Sonicare pentru liză: Întreruperea celulelor și extracție

Dezintegrarea celulară sau liza este o parte obișnuită a pregătirii zilnice a probelor în laboratoarele de biotehnologie. Scopul lizei este de a perturba părți ale peretelui celular sau ale celulei complete pentru a elibera molecule biologice. Omogenizatoare cu ultrasunete sunt utilizate pe scară largă pentru liza celulară de succes. Avantajul major al ultrasonicators sofisticate este controlul precis asupra parametrilor de proces, cum ar fi intensitatea și temperatura, care permite o perturbare ușoară, dar extrem de eficientă a celulelor și extracție.

Liză celulară folosind ultrasunete

Liza și extracția celulelor cu ultrasunete este o metodă utilizată pentru a sparge celulele deschise și a extrage conținutul folosind undele sonore de înaltă frecvență, adică ultrasunetele. Sonicare este o tehnică de liză, care este utilizat pe scară largă ca o metodă stabilită și fiabilă de întrerupere celulară și extracția materialului intracelular. Liza cu ultrasunete este o tehnică fiabilă pentru a pregăti c lizat care conține, de exemplu, plasmidă, teste receptorilor, proteine, ADN, ARN etc. Deoarece intensitatea cu ultrasunete poate fi nivelată prin ajustarea parametrilor de proces, intensitatea optimă sonicare de la foarte moale la intens poate fi setată individual pentru fiecare substanță și mediu pentru a îndeplini cerințele specifice de aplicare. Următorii pași ai lizei sunt fracționarea, izolarea organellelor sau/și extracția și purificarea proteinelor. Materialul extras (= lizat) trebuie separat și face obiectul unor investigații sau aplicații suplimentare, de exemplu pentru cercetarea proteomică.

În comparație cu alte metode de liza celulară și extracție, liza celulară cu ultrasunete are mai multe avantaje:

1. Viteză: Liza celulară cu ultrasunete și extracția este o metodă rapidă care poate rupe celulele deschise într-o chestiune de secunde. Acest lucru este mult mai rapid decât alte metode, cum ar fi omogenizarea, congelare-decongelare sau ciubuc-frezare.
2. Eficienţă: Liza și extracția celulelor cu ultrasunete pot fi utilizate pentru a trata probe mici, mari sau multiple simultan, ceea ce îl face mai eficient decât alte metode care necesită prelucrarea individuală a probelor mici.
3. Fără substanțe chimice: Liza și extracția celulelor cu ultrasunete este o metodă non-invazivă care nu necesită utilizarea de substanțe chimice sau enzime dure. Acest lucru îl face ideal pentru aplicațiile în care integritatea conținutului celulei trebuie menținută. Contaminarea nedorită a probelor poate fi evitată.
4. Randament ridicat: Liza și extracția celulelor cu ultrasunete pot extrage un randament ridicat al conținutului celular, inclusiv ADN, ARN și proteine. Acest lucru se datorează faptului că undele sonore de înaltă frecvență sparg pereții celulelor și eliberează conținutul în soluția înconjurătoare.
5. Controlul temperaturii: Ultrasonciatorii sofisticați permit un control precis al temperaturii probei. Hielscher cu ultrasunete digitale sunt echipate cu un senzor de temperatură pluggable și software-ul de monitorizare a temperaturii.
6. Reproductibile: Protocoalele pentru liza celulară cu ultrasunete pot fi reproduse cu ușurință și chiar potrivite cu diferite volume de probă mai mari sau mai mici printr-o simplă scară liniară-up.
7. Versatil: Liza și extracția celulelor cu ultrasunete pot fi utilizate pentru a extrage o gamă largă de tipuri de celule, inclusiv bacterii, drojdie, ciuperci, celule vegetale și mamifere. Acesta poate fi, de asemenea, utilizat pentru a extrage diferite tipuri de molecule, inclusiv proteine, ADN-ul, ARN,și lipide.
8. Pregătirea simultană a numeroase probe: Hielscher Ultrasonics oferă mai multe soluții pentru a procesa confortabil numeroase probe în exact aceleași condiții de proces. Acest lucru face ca etapa de pregătire a probei de liza și extracție să fie extrem de eficientă și de economisire a timpului.
9. Ușor de utilizat: Liza celulară cu ultrasunete și echipamente de extracție este ușor de utilizat și necesită o pregătire minimă. Echipamentul este, de asemenea, economic, deoarece este o singură investiție, fără a fi necesară re-achiziționarea de cesiuni. Acest lucru îl face atractiv pentru o gamă largă de cercetători și laboratoare.

În general, liza și extracția celulelor cu ultrasunete este o metodă rapidă, eficientă, controlabilă cu precizie și versatilă pentru extragerea conținutului celular. Avantajele sale față de metodele alternative îl fac o alegere atractivă pentru o gamă largă de aplicații de cercetare și industriale.

Principiul de lucru al liza celulelor cu ultrasunete

Liza celulară cu ultrasunete și extracția utilizează undele sonore de înaltă frecvență pentru a perturba celulele și a extrage conținutul lor. Undele sonore creează schimbări de presiune în lichidul înconjurător, determinând formarea bulelor mici și colapsul într-un proces cunoscut sub numele de cavitație. Aceste bule generează forțe mecanice localizate extrem de intense care pot rupe celulele deschise și pot elibera conținutul lor în soluția înconjurătoare.

Liza celulară folosind un ultrasonicator implică frecvent următorii pași:

• Proba este plasată într-un tub sau recipient cu un tampon lichid.
• O sondă cu ultrasunete este introdusă în probă și se aplică unde sonore de înaltă frecvență cu aproximativ 20-30 kHz.
• Undele cu ultrasunete provoacă oscilații și cavitație în lichidul înconjurător, generând forțe localizate care sparg celulele deschise și eliberează conținutul lor.
• Proba este centrifugată sau filtrată pentru a îndepărta resturile celulare, iar conținutul extras este colectat pentru analiza în aval.

Undele cu ultrasunete puternice perturbă matricea celulară a structurilor biologice și eliberează compușii bioactivi. Se intensifică transferul de masă între materialul vegetal și solvent (de exemplu, tampon). (grafic: ©Vilkhu et al., 2006)

Dezavantajele metodelor comune de liză

În timpul activității dumneavoastră în laboratoare, este posibil să fi experimentat deja hassle de liză celulară folosind protocoale tradiționale de liză mecanică sau chimică.

• Liză mecanică: Metodele de liză mecanică, cum ar fi măcinarea cu mortar și pistil sau omogenizarea folosind o presă franceză, o moară de mărgele sau un sistem rotor-stator nu dispun adesea de opțiuni de control și ajustare a perimilor. Aceasta înseamnă că utilizarea măcinării și măcinării poate genera rapid forțe de căldură și forfecare care pot deteriora eșantionul și denatura proteinele. Ele pot fi, de asemenea, consumatoare de timp și necesită cantități mari de material de bază.
• Liză chimică: Metodele de liză chimică, cum ar fi liza pe bază de detergent, pot deteriora proba prin perturbarea bilayerului lipidic și denaturarea proteinelor. De asemenea, acestea pot necesita mai multe etape și pot lăsa contaminanți reziduali care interferează cu aplicațiile din aval. Găsirea dozei optime de detergent este o provocare suplimentară.
• Cicluri de congelare-dezghețare: Ciclurile de congelare-dezgheț pot provoca ruperea membranelor celulare, dar ciclurile repetate pot provoca, de asemenea, denaturarea și degradarea proteinelor. Această metodă poate necesita, de asemenea, mai multe cicluri, care pot fi consumatoare de timp și de multe ori duce la randamente mai mici.
• Liză enzimatică: Metodele de liză enzimatică pot fi specifice anumitor tipuri de celule și necesită mai mulți pași, ceea ce le face consumatoare de timp. De asemenea, acestea generează deșeuri și necesită o optimizare atentă pentru a evita degradarea probei. Kiturile de liză enzimatică sunt adesea scumpe. În cazul în care procedura actuală de liză enzimatică dă rezultate insuficiente, Sonicare ca metodă sinergică pot fi aplicate pentru a intensifica întreruperea celulelor.

Spre deosebire de metodele convenționale mecanice și chimice de liză celulară, Sonicare este un instrument foarte eficient și fiabil pentru dezintegrarea celulelor, care permite un control complet asupra parametrilor sonicare. Acest lucru asigură o selectivitate ridicată în ceea ce privește eliberarea materialelor și puritatea produsului. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Este potrivit pentru toate tipurile de celule și ușor de aplicat la scară mică și mare – întotdeauna în condiții controlate. Ultrasonicators sunt ușor de curățat. Un omogenizator cu ultrasunete are întotdeauna clean-in-place (CIP) și steriliza-in-loc (SIP) funcția. Sonotrodul constă într-un corn masiv de titan care poate fi șters sau spălat în apă sau solvent (în funcție de mediul de lucru). Întreținerea ultrasonicators se datorează robusteții lor aproape neglijabile.

Liză cu ultrasunete și întreruperea celulelor

În general, lizia probelor din laborator va dura între 15 secunde și 2 minute. Deoarece intensitatea sonicării este foarte ușor de reglat prin stabilirea amplitudinii timpului de sonicare, precum și prin alegerea echipamentului potrivit, este posibilă perturbarea foarte ușoară sau foarte bruscă a membranelor celulare, în funcție de structura celulară și de scopul lizării ( de exemplu, extracția ADN necesită sonicare mai moale, extracția completă a proteinelor de bacterii necesită un tratament cu ultrasunete mai intens). Temperatura în timpul procesului poate fi monitorizată de un senzor de temperatură integrat și poate fi ușor controlată prin răcire (baie de gheață sau celule de curgere cu jachete de răcire) sau prin sonicare în modul pulsatoriu. În timpul sonicării în modul puls, ciclurile rapide de spargere cu sonicare de 1-15 secunde permit disiparea și răcirea căldurii în perioadele intermitente mai lungi.
Toate procesele bazate pe ultrasunete sunt complet reproductibilă și liniar scalabile.

Omogenizatoare cu ultrasunete pentru liza de celule și extracție

Diferite tipuri de dispozitive cu ultrasunete permit potrivirea obiectivului de pregătire a probei și pentru a asigura ușurința în utilizare și confortul de funcționare. Ultrasonicators de tip sondă sunt cele mai comune dispozitive în laborator. Acestea sunt cele mai potrivite pentru prepararea probelor mici și mijlocii cu volume de 0,1 ml până la 1000 ml. Diferite dimensiuni de putere și sonotrodes permite să se adapteze ultrasonicator la volumul eșantionului și vasul pentru cele mai eficiente și eficiente rezultate sonicating. Dispozitivul de sondă cu ultrasunete este cea mai bună alegere atunci când trebuie pregătite probe unice.

În cazul în care mai multe probe trebuie să fie pregătite, de exemplu, 8-10 flacoane de soluție celulară, o sonicare indirectă intensă cu sisteme cu ultrasunete, cum ar fi VialTweeter sau un cufor cu ultrasunete sunt cea mai potrivită metodă de omogenizare pentru o liză eficientă. Mai multe flacoane sunt sonicate în același timp, la aceeași intensitate. Acest lucru economisește nu numai timp, ci asigură și același tratament al tuturor probelor, ceea ce face ca rezultatele dintre probe să fie fiabile și comparabile. În plus, în timpul sonicare indirectă contaminare încrucișată prin scufundarea sonotrode cu ultrasunete (de asemenea, cunoscut sub numele de sondă cu ultrasunete, corn, vârf, sau deget) este evitată. Deoarece se utilizează în mod individual pentru a eșantionului se potrivesc flacoane, curățarea consumatoare de timp și pierderea probei din cauza decantării vaselor sunt omise. Pentru sonicarea uniformă a plăcilor multiwell sau microtiter, Hielscher oferă UIP400MTP.
Pentru volume mai mari, de ex pentru producția comercială de extracte de celule, sisteme cu ultrasunete continue cu un reactor cu flux de celule sunt cele mai potrivite. Fluxul continuu și chiar a materialului prelucrat asigură un tratament cu ultrasunete chiar. Toți parametrii procesului de dezintegrare cu ultrasunete poate fi optimizat și adaptat la cerințele aplicației și materialul specific celulei.
 
 
Procedura de exemplara lizare cu ultrasunete a celulelor bacteriene:

• Prepararea suspensiei de celule: celule peleți trebuie să fie complet suspendat într-o soluție tampon de omogenizare (alege soluția tampon compatibilă cu următoarea analiză, de exemplu, metoda cromatografică specifică). Adăugați lizozime și / sau alți aditivi, dacă este necesar (acestea trebuie să fie compatibile cu mijloace de separare / purificare). Se amestecă / omogeniza ușor soluția sub sonicare ușoară până la obținerea unei suspensii completă.
• liza cu ultrasunete: Se pune proba într-o baie de gheață. Pentru distrugere celulară, sonicat suspensia la 60-90 exploziile secunde (folosind modul de pulsul ultrasonicator dvs.).
• (. De exemplu, 10 min la 10000 x g la 4degC): Separarea Centrifuga lizat. Se separă supernatantul din peletul de celule cu atenție. Supernatantul este celula lizată totală. După filtrarea supernatantului, se obtine un lichid clarificat al proteinei celulare solubile.

 
 
Cele mai comune aplicatii pentru ultrasonicators in biologie si biotehnologie sunt:

• preparare extract celular
• Perturbarea drojdiei, bacteriilor, celulelor vegetale, țesutului celular moale sau dur, materialului nucleic
• extracție de proteine
• Prepararea și izolarea enzimelor
• Producerea de antigeni
• extracția ADN-ului și / sau fragmentare vizate
• preparare lipozom