Aplicații cu ultrasunete în virusul variolei maimuței

Ultrasonication este o metodă importantă de procesare pentru izolarea virusului variolei maimuței (MPXV) din probele analitice, pentru fragmentarea ADN-ului virusului, precum și în fabricarea vaccinului împotriva variolei maimuței. Pentru pregătirea probei înainte de diagnosticare și analiză (PCR, ELISA etc.) ultrasonication este utilizat pentru a liza celulele, în scopul de a elibera virusul variolei maimuței din interiorul celulei și / sau pentru a fragmenta ADN-ul. În producția de vaccinuri, aplicațiile variază de la prepararea particulelor / ADN-ului virusului, încapsularea în purtătorii de medicamente și formularea inoculului.
Mai jos puteți găsi informații detaliate despre pregătirea probei virusului cu ultrasunete variola maimuței, precum și producția de vaccin MPXV asistată ultrasonically.

Ce veți găsi pe această pagină:

• Liza cu ultrasunete pentru extracția virusului variolei maimuței
• Fragmentarea cu ultrasunete a ADN-ului virusului variolei maimuței
• Aplicații cu ultrasunete în producția de vaccinuri MPXV

Liza cu ultrasunete și fragmentarea ADN-ului înainte de reacția în lanț a polimerazei (PCR)

O infecție cu virusul variolei maimuței este detectată prin testarea amplificării acidului nucleic (NAAT), utilizând reacția în lanț a polimerazei convenționale (PCR) în timp real, pentru detectarea secvențelor unice de ADN viral. Proba (de exemplu, din swap nazofaringian sau biopsii cutanate) conține virusul în celule.
Pentru analiză, virusul trebuie eliberat din celule, iar ADN-ul viral trebuie fragmentat pentru PCR.

Liza cu ultrasunete:

Întreruperea / liza celulelor cu ultrasunete este o metodă fiabilă și eficientă de izolare a virușilor din probele de celule și, prin urmare, o tehnică preferabilă față de agenții chimici, ar fi lizozima, proteinaza K și diferiți detergenți care sunt utilizați alternativ pentru a realiza liza celulară și eliberarea ADN-ului.
Cu toate acestea, utilizarea unor astfel de reactivi chimici necesită pregătirea probei consumatoare de timp în mai multe etape înainte de analiza PCR pentru a preveni inhibarea reacției PCR. Deoarece inhibitorii PCR afectează eficiența amplificării, variațiile mici ale cantității de inhibitori care nu sunt îndepărtați pot duce la variații mari în amplificarea produsului PCR (Diaco, 1995).
Avantajul ultrasonication pentru liză este că întreruperea completă a structurilor celulare și eliberarea ADN-ului fără a fi nevoie de reactivi de liză și pregătirea probei consumatoare de timp sunt de dorit. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete:

Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este simplă și fiabilă, deoarece produce fragmente de ADN reglabile în lungime (perechi de baze, bp). Folosind ultrasunete, ADN-ul poate fi fragmentat în mod eficient la lungimea ADN-ului vizat. Controlul precis asupra parametrilor ultrasonici și opțiunile sofisticate de răcire previn degradarea ADN-ului.
Citiți mai multe despre fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete!

Aplicații cu ultrasunete în vaccinul împotriva virusului variolei maimuței

Vaccinurile utilizate împotriva virusului variolei maimuței sunt în prezent vaccinuri cu virus viu. Vaccinurile nou dezvoltate ar putea utiliza alte platforme, cum ar fi cele bazate pe ADN În prezent, conține un Vaccinia Ankara viurs modificat, un orthopoxvirus atenuat, nereplicator. De asemenea, conține Tris (tris-aminometan) și clorură de sodiu. Vaccinul poate conține, de asemenea, cantități mici de ADN și proteine din celulele fibroblaste embrionare de pui, care sunt utilizate pentru a crește virusul vaccinului, benzonaza și compușii antibiotice, cum ar fi gentamicina și ciprofloxacina.

Omogenizarea cu ultrasunete este utilizată în producția de vaccinuri cu virus viu atenuat, vaccinuri ADN, cocktailuri ADN multivalente, vaccinuri ARNm, vaccinuri proteice recombinante, vaccinuri cu particule asemănătoare virusului etc.

Puteți găsi informații mai aprofundate despre aplicațiile cu ultrasunete pentru îmbunătățirea fabricării vaccinului!

Protocol pentru izolarea cu ultrasunete a virusului variolei maimuței

Echipa de cercetare a Stittelaar (2005) a folosit liza cu ultrasunete pentru a elibera virusul variolei maimuței din cultura celulară gazdă de creștere, precum și din celulele obținute prin schimburi de gât de la primate infectate.

Pregătirea vaccinului împotriva variolei maimuței:

Virusurile variolei maimuței au fost cultivate pe celule fibroblaste embrionare de pui fără agenți patogeni. După incubarea timp de 1 până la 2 zile, suspensia de celule virale a fost recoltată printr-o rundă de congelare-dezghețare și apoi concentrată prin centrifugare. Peleta a fost resuspendată și supusă mai multor runde de omogenizare cu ultrasunete.

Izolarea virusului variolei maimuței de la macaci vaccinați:

Probele au fost înghețate-dezghețate de trei ori și sonicated într-un CupHorn cu ultrasunete. Două diluții (1:10 și 1:100) în mediu de transport suplimentate cu 1% ser fetal bovin au fost utilizate pentru a inocula monostraturi de celule Vero în plăci cu șase godeuri. După 1 oră de incubare la 37°C, inoculele au fost îndepărtate și înlocuite cu un mediu de cultură suplimentat cu 1% ser fetal bovin. Monostraturile au fost cultivate timp de 5 zile la 37°C și colorate cu o soluție cristalină.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Ultrasonicators pentru analiza virusului și producția de vaccinuri

Hielscher Ultrasonics portofoliu larg de produse oferă ultrasonicator ideal pentru laboratoare de cercetare și analitice, precum și pentru fabricarea de vaccinuri industriale.
Hielscher Ultrasonics este specializată în proiectarea, fabricarea și distribuția ultrasonicators de înaltă performanță și sono-bioreactoare pentru utilizarea în laboratoarele de cercetare și analitice, precum și pentru punerea în aplicare în producția industrială de vaccinuri (de exemplu. Vaccinuri, Api).
Sonicare poate fi aplicată vaselor deschise, reactoare închise cu agitare continuă și reactoare cu flux continuu. Toate părțile sistemelor cu ultrasunete, care intră în contact cu mediul lichid, sunt fabricate din oțel inoxidabil, titan, sau sticlă. Piesele autoclavabile și armăturile sanitare asigură producția sub Condiții de calitate farmaceutică.
Înregistrare automată a datelor: Software-ul inteligent înregistrează automat parametrii procesului de sonicare pe cardul de memorie SD integrat. Controlul precis al tuturor parametrilor procesului asigură Reproductibilitate, Standardizarea producțieiși facilitează îndeplinirea standardelor de siguranță a produselor farmaceutice.
Hielscher Ultrasonics’ Procesoarele cu ultrasunete sunt extrem de fiabile și pot fi controlate cu precizie. Toate ultrasonicators industriale pot fi ajustate pentru a furniza întreaga gamă de la amplitudini mai mici la foarte mari. Robustețea sistemelor cu ultrasunete Hielscher permite funcționarea 24/7 în condiții grele și în medii solicitante.

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a ultrasonicators noastre: