Preparação de amostras de alto rendimento para diagnósticos mitocondriais
O diagnóstico mitocondrial na investigação e na clínica é efectuado utilizando várias técnicas, como a sequenciação, a PCR e os ensaios bioquímicos. Estes métodos são utilizados para identificar mutações no ADN e medir a função mitocondrial. A sequenciação ajuda a detetar mutações genéticas, enquanto a PCR pode quantificar sequências de ADN específicas. Os ensaios bioquímicos avaliam a funcionalidade das proteínas e enzimas mitocondriais.
O diagnóstico das doenças mitocondriais é especialmente difícil devido à acentuada variabilidade clínica destas doenças, bem como devido à complexa interação entre dois genomas herdados de forma diferente: o ADN mitocondrial (ADNmt) e o genoma nuclear.
Extração e fragmentação de ADN por sonicação
A extração de ADN do tecido muscular é particularmente útil quando se suspeita de alterações do ADNmt específicas do tecido. Estas alterações podem incluir deleções do mtDNA na oftalmoplegia externa progressiva crónica (CPEO), mutações pontuais do mtDNA nas miopatias mitocondriais ou depleção do mtDNA na síndrome de Alpers. O ADN extraído do tecido muscular pode então ser utilizado para vários testes genéticos, tais como Southern blot e PCR de longo alcance para deleções, PCR em tempo real para depleção ou sequenciação para mutações pontuais.
A sonicação, que utiliza ondas de ultra-sons intensas, é utilizada para várias aplicações no diagnóstico mitocondrial. É utilizada para lisar células para extrair conteúdos intracelulares, como mitocôndrias e ADN, para cisalhar ADN, como o ADNmt e o ADNn, para sequenciação, e para homogeneizar amostras.
Sonicador de placas UIP400MTP para preparação de amostras com elevado rendimento sonicar uniformemente amostras em placas de múltiplos poços e de 96 poços
Como isolar mitocôndrias de células e tecidos
O isolamento mitocondrial compreende duas etapas essenciais: a rutura das células para libertar o seu conteúdo e a utilização de centrifugação diferencial para separar e recuperar as fracções mitocondriais.
Sonicação
Os sonicadores Hielscher são compatíveis com os tampões e kits de lise padrão, tornando-os adequados para o isolamento de mitocôndrias. A sonicação tem dois objectivos principais:
- Lise celular: As ondas ultra-sónicas rompem as membranas celulares, libertando o conteúdo intracelular.
- Perturbação mitocondrial: A sonicação numa fase subsequente pode abrir as mitocôndrias para libertar proteínas mitocondriais ou ADN mitocondrial.
- Fragmentação do mtDNA: A sonicação é uma técnica fiável para cisalhar o ADN mitocondrial para sequenciação.
O sonicador de placas de múltiplos poços UIP400MTP permite a preparação de amostras de mitocôndrias com elevado rendimento. Em conjunto com a centrifugação diferencial, a sonicação aumenta a eficiência do isolamento das mitocôndrias, assegurando elevados rendimentos de mitocôndrias intactas adequadas para várias aplicações a jusante.
Sonicador de placas multipoços Hielscher UIP400MTP funciona com qualquer placa padrão
O sonicador de placas multipoços UIP400MTP oferece inúmeras vantagens para a preparação de amostras de alto rendimento, por exemplo, no diagnóstico mitocondrial.
Sonicador de placas multipoços UIP400MTP para preparação de amostras de elevado rendimento no diagnóstico de biomarcadores.
Instruções exemplificativas para a fragmentação ultra-sónica do mtDNA
Preparação e extração:
- Os ratinhos C57BL/6 foram mortos por deslocação cervical.
- Os fígados foram rapidamente extraídos e lavados em PBS estéril gelado.
Isolamento de mitocôndrias:
- As mitocôndrias foram isoladas utilizando um triturador de tecidos Dounce de 2 ml e um Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Centrifugação inicial a 700× g e 3.000× g.
- Efetuar duas lavagens adicionais com tampão C.
Isolamento de ADN:
- O sedimento da primeira centrifugação a 700 × g foi utilizado para isolar o ADN nuclear (nDNA).
- O ADN foi isolado utilizando colunas de centrifugação.
- O ADN mitocondrial (ADNmt) foi extraído de mitocôndrias isoladas.
- O ADN nuclear (nDNA) foi extraído de extractos nucleares brutos, ambos de tecido hepático de rato.
Fragmentação do ADN:
- O ADN foi fragmentado no gelo utilizando um sonicador ultrassónico UP50H de 30 kHz/50 W com um sonotrodo de microponta de 0,5 mm a 14 μm durante 2 × 30 segundos.
Visualização e quantificação de fragmentação:
- A fragmentação após a ultra-sonificação foi visualizada num gel de agarose a 1% com o corante de ADN seguro SYBR.
- A abundância relativa de mtDNA e nDNA foi determinada por qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Para a preparação de amostras de alto rendimento, o sonicador de placas multipoços UIP400MTP facilita a preparação de grandes quantidades de amostras em placas padrão de 96 poços, multipoços e microtitulação.
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Conselhos para um isolamento ótimo das mitocôndrias utilizando a sonicação:
- Controlo da temperatura: Conduzir todos os passos a uma temperatura entre 0°C e 4°C. Isto é fundamental para manter a integridade e a funcionalidade das mitocôndrias.
- Eficiência e rapidez: Trabalhe rapidamente e purifique as mitocôndrias apenas na medida necessária para a sua aplicação específica. Uma manipulação excessiva pode levar a perdas significativas do conteúdo mitocondrial.
- Diluição de suspensões: Manter baixas concentrações de suspensões de células e organelos durante todo o processo de isolamento. Isto ajuda a minimizar os riscos de aprisionamento e aglutinação, melhorando assim a pureza das mitocôndrias isoladas.
- Volume da amostra: Optar por várias preparações em pequena escala em vez de uma única grande. Esta abordagem resulta normalmente em melhores rendimentos, uma vez que o aumento de escala não aumenta proporcionalmente a quantidade de mitocôndrias recuperáveis. O sonicador de placas multipoços UIP400MTP facilita a lise rápida e fiável das células para o isolamento de mitocôndrias, bem como a extração de proteínas das mitocôndrias.
Estas orientações tornarão o processo de isolamento por lise ultra-sónica e centrifugação mais eficiente, produzindo preparações mitocondriais de alta qualidade adequadas para aplicações a jusante.
Sonicadores Hielscher – Qualidade fabricada na Alemanha
Os ultrassons Hielscher são conhecidos pelos seus elevados padrões de qualidade e design. A robustez e a facilidade de operação permitem a integração harmoniosa dos nossos ultrassons nas instalações industriais. As condições difíceis e os ambientes exigentes são facilmente controlados pelos ultrassons Hielscher.
A Hielscher Ultrasonics é uma empresa certificada pela ISO e dá especial ênfase aos ultrassons de alto desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os ultrassons da Hielscher estão em conformidade com a CE e cumprem os requisitos da UL, CSA e RoHs.
Sonicador de placas de 96 poços UIP400MTP para a sonicação de placas de microtitulação e multipoços
Literatura / Referências
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Perguntas frequentes sobre mitocôndrias e diagnóstico mitocondrial
O que são as mitocôndrias?
As mitocôndrias são organelos ligados à membrana que se encontram nas células da maioria dos organismos eucariotas. São conhecidas como as centrais eléctricas da célula porque produzem energia sob a forma de trifosfato de adenosina (ATP) através do processo de respiração celular. Além disso, as mitocôndrias têm o seu próprio ADN e desempenham papéis fundamentais noutros processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular e a morte celular.
O que diferencia o ADNmt do ADN genómico?
O ADN mitocondrial (ADNmt) difere do ADN genómico (ADNg) em vários aspectos fundamentais. O DNAmt está localizado na mitocôndria, é circular e é herdado da mãe, enquanto o DNAg está localizado no núcleo da célula, é linear e é herdado de ambos os pais. O MtDNA é muito mais pequeno, codificando apenas 37 genes, enquanto o gDNA contém cerca de 20.000-25.000 genes. O MtDNA está presente em várias cópias por célula, tem uma taxa de mutação mais elevada e codifica principalmente proteínas envolvidas na função mitocondrial. Em contraste, o gDNA é tipicamente diploide, tem uma taxa de mutação mais baixa e codifica uma vasta gama de genes necessários para o desenvolvimento e função do organismo. Além disso, a transcrição e a tradução do mtDNA ocorrem dentro da mitocôndria, enquanto a transcrição do gDNA ocorre no núcleo e a tradução ocorre no citoplasma. Estas diferenças reflectem os seus papéis distintos e as suas origens evolutivas.
O que é o Extrato sem Células?
Um extrato isento de células é uma solução que contém o conteúdo de células lisadas, incluindo proteínas, ácidos nucleicos e outros componentes celulares, mas sem membranas celulares intactas. Este extrato é utilizado na investigação bioquímica e de biologia molecular para estudar processos celulares in vitro, permitindo aos investigadores analisar reacções e mecanismos fora das células vivas.
Qual é o papel dos testes PCR no diagnóstico mitocondrial?
Os testes PCR desempenham um papel fundamental no diagnóstico mitocondrial, permitindo a deteção de mutações, deleções ou variações do número de cópias no ADN mitocondrial (ADNmt). Permitem a amplificação de regiões específicas do mtDNA para identificar variantes patogénicas associadas a doenças mitocondriais. As técnicas baseadas na PCR, como a PCR quantitativa (qPCR) e a PCR de longo alcance, são também utilizadas para avaliar a integridade do ADNmt, os níveis de heteroplasmia e a depleção de ADNmt, fornecendo informações essenciais sobre a função e a doença mitocondriais.
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O que é a centrifugação diferencial?
A centrifugação diferencial é uma técnica amplamente utilizada para o fracionamento de células e o isolamento de mitocôndrias. Este método separa as estruturas celulares com base no seu coeficiente de sedimentação, que depende tanto da densidade como da forma. O processo envolve a aplicação de níveis variáveis de força centrífuga a amostras em soluções salinas tamponadas com densidades específicas. As estruturas com coeficientes de sedimentação semelhantes depositar-se-ão no fundo do tubo de recolha ao mesmo tempo, permitindo a sua recuperação.
Como é que a centrifugação diferencial é utilizada para o isolamento de mitocôndrias?
A centrifugação diferencial permite aos investigadores separar eficazmente as fracções mitocondriais de outros componentes celulares. O isolamento de mitocôndrias envolve várias etapas de centrifugação e a subsequente recuperação do isolado.
Centrifugação inicial: Aplicar uma força centrífuga baixa para sedimentar grandes detritos celulares e núcleos.
Centrifugações subsequentes: Aumentar gradualmente a força centrífuga para obter fracções de pellets enriquecidas com mitocôndrias. Cada etapa de centrifugação remove estruturas com coeficientes de sedimentação progressivamente mais elevados.
Recuperação de fracções: Após cada centrifugação, o pellet é recolhido e o sobrenadante é sujeito a forças g mais elevadas para isolar a fração seguinte. Este processo é repetido até se atingir a pureza desejada das mitocôndrias.