Sonicare pentru liza celulară: dezintegrarea celulelor și extracție
Liza celulară cu ultrasunete este o tehnică de pregătire a probelor larg utilizată în laboratoarele moderne de biotehnologie. Scopul său principal este de a perturba membranele celulare sau celulele întregi pentru a elibera componente intracelulare precum proteine, acizi nucleici sau organite. În activitatea zilnică de laborator, aceasta înseamnă că sonicarea este o metodă standard pentru dezintegrarea controlată a celulelor și extracția eficientă a biomoleculelor. Avantajul esențial al sonicatoarelor constă în capacitatea lor de a modula precis parametrii critici ai procesului, inclusiv intensitatea ultrasunetelor, pulsația și controlul temperaturii. Acest control le permite cercetătorilor să obțină o liză fiabilă, reducând totodată la minimum deteriorarea termică sau mecanică a biomoleculelor sensibile, ceea ce conduce la un proces de extracție delicat, dar extrem de eficient.
Liza celulară cu sonicatoare
Liza celulară cu ultrasunete utilizează cavitația acustică pentru a perturba membranele celulare și a elibera moleculele intracelulare. Hielscher Ultrasonics oferă sonicatorul clasic cu sondă, precum și sonicatoare pentru probe multiple destinate procesării sterile: VialTweeter pentru mai multe tuburi și flacoane și sonicatorul pentru plăci cu 96 de godeuri UIP400MTP pentru microplăci standard.
Hielscher Ultrasonics furnizează sonicatoare puternice fără contact pentru pregătirea probelor și analiza clinică. Sonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn și sonicatorul cu flux GDmini2 procesează probele în condiții sterile.
Omogenizatoare cu ultrasunete UP100H (100 wați) și UP400St (400 wați): sonicare pentru liza celulară și extracție.
Omogenizatoare cu ultrasunete pentru liza celulară și extracție
| Tipul dispozitivului cu ultrasunete | Domeniu de aplicare | Volumul probei | Caz de utilizare tipic | Avantaje | Modele exemplificative |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonicatoare cu sondă | Sonicarea unei singure probe | 0,1 mL până la ~1000 mL | Liză celulară, extracție de proteine, fragmentare ADN/ARN | Control precis al energiei; diverse sonotrode; optim pentru probe mici și medii | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Procesarea în paralel a mai multor flacoane sigilate | 8–10 flacoane (~1–20 mL fiecare) | Liza standardizată a mai multor suspensii celulare | Sonicare uniformă; evită contaminarea încrucișată; rezultate reproductibile | VialTweeter, CupHorn |
| Sonicator pentru plăci cu 96 de godeuri | Sonicarea plăcilor multi-godeu și a plăcilor de microtitrare | Format de microplacă | Screening de mare capacitate, proteomică, teste celulare | Sonicare simultană și uniformă în toate godeurile; ideal pentru fluxuri de lucru cu probe multiple | UIP400MTP |
| Reactoare cu celulă de flux | Sonicare continuă pentru volume mai mari | >1 L, scalabil | Dezintegrarea celulelor la scară industrială, producția de extracte | Procesare continuă; scalabil; control complet al procesului (amplitudine, presiune, temperatură) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + celulă de flux |
| Sisteme de sonicare sterilă / indirectă | Procesarea probelor fără contaminare | În funcție de flacon/tub/microplacă | Probe sensibile, medii sterile, contexte reglementate | Fără contact cu sonda; evită contaminarea prin transfer (carryover); efort minim de curățare | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Avantajele utilizării sonicării pentru liza celulară
Comparativ cu alte metode de liză celulară și extracție, liza celulară cu ultrasunete prezintă mai multe avantaje:
- Viteză: Liza celulară și extracția cu ultrasunete reprezintă o metodă rapidă, care poate deschide celulele în câteva secunde. Aceasta este mult mai rapidă decât alte metode, precum omogenizarea, congelarea-decongelarea sau măcinarea în moara cu bile.
- Eficiență: Liza celulară și extracția cu ultrasunete pot fi utilizate pentru a trata simultan probe mici, mari sau multiple, ceea ce le face mai eficiente decât alte metode care necesită procesarea individuală a probelor mici.
- Fără substanțe chimice: Liza celulară și extracția cu ultrasunete reprezintă o metodă neinvazivă, care nu necesită utilizarea unor substanțe chimice agresive sau a enzimelor. Acest lucru o face ideală pentru aplicațiile în care integritatea conținutului celular trebuie menținută. Contaminarea nedorită a probelor poate fi evitată.
- Randament ridicat: Liza celulară și extracția cu ultrasunete pot extrage un randament ridicat de conținut celular, inclusiv ADN, ARN și proteine. Acest lucru se datorează faptului că undele sonore de înaltă frecvență deschid pereții celulari și eliberează conținutul în soluția înconjurătoare.
- Controlul temperaturii: Ultrasonicatoarele sofisticate permit controlul precis al temperaturii probei. Sonicatoarele digitale Hielscher sunt echipate cu un senzor de temperatură conectabil și cu software de monitorizare a temperaturii.
- Reproductibilitate: Protocoalele pentru liza celulară cu ultrasunete pot fi reproduse cu ușurință și chiar adaptate la diferite volume de probă, mai mari sau mai mici, printr-o simplă scalare liniară ascendentă.
- Versatilitate: Liza celulară și extracția cu ultrasunete pot fi utilizate pentru extracția unei game largi de tipuri de celule, inclusiv bacterii, drojdii, fungi, celule vegetale și de mamifere. De asemenea, pot fi utilizate pentru extracția diferitelor tipuri de molecule, inclusiv proteine, ADN, ARN și lipide.
- Pregătirea simultană a numeroase probe: Hielscher Ultrasonics oferă mai multe soluții pentru procesarea comodă a numeroase probe în exact aceleași condiții de proces. Acest lucru face ca etapa de pregătire a probelor pentru liză și extracție să fie extrem de eficientă și să economisească timp.
- Ușor de utilizat: Echipamentele pentru liza celulară și extracția cu ultrasunete sunt ușor de utilizat și necesită o instruire minimă. Echipamentele sunt, de asemenea, economice, deoarece reprezintă o investiție unică, fără a fi necesară achiziționarea repetată de consumabile de unică folosință. Acest lucru le face atractive pentru o gamă largă de cercetători și laboratoare.
În ansamblu, liza celulară și extracția cu ultrasunete reprezintă o metodă rapidă, eficientă, precis controlabilă și versatilă pentru extracția conținutului celular. Avantajele sale față de metodele alternative o fac o alegere atractivă pentru o gamă largă de aplicații de cercetare și industriale.
Principiul de funcționare al lizei celulare cu ultrasunete
Liza celulară și extracția cu ultrasunete utilizează unde sonore de înaltă frecvență pentru a perturba celulele și a extrage conținutul acestora. Undele sonore creează variații de presiune în lichidul înconjurător, determinând formarea și colapsul unor bule mici, într-un proces cunoscut sub numele de cavitație. Aceste bule generează forțe mecanice localizate de intensitate foarte mare, care pot deschide celulele și elibera conținutul acestora în soluția înconjurătoare.
Liza celulară cu ajutorul unui ultrasonicator implică de obicei următoarele etape:
- Proba este plasată într-un tub sau recipient cu un tampon lichid.
- O sonotrodă cu ultrasunete este introdusă în probă și se aplică unde sonore de înaltă frecvență de aprox. 20–30 kHz.
- Undele ultrasonice provoacă oscilații și cavitație în lichidul înconjurător, generând forțe localizate care deschid celulele și eliberează conținutul acestora.
- Proba este centrifugată sau filtrată pentru a îndepărta eventualele resturi celulare, iar conținutul extras este colectat pentru analiza ulterioară.
Dezavantajele metodelor obișnuite de liză
În timpul activității dumneavoastră în laborator, este posibil să fi experimentat deja dificultățile lizei celulare cu protocoale tradiționale de liză mecanică sau chimică.
- Liza mecanică: Metodele de liză mecanică, precum măcinarea cu mojar și pistil sau omogenizarea cu o presă franceză, o moară cu bile sau un sistem rotor-stator, nu dispun adesea de opțiuni precise de control și reglare. Aceasta înseamnă că măcinarea și mărunțirea pot genera rapid căldură și forțe de forfecare care pot deteriora proba și denatura proteinele. De asemenea, pot fi consumatoare de timp și necesită cantități mari de material de pornire.
- Liza chimică: Metodele de liză chimică, cum ar fi liza pe bază de detergenți, pot deteriora proba prin perturbarea bistratului lipidic și denaturarea proteinelor. De asemenea, pot necesita mai multe etape și pot lăsa contaminanți reziduali care interferează cu aplicațiile ulterioare. Găsirea dozei optime de detergent reprezintă o provocare suplimentară.
- Ciclurile de congelare-decongelare: Ciclurile de congelare-decongelare pot provoca ruperea membranelor celulare, însă ciclurile repetate pot provoca și denaturarea și degradarea proteinelor. Această metodă poate necesita, de asemenea, mai multe cicluri, ceea ce poate fi consumator de timp și duce adesea la randamente mai scăzute.
- Liza enzimatică: Metodele de liză enzimatică pot fi specifice anumitor tipuri de celule și necesită mai multe etape, ceea ce le face consumatoare de timp. De asemenea, generează deșeuri și necesită o optimizare atentă pentru a evita degradarea probei. Kiturile de liză enzimatică sunt adesea costisitoare. Dacă procedura dumneavoastră actuală de liză enzimatică oferă rezultate insuficiente, sonicarea poate fi aplicată ca metodă sinergică pentru a intensifica dezintegrarea celulelor.
Spre deosebire de metodele convenționale mecanice și chimice de liză celulară, sonicarea este un instrument foarte eficient și fiabil pentru dezintegrarea celulară, care permite un control complet asupra parametrilor de sonicare. Acest lucru asigură o selectivitate ridicată în ceea ce privește eliberarea materialelor și puritatea produsului. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Este adecvată pentru toate tipurile de celule și ușor de aplicat la scară mică și mare – întotdeauna în condiții controlate. Ultrasonicatoarele sunt ușor de curățat. Un omogenizator cu ultrasunete dispune întotdeauna de funcții de curățare la fața locului (CIP) și sterilizare la fața locului (SIP). Sonotroda constă dintr-o piesă masivă din titan, care poate fi ștearsă sau clătită în apă sau solvent (în funcție de mediul de lucru). Datorită robusteții lor, întreținerea ultrasonicatoarelor este aproape neglijabilă.
Liza cu ultrasunete și dezintegrarea celulelor
În general, liza probelor în laborator durează între 15 secunde și 2 minute. Deoarece intensitatea sonicării poate fi reglată foarte ușor prin setarea amplitudinii și a timpului de sonicare, precum și prin alegerea echipamentului potrivit, membranele celulare pot fi perturbate foarte delicat sau foarte abrupt, în funcție de structura celulară și de scopul lizei (de ex. extracția ADN necesită o sonicare mai blândă, iar extracția completă a proteinelor din bacterii necesită un tratament cu ultrasunete mai intens). Temperatura în timpul procesului poate fi monitorizată cu ajutorul unui senzor de temperatură integrat și poate fi controlată cu ușurință prin răcire (baie de gheață sau celule de flux cu mantale de răcire) sau prin sonicare în mod pulsat. În timpul sonicării în mod pulsat, ciclurile scurte de impulsuri de sonicare cu o durată de 1–15 secunde permit disiparea căldurii și răcirea în timpul pauzelor intermitente mai lungi.
Toate procesele bazate pe ultrasunete sunt complet reproductibile și scalabile liniar.
VialTweeter este un omogenizator cu ultrasunete pentru pregătirea sterilă simultană, uniformă și rapidă a numeroase probe.
- Pregătirea suspensiei celulare: peleturile celulare trebuie suspendate complet într-o soluție tampon prin omogenizare (alegeți o soluție tampon compatibilă cu analiza ulterioară, de ex. o anumită metodă cromatografică). Adăugați lizozime și/sau alți aditivi, dacă este necesar (și aceștia trebuie să fie compatibili cu mijloacele de separare/purificare). Amestecați/omogenizați ușor soluția prin sonicare blândă până la obținerea unei suspensii complete.
Citiți mai multe despre sinergiile dintre lizozime și sonicare! - Liza cu ultrasunete: plasați proba într-o baie de gheață. Pentru dezintegrarea celulelor, sonicați suspensia în impulsuri de 60–90 de secunde (folosind modul pulsat al sonicatorului dumneavoastră).
- Separarea: centrifugați lizatul (de ex. 10 min. la 10.000 x g; la 4degC). Separați cu atenție supernatantul de peletul celular. Supernatantul reprezintă lizatul celular total. După filtrarea supernatantului, obțineți un lichid clarificat al proteinei celulare solubile.
Cele mai frecvente aplicații ale ultrasonicatoarelor în biologie și biotehnologie sunt:
- Prepararea extractelor celulare
- Dezintegrarea drojdiilor, bacteriilor, celulelor vegetale, țesuturilor celulare moi sau dure, a materialului nucleic
- Extracția proteinelor
- Prepararea și izolarea enzimelor
- Producerea de antigene
- Extracția ADN și/sau fragmentarea țintită
- Prepararea lipozomilor
Dezintegrarea celulelor cu un ultrasonicator cu sondă este o metodă eficientă de pregătire a probelor.
Multiplele aplicații ale ultrasunetelor se extind în sectoarele biotehnologiei, bioingineriei, microbiologiei, biologiei moleculare, biochimiei, imunologiei, bacteriologiei, virologiei, proteomicii, geneticii, fiziologiei, biologiei celulare, hematologiei și botanicii.
Liza: distrugerea structurilor celulare
Celulele sunt protejate de o membrană plasmatică semipermeabilă, care constă dintr-un bistrat fosfolipidic (de asemenea, bistrat proteino-lipidic; format din lipide hidrofobe și molecule de fosfor hidrofile cu molecule proteice înglobate) și creează o barieră între interiorul celulei (citoplasmă) și mediul extracelular. Celulele vegetale și celulele procariote sunt înconjurate de un perete celular. Din cauza peretelui celular gros de celuloză, alcătuit din mai multe straturi, celulele vegetale sunt mai greu de lizat decât celulele animale. Interiorul celulei, cum ar fi organitele, nucleul, mitocondria, este stabilizat de citoschelet.
Prin liza celulelor se urmărește extragerea și separarea organitelor, proteinelor, ADN-ului, ARNm sau a altor biomolecule.
Metode convenționale de liză celulară și dezavantajele lor
Există mai multe metode de liză a celulelor, care pot fi împărțite în metode mecanice și chimice și care includ utilizarea detergenților sau a solvenților, aplicarea presiunii ridicate sau utilizarea unei mori cu bile ori a unei prese franceze. Cel mai problematic dezavantaj al acestor metode este dificultatea de a controla și ajusta parametrii procesului și, prin urmare, impactul.
Tabelul de mai jos prezintă principalele dezavantaje ale metodelor obișnuite de liză:
Tabel: Metodele convenționale de liză celulară prezintă dezavantaje majore
Procedura de liză
Liza este un proces sensibil. În timpul lizei, protecția membranei celulare este distrusă; cu toate acestea, inactivarea, denaturarea și degradarea proteinelor extrase de către un mediu nefiziologic (abatere de la valoarea pH-ului) trebuie prevenite. Prin urmare, în general, liza se efectuează într-o soluție tampon. Cele mai multe dificultăți provin din dezintegrarea necontrolată a celulelor, care are ca rezultat o eliberare nețintită a întregului material intracelular și/sau denaturarea produsului-țintă.
Întrebări frecvente despre sonicare și liza celulară
- Pot fi lizate celulele prin sonicare? Da, sonicarea lizează eficient celulele folosind unde ultrasonice de înaltă frecvență care induc cavitația, un fenomen în care bule minuscule de vapori se formează și colapsează violent în suspensia celulară. Forțele mecanice rezultate perturbă membranele celulare și facilitează eliberarea componentelor intracelulare în lichid.
- Cum se utilizează un sonicator pentru liza celulară? Utilizarea unui sonicator pentru liza celulară presupune imersarea sonotrodei sonicatorului într-o suspensie celulară și ajustarea unor parametri precum amplitudinea și durata impulsurilor. Procesul trebuie monitorizat îndeaproape pentru a optimiza dezintegrarea celulelor, reducând totodată la minimum denaturarea proteinelor și inactivarea enzimelor.
- Care este principiul sonicării pentru liza celulară? Sonicarea funcționează pe principiul cavitației acustice. Energia ultrasonică este transmisă în mediul lichid, provocând fluctuații rapide de presiune care duc la formarea și implozia microbulelor. Aceste implozii generează forțe de forfecare intense și temperaturi locale ridicate, perturbând structurile celulare și îmbunătățind omogenitatea lizatului.
- Cât durează sonicarea pentru liza celulară? Durata sonicării pentru liza celulară poate varia semnificativ în funcție de factori precum tipul de celule, densitatea celulară, puterea sonicatorului și protocolul specific utilizat. Procedurile tipice pot varia de la câteva secunde la câteva minute și sunt adesea efectuate în cicluri pentru a gestiona generarea de căldură și a asigura o dezintegrare uniformă a celulelor.
- Care este scopul sonicării în extracția proteinelor? În extracția proteinelor, sonicarea servește la ruperea eficientă a membranelor celulare și la solubilizarea proteinelor. Această metodă este deosebit de utilă pentru eliberarea proteinelor din compartimentele celulare, fiind esențială pentru prepararea lizatelor din care proteinele urmează să fie purificate sau analizate.
- De ce este utilizată sonicarea pentru extracție? Sonicarea este preferată pentru extracție datorită acțiunii sale rapide și capacității de a aplica energie țintită, descompunând structurile celulare pentru a elibera molecule bioactive fără utilizarea unor tratamente chimice agresive, păstrând astfel integritatea funcțională a compușilor extrași.
- Perturbă sonicarea interacțiunile proteină-proteină? Deși sonicarea poate perturba eficient membranele celulare, ea poate perturba și interacțiunile proteină-proteină. Nivelul de perturbare depinde de intensitatea sonicării și de durata expunerii, putând duce la denaturarea sau disocierea complexelor proteice, ceea ce ar putea afecta studiile analitice sau funcționale ulterioare.
- Poate fi utilizată sonicarea pentru liza E. coli? Sonicatoarele Hielscher sunt deosebit de eficiente pentru liza celulelor bacteriene precum E. coli, care au pereți celulari robuști. Tehnica oferă o metodă fizică de forfecare a peretelui și membranei celulare, fiind o metodă preferată pentru prepararea lizatelor bacteriene în laboratoarele de biologie moleculară și biochimie.
- Care sunt procesele ulterioare etapei de sonicare?
Etapele ulterioare lizei cu ultrasunete includ de obicei fracționarea lizatului, izolarea țintită a organitelor și extracția sau purificarea suplimentară a proteinelor.
Lizatul procesat este apoi separat și pregătit pentru aplicații analitice sau funcționale, cum ar fi proteomica de înaltă rezoluție, transcriptomica sau studiile de legare la receptori.
Literatură/Referințe
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.