură integrat și poate fi ușor controlată prin răcire (baie de gheață sau celule de curgere cu jachete de răcire) sau prin sonicare în modul pulsat. În timpul sonicare în modul puls, cicluri scurte de spargere sonicare cu durata de 1-15 secunde permit disiparea căldurii și răcirea în perioadele intermitente mai lungi.
Toate procesele bazate pe ultrasunete sunt complet reproductibile și scalabile liniar.
The VialTweeter este un omogenizator cu ultrasunete pentru prepararea sterilă simultană, uniformă și rapidă a numeroaselor probe.
- Prepararea suspensiei celulare: Granulele celulare trebuie să fie complet suspendate într-o soluție tampon prin omogenizare (alegeți soluția tampon compatibilă cu analiza următoare, de exemplu metoda cromatografică specifică). Adăugați lizozime și / sau alți aditivi, dacă este necesar (acestea trebuie să fie, de asemenea, compatibile cu mijloacele de separare / purificare). Se amestecă / omogeniza ușor soluția sub sonicare ușoară până când se obține suspensia completă.
Citiți mai multe despre sinergiile lizozimelor combinate cu sonicarea! - Liza cu ultrasunete: Așezați proba într-o baie de gheață. Pentru întreruperea celulelor, sonicate suspensia la 60-90 secunde explozii (folosind modul puls al sonicatorului).
- Separare: Se centrifughează lizatul (de exemplu, 10 min. la 10 000 x g; la 4 °C). Se separă cu grijă supernatantul de granula celulară. Supernatantul este lizatul celular total. După filtrarea supernatantului, obțineți un fluid clarificat al proteinei celulare solubile.
Cele mai frecvente aplicații pentru ultrasonicators în biologie și biotehnologie sunt:
- Pregătirea extractului de celule
- Perturbarea drojdiei, bacteriilor, celulelor vegetale, țesuturilor celulare moi sau dure, materialului nucleic
- extracția proteinelor
- Prepararea și izolarea enzimelor
- Producerea antigenilor
- Extragerea ADN-ului și/sau fragmentarea țintită
- Pregătirea lipozomilor
Întreruperea celulelor cu ultrasonicator de tip sondă este o metodă eficientă de pregătire a probei.
Aplicațiile multiple ale ramurilor cu ultrasunete se ramifică în sectoarele biotehnologiei, bioingineriei, microbiologiei, biologiei moleculare, biochimiei, imunologiei, bacteriologiei, virusologiei, proteomicii, geneticii, fiziologiei, biologiei celulare, hematologiei și botanicii.
Liza: ruperea structurilor celulare
Celulele sunt protejate de o membrană plasmatică semipermeabilă care constă dintr-un bistrat fosfo-lipidic (de asemenea, bistrat proteină-lipidă; format din lipide hidrofobe și molecule de fosfor hidrofile cu molecule de proteine încorporate) și creează o barieră între interiorul celulei (citoplasmă) și mediul extracelular. Celulele vegetale și celulele procariote sunt înconjurate de un perete celular. Datorită peretelui celular gros al celulozei, celulele vegetale sunt mai greu de lizat decât celulele animale. Interiorul celulei, cum ar fi organitele, nucleul, mitocondria, este stabilizat de citoschelet.
Prin lizarea celulelor, se urmărește extragerea și separarea organitelor, proteinelor, ADN-ului, ARNm sau a altor biomolecule.
Metode convenționale de liză celulară și dezavantajele acestora
Există mai multe metode de lizare a celulelor, care pot fi împărțite în metode mecanice și chimice, care includ utilizarea detergenților sau solvenților, aplicarea unei presiuni înalte sau utilizarea unei mori de mărgele sau a unei prese franceze. Cel mai problematic dezavantaj al acestor metode este controlul și ajustarea dificilă a parametrilor procesului și, prin urmare, impactul.
Tabelul de mai jos prezintă principalele dezavantaje ale metodelor comune de liză:
Tabel: Metodele convenționale de liză celulară au dezavantaje majore
Procedura de liză
Liza este un proces sensibil. În timpul lizei, protecția membranei celulare este distrusă, totuși trebuie prevenită inactivarea, denaturarea și degradarea proteinelor extrase într-un mediu nefiziologic (abaterea de la valoarea pH-ului). Prin urmare, în general, liza se efectuează într-o soluție tampon. Cele mai multe dificultăți apar din cauza întreruperii necontrolate a celulelor, rezultând o eliberare nedirecționată a întregului material intracelular sau / și denaturarea produsului țintă.
Întrebări frecvente despre sonicare și liza celulară
- Puteți liza celulele cu sonicare? Da, sonicare lizează efectiv celulele folosind unde ultrasonice de înaltă frecvență care induc cavitație, un fenomen în care se formează bule mici de vapori și se prăbușesc violent în suspensia celulară. Forțele mecanice rezultate perturbă membranele celulare și facilitează eliberarea componentelor intracelulare în lichid.
- Cum se utilizează un sonicator pentru liza celulară? Utilizarea unui sonicator pentru liza celulară implică scufundarea sondei sonicator într-o suspensie celulară și ajustarea parametrilor, cum ar fi amplitudinea și durata pulsului. Procesul trebuie monitorizat îndeaproape pentru a optimiza perturbarea celulelor, reducând în același timp denaturarea proteinelor și inactivarea enzimelor.
- Care este principiul sonicare pentru liza celulară? Sonicare funcționează pe principiul cavitației acustice. Energia ultrasonică este transmisă în mediul lichid, provocând fluctuații rapide de presiune care duc la formarea și implozia microbulelor. Aceste implozii generează forțe intense de forfecare și temperaturi ridicate localizate, perturbând structurile celulare și sporind omogenitatea lizatului.
- Cât durează sonicare liză celulară? Durata sonicare pentru liza celulară poate varia semnificativ în funcție de factori precum tipul celulei, densitatea celulelor, puterea sonicatorului, și protocolul specific utilizat. Procedurile tipice pot varia de la câteva secunde la câteva minute, adesea efectuate în cicluri pentru a gestiona generarea de căldură și pentru a asigura întreruperea uniformă a celulelor.
- Care este scopul sonicare în extracția proteinelor? În extracția proteinelor, sonicare servește la ruperea eficientă a membranelor celulare și solubilizarea proteinelor. Această metodă este deosebit de utilă pentru eliberarea proteinelor din compartimentele celulare, ceea ce o face esențială pentru prepararea lizatelor din care proteinele urmează să fie purificate sau analizate.
- De ce este sonicare folosit pentru extracție? Sonicare este favorizat pentru extracție datorită acțiunii sale rapide și capacității de a aplica energia vizată, descompunerea structurilor celulare pentru a elibera molecule bioactive fără utilizarea tratamentelor chimice dure, păstrând astfel integritatea funcțională a compușilor extrași.
- Are sonicare perturba interacțiunile proteină-proteine? În timp ce sonicare poate perturba în mod eficient membranele celulare, de asemenea, poate perturba interacțiunile proteină-proteine. Nivelul de perturbare depinde de intensitatea sonicare și durata expunerii, ceea ce poate duce la denaturarea sau disocierea complexelor proteice, care ar putea afecta studiile analitice sau funcționale ulterioare.
- Sonicare poate fi folosit pentru a liza E. coli? Hielscher sonicators sunt deosebit de eficiente pentru liza celulelor bacteriene, cum ar fi E. coli, care au pereți celulari robuste. Tehnica oferă o metodă fizică de forfecare a peretelui celular și a membranei, făcându-l o metodă preferată pentru prepararea lizatelor bacteriene în laboratoarele de biologie moleculară și biochimie.
- Care sunt procesele ulterioare etapei de sonicare?
Etapele din aval după liza ultrasonică includ de obicei fracționarea lizatului, izolarea specifică a organitelor și extragerea sau purificarea ulterioară a proteinelor.
Lisatul procesat este apoi separat și pregătit pentru aplicații analitice sau funcționale, cum ar fi proteomică de înaltă rezoluție, transcriptomică sau studii de legare a receptorilor.
Literatură/Referințe
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.