Preparação de amostras com elevada capacidade de processamento para diagnóstico mitocondrial
O diagnóstico mitocondrial em investigação e na prática clínica é realizado através de várias técnicas, como a sequenciação, a PCR e os ensaios bioquímicos. Estes métodos são utilizados para identificar mutações no DNA e medir a função mitocondrial. A sequenciação ajuda a detetar mutações genéticas, enquanto a PCR permite quantificar sequências específicas de DNA. Os ensaios bioquímicos avaliam a funcionalidade das proteínas e enzimas mitocondriais.
O diagnóstico das doenças mitocondriais é especialmente difícil devido à acentuada variabilidade clínica destas doenças, bem como à complexa interação entre dois genomas com modos de transmissão hereditária diferentes: o DNA mitocondrial (mtDNA) e o genoma nuclear.
Extração e fragmentação de DNA por sonicação
A extração de DNA de tecido muscular é particularmente útil quando se suspeita de alterações no mtDNA específicas do tecido. Estas alterações podem incluir deleções do mtDNA na oftalmoplegia externa progressiva crónica (CPEO), mutações pontuais do mtDNA nas miopatias mitocondriais ou depleção do mtDNA na síndrome de Alpers. O DNA extraído de tecido muscular pode depois ser utilizado em vários testes genéticos, como Southern blot e PCR de longo alcance para deleções, PCR em tempo real para depleção ou sequenciação para mutações pontuais.
A sonicação, que utiliza ondas ultrassónicas intensas, tem várias aplicações no diagnóstico mitocondrial. É utilizada para lisar células e extrair conteúdos intracelulares, como mitocôndrias e DNA, para fragmentar DNA por cisalhamento, como mtDNA e nDNA, para sequenciação, e para homogeneizar amostras.
Sonicador de placas UIP400MTP para preparação de amostras com elevada capacidade de processamento sonica uniformemente amostras em placas multipoços e de 96 poços
Como isolar mitocôndrias de células e tecidos
O isolamento mitocondrial compreende duas etapas essenciais: romper as células para libertar o seu conteúdo e utilizar a centrifugação diferencial para separar e recuperar as frações mitocondriais.
Sonicação
Os sonicadores Hielscher são compatíveis com tampões e kits de lise padrão, o que os torna adequados para o isolamento de mitocôndrias. A sonicação tem duas finalidades principais:
- Lise celular: As ondas ultrassónicas rompem as membranas celulares, libertando os conteúdos intracelulares.
- Rutura mitocondrial: A sonicação numa etapa subsequente pode romper as mitocôndrias para libertar proteínas mitocondriais ou DNA mitocondrial.
- Fragmentação do mtDNA: A sonicação é uma técnica fiável para fragmentar DNA mitocondrial por cisalhamento para sequenciação.
O sonicador de placas multipoços UIP400MTP permite a preparação de amostras mitocondriais com elevada capacidade de processamento. Em conjunto com a centrifugação diferencial, a sonicação aumenta a eficiência do isolamento mitocondrial, garantindo elevados rendimentos de mitocôndrias intactas adequadas para várias aplicações subsequentes.
Sonicador de placas multipoços Hielscher UIP400MTP funciona com qualquer placa padrão
O sonicador de placas multipoços UIP400MTP oferece inúmeras vantagens para a preparação de amostras com elevada capacidade de processamento, por exemplo, no diagnóstico mitocondrial.
Sonicador de placas multipoços UIP400MTP para preparação de amostras com elevada capacidade de processamento no diagnóstico por biomarcadores.
Exemplo de instruções para a fragmentação ultrassónica do mtDNA
Preparação e extração:
- Os ratinhos C57BL/6 foram mortos por deslocação cervical.
- Os fígados foram rapidamente extraídos e lavados em PBS estéril arrefecido em gelo.
Isolamento de mitocôndrias:
- As mitocôndrias foram isoladas utilizando um homogeneizador de tecidos Dounce de 2-mL e um Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Centrifugação inicial a 700× g e 3 000× g.
- Efetue duas etapas adicionais de lavagem com o tampão C.
Isolamento de DNA:
- O sedimento da primeira centrifugação a 700× g foi utilizado para isolar DNA nuclear (nDNA).
- O DNA foi isolado utilizando colunas de centrifugação.
- O DNA mitocondrial (mtDNA) foi extraído de mitocôndrias isoladas.
- O DNA nuclear (nDNA) foi extraído de extratos nucleares brutos, ambos provenientes de tecido hepático de ratinho.
Fragmentação de DNA:
- O DNA foi fragmentado em gelo utilizando um sonicador ultrassónico UP50H de 30-kHz/50-W com um sonotrodo de microponta de 0,5-mm a 14 μm durante 2 × 30 segundos.
Visualização e quantificação da fragmentação:
- A fragmentação após a sonicação foi visualizada num gel de agarose a 1% com o corante de DNA SYBR safe.
- A abundância relativa de mtDNA e nDNA foi determinada por qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Para a preparação de amostras com elevada capacidade de processamento, o sonicador de placas multipoços UIP400MTP facilita a preparação de um grande número de amostras em placas padrão de 96 poços, multipoços e de microtitulação.
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Dicas para um isolamento ótimo de mitocôndrias por sonicação:
- Controlo da temperatura: Realize todas as etapas num intervalo de temperatura de 0°C a 4°C. Isto é fundamental para manter a integridade e a funcionalidade das mitocôndrias.
- Eficiência e rapidez: Trabalhe rapidamente e purifique as mitocôndrias apenas até ao grau necessário para a sua aplicação específica. A manipulação excessiva pode levar a perdas significativas de conteúdo mitocondrial.
- Diluição das suspensões: Mantenha baixas concentrações nas suspensões de células e organelos ao longo de todo o processo de isolamento. Isto ajuda a minimizar os riscos de aprisionamento e aglutinação, melhorando assim a pureza das mitocôndrias isoladas.
- Volume da amostra: Opte por várias preparações de pequena escala em vez de uma única preparação de grande escala. Esta abordagem resulta normalmente em melhores rendimentos, uma vez que o aumento da escala não aumenta proporcionalmente a quantidade de mitocôndrias recuperáveis. O sonicador de placas multipoços UIP400MTP facilita a lise rápida e fiável de células para o isolamento de mitocôndrias, bem como a extração de proteínas das mitocôndrias.
Estas orientações tornarão o processo de isolamento por lise ultrassónica e centrifugação mais eficiente, produzindo preparações mitocondriais de elevada qualidade adequadas para aplicações subsequentes.
Sonicadores Hielscher – Qualidade fabricada na Alemanha
Os sonicadores Hielscher são bem conhecidos pelos seus padrões de qualidade e de conceção do mais alto nível. A robustez e a facilidade de utilização permitem a integração sem dificuldades dos nossos sonicadores em instalações industriais. Os sonicadores Hielscher lidam facilmente com condições adversas e ambientes exigentes.
A Hielscher Ultrasonics é uma empresa com certificação ISO e dá especial ênfase a sonicadores de elevado desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os sonicadores Hielscher estão em conformidade com a marcação CE e cumprem os requisitos de UL, CSA e RoHs.
Sonicador de placas de 96 poços UIP400MTP para a sonicação de placas de microtitulação e multipoços
Bibliografia / Referências
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
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- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Perguntas frequentes sobre mitocôndrias e diagnóstico mitocondrial
O que são as mitocôndrias?
As mitocôndrias são organelos delimitados por membranas que se encontram nas células da maioria dos organismos eucarióticos. São conhecidas como as centrais energéticas da célula porque produzem energia sob a forma de adenosina trifosfato (ATP) através do processo de respiração celular. Além disso, as mitocôndrias têm o seu próprio DNA e desempenham papéis fundamentais noutros processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular e da morte celular.
O que diferencia o mtDNA do DNA genómico?
O DNA mitocondrial (mtDNA) difere do DNA genómico (gDNA) em vários aspetos fundamentais. O mtDNA encontra-se nas mitocôndrias, é circular e é herdado por via materna, enquanto o gDNA se encontra no núcleo celular, é linear e é herdado de ambos os progenitores. O mtDNA é muito mais pequeno, codificando apenas 37 genes, enquanto o gDNA contém cerca de 20 000–25 000 genes. O mtDNA está presente em múltiplas cópias por célula, tem uma taxa de mutação mais elevada e codifica principalmente proteínas envolvidas na função mitocondrial. Em contrapartida, o gDNA é tipicamente diploide, tem uma taxa de mutação mais baixa e codifica uma vasta gama de genes necessários para o desenvolvimento e o funcionamento do organismo. Além disso, a transcrição e a tradução do mtDNA ocorrem nas mitocôndrias, enquanto a transcrição do gDNA ocorre no núcleo e a tradução ocorre no citoplasma. Estas diferenças refletem os seus papéis distintos e as suas origens evolutivas.
O que é um extrato acelular?
Um extrato acelular é uma solução que contém o conteúdo de células lisadas, incluindo proteínas, ácidos nucleicos e outros componentes celulares, mas sem membranas celulares intactas. Este extrato é utilizado em investigação bioquímica e de biologia molecular para estudar processos celulares in vitro, permitindo aos investigadores analisar reações e mecanismos fora das células vivas.
Que papel desempenham os testes de PCR no diagnóstico mitocondrial?
Os testes de PCR desempenham um papel fundamental no diagnóstico mitocondrial ao permitir a deteção de mutações, deleções ou variações do número de cópias no DNA mitocondrial (mtDNA). Permitem a amplificação de regiões específicas do mtDNA para identificar variantes patogénicas associadas a doenças mitocondriais. As técnicas baseadas em PCR, como a PCR quantitativa (qPCR) e a PCR de longo alcance, são também utilizadas para avaliar a integridade do mtDNA, os níveis de heteroplasmia e a depleção do mtDNA, fornecendo informações essenciais sobre a função mitocondrial e a doença.
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O que é a centrifugação diferencial?
A centrifugação diferencial é uma técnica amplamente utilizada no fracionamento celular e no isolamento mitocondrial. Este método separa as estruturas celulares com base no seu coeficiente de sedimentação, que depende tanto da densidade como da forma. O processo envolve a aplicação de diferentes níveis de força centrífuga a amostras em soluções salinas tamponadas com densidades específicas. As estruturas com coeficientes de sedimentação semelhantes depositam-se no fundo do tubo de recolha ao mesmo tempo, permitindo a sua recuperação.
Como se utiliza a centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias?
A centrifugação diferencial permite aos investigadores separar eficazmente as frações mitocondriais de outros componentes celulares. O isolamento de mitocôndrias envolve várias etapas de centrifugação e a subsequente recuperação do material isolado.
Centrifugação inicial: Aplique uma força centrífuga baixa para sedimentar os detritos celulares de grandes dimensões e os núcleos.
Centrifugações subsequentes: Aumente gradualmente a força centrífuga para sedimentar frações enriquecidas em mitocôndrias. Cada etapa de centrifugação remove estruturas com coeficientes de sedimentação progressivamente mais elevados.
Recuperação das frações: Após cada centrifugação, o sedimento é recolhido e o sobrenadante é submetido a forças g mais elevadas para isolar a fração seguinte. Este procedimento é repetido até se atingir a pureza desejada das mitocôndrias.