Aplicații ale ultrasunetelor pentru virusul variolei maimuței

Sonicarea este o metodă importantă de procesare pentru izolarea virusului variolei maimuței (MPXV) din probe analitice, pentru fragmentarea ADN-ului viral, precum și pentru fabricarea vaccinurilor împotriva variolei maimuței. Pentru pregătirea probelor înainte de diagnosticare și analiză (PCR, ELISA etc.), sonicarea este utilizată pentru lizarea celulelor în vederea eliberării virusului variolei maimuței din interiorul celulelor și / sau a fragmentării ADN-ului. În producția de vaccinuri, aplicațiile cuprind pregătirea particulelor virale / ADN-ului, încapsularea în transportori de medicamente și formularea inoculurilor.
Mai jos puteți găsi informații detaliate despre pregătirea cu ultrasunete a probelor cu virusul variolei maimuței, precum și despre producția de vaccinuri împotriva MPXV asistată de ultrasunete.

Ce veți găsi pe această pagină:

• Liză cu ultrasunete pentru extragerea virusului variolei maimuței
• Fragmentarea cu ultrasunete a ADN-ului virusului variolei maimuței
• Aplicații ale ultrasunetelor în producția vaccinurilor împotriva MPXV

Liză cu ultrasunete și fragmentarea ADN-ului înainte de reacția de polimerizare în lanț (PCR)

O infecție cu virusul variolei maimuței este detectată prin testarea amplificării acizilor nucleici (NAAT), folosind reacția de polimerizare în lanț (PCR) în timp real sau convențională, pentru detectarea secvențelor unice de ADN viral. Proba (de exemplu, dintr-un exsudat nazofaringian sau din biopsii cutanate) conține virusul în celule.
Pentru analiză, virusul trebuie eliberat din celule, iar ADN-ul viral trebuie fragmentat pentru PCR.

Liză cu ultrasunete:

Dezintegrarea celulelor / liza cu ultrasunete este o metodă fiabilă și eficientă pentru izolarea virusurilor din probe celulare și, prin urmare, o tehnică preferabilă utilizării agenților chimici, precum lizozimul, proteinaza K și diferiți detergenți, care sunt utilizați alternativ pentru a realiza liza celulară și eliberarea ADN-ului.
Totuși, utilizarea unor astfel de reactivi chimici necesită o pregătire a probelor în mai multe etape, care consumă mult timp, înainte de analiza PCR, pentru a preveni inhibarea reacției PCR. Deoarece inhibitorii PCR afectează eficiența amplificării, variațiile mici ale cantității de inhibitori care nu sunt eliminați pot duce la variații mari ale amplificării produsului PCR (Diaco, 1995).
Avantajul sonicării pentru liză constă în faptul că dezintegrarea completă a structurilor celulare și eliberarea ADN-ului fără necesitatea reactivilor de liză și a pregătirii probelor care consumă mult timp sunt de dorit. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete:

Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este simplă și fiabilă, deoarece produce fragmente de ADN cu lungime ajustabilă (perechi de baze, bp). Cu ajutorul ultrasunetelor, ADN-ul poate fi fragmentat eficient până la lungimea vizată. Controlul precis al parametrilor ultrasonici și opțiunile sofisticate de răcire previn degradarea ADN-ului.
Citiți mai multe despre fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete!

Aplicații ale ultrasunetelor pentru vaccinul împotriva virusului variolei maimuței

Vaccinurile utilizate împotriva virusului variolei maimuței sunt în prezent vaccinuri cu virus viu. Vaccinurile nou dezvoltate ar putea utiliza alte platforme, precum cele bazate pe ADN… În prezent conține un virus Vaccinia Ankara modificat, un ortopoxvirus atenuat, care nu se replică. Conține, de asemenea, Tris (tris-aminometan) și clorură de sodiu. Vaccinul poate conține și cantități mici de ADN și proteine provenite din celulele fibroblastice de embrion de găină, care sunt utilizate pentru cultivarea virusului vaccinal, benzonază și compuși antibiotici precum gentamicina și ciprofloxacina.

Omogenizarea cu ultrasunete este utilizată în producția vaccinurilor cu virus viu atenuat, vaccinurilor ADN, cocktailurilor ADN multivalente, vaccinurilor ARNm, vaccinurilor cu proteine recombinante, vaccinurilor cu particule asemănătoare virusurilor etc.

Puteți găsi informații mai aprofundate despre aplicațiile ultrasunetelor pentru îmbunătățirea fabricării vaccinurilor!

Protocol pentru izolarea cu ultrasunete a virusului variolei maimuței

Echipa de cercetare a lui Stittelaar (2005) a utilizat liza cu ultrasunete pentru a elibera virusul variolei maimuței din cultura de celule gazdă utilizată pentru cultivare, precum și din celulele obținute prin recoltarea de exsudate faringiene de la primate infectate.

Pregătirea vaccinului împotriva variolei maimuței:

Virusurile variolei maimuței au fost cultivate pe celule fibroblaste embrionare de pui fără agenți patogeni. După incubarea timp de 1 până la 2 zile, suspensia de celule virale a fost recoltată printr-o rundă de congelare-dezghețare și apoi concentrată prin centrifugare. Peleta a fost resuspendată și supusă mai multor runde de omogenizare cu ultrasunete.

Izolarea virusului variolei maimuței de la macaci vaccinați:

Probele au fost înghețate-dezghețate de trei ori și sonicated într-un CupHorn cu ultrasunete. Două diluții (1:10 și 1:100) în mediu de transport suplimentate cu 1% ser fetal bovin au fost utilizate pentru a inocula monostraturi de celule Vero în plăci cu șase godeuri. După 1 oră de incubare la 37°C, inoculele au fost îndepărtate și înlocuite cu un mediu de cultură suplimentat cu 1% ser fetal bovin. Monostraturile au fost cultivate timp de 5 zile la 37°C și colorate cu o soluție cristalină.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Sonicatoare pentru analiza virusurilor și producția de vaccinuri

Portofoliul larg de produse Hielscher Ultrasonics oferă sonicatorul ideal pentru laboratoarele de cercetare și analiză, precum și pentru fabricarea industrială a vaccinurilor.
Hielscher Ultrasonics este specializată în proiectarea, fabricarea și distribuția sonicatoarelor și a sonobioreactoarelor de înaltă performanță pentru utilizarea în laboratoarele de cercetare și analiză, precum și pentru implementarea în producția industrială de vaccinuri (de exemplu, vaccinuri, substanțe farmaceutice active).
Sonicarea poate fi aplicată în vase deschise, reactoare închise cu agitare continuă și reactoare cu flux continuu. Toate componentele sistemelor cu ultrasunete care intră în contact cu mediul lichid sunt fabricate din oțel inoxidabil, titan sau sticlă. Componentele autoclavabile și racordurile igienice asigură producția în condiții conforme cerințelor farmaceutice.
Înregistrarea automată a datelor: Software-ul inteligent înregistrează automat parametrii procesului de sonicare pe cardul de memorie SD integrat. Controlul precis al tuturor parametrilor procesului asigură reproductibilitatea, standardizarea producțieiși facilitează respectarea standardelor de siguranță pentru produsele farmaceutice.
Procesoarele cu ultrasunete Hielscher Ultrasonics sunt extrem de fiabile și pot fi controlate cu precizie. Toate sonicatoarele industriale pot fi reglate pentru a furniza întreaga gamă de amplitudini, de la amplitudini mai mici până la amplitudini foarte mari. Robustețea sistemelor cu ultrasunete Hielscher permite funcționarea 24/7 în regim intens și în medii solicitante.

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a sonicatoarelor noastre: