Monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit voor mitochondriale diagnostiek
Mitochondriale diagnostiek in onderzoek en klinieken wordt uitgevoerd met verschillende technieken, zoals sequencing, PCR en biochemische assays. Deze methoden worden gebruikt om DNA-mutaties te identificeren en de mitochondriale functie te meten. Sequencing helpt genetische mutaties op te sporen, terwijl PCR specifieke DNA-sequenties kan kwantificeren. Biochemische assays beoordelen de functionaliteit van mitochondriale eiwitten en enzymen.
De diagnostiek van mitochondriale ziekten is bijzonder moeilijk vanwege de uitgesproken klinische variabiliteit van deze ziekten en de complexe interactie tussen twee verschillend overgeërfde genomen: mitochondriaal DNA (mtDNA) en het nucleaire genoom.
DNA-extractie en -fragmentatie met sonicatie
DNA-extractie uit spierweefsel is bijzonder nuttig wanneer weefselspecifieke veranderingen in mtDNA worden vermoed. Deze veranderingen kunnen onder meer deleties van mtDNA bij chronische progressieve externe oftalmoplegie (CPEO), puntmutaties van mtDNA bij mitochondriale myopathieën of depletie van mtDNA bij het syndroom van Alpers omvatten. Het uit spierweefsel geëxtraheerde DNA kan vervolgens worden gebruikt voor verschillende genetische tests, zoals Southern blot en long-range PCR voor deleties, real-time PCR voor depletie of sequencing voor puntmutaties.
Sonicatie met intense ultrasone golven wordt ingezet voor verschillende toepassingen in de mitochondriale diagnostiek. Ze wordt gebruikt om cellen te lyseren en zo intracellulaire inhoud, zoals mitochondriën en DNA, te extraheren, om DNA, zoals mtDNA en nDNA, door afschuiving te fragmenteren voor sequencing en om monsters te homogeniseren.
UIP400MTP sonicator voor platen voor monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit soniceert monsters gelijkmatig in multiwellplaten en platen met 96 wells
Mitochondriën isoleren uit cellen en weefsels
De isolatie van mitochondriën omvat twee essentiële stappen: celontsluiting om de celinhoud vrij te maken en toepassing van differentiële centrifugatie om mitochondriale fracties te scheiden en terug te winnen.
Sonicatie
Sonicators van Hielscher zijn compatibel met standaard lysisbuffers en kits, waardoor ze geschikt zijn voor de isolatie van mitochondriën. Sonicatie dient twee hoofddoelen:
- Cellyse: De ultrasone golven verstoren de celmembranen, waardoor de intracellulaire inhoud vrijkomt.
- Ontsluiting van mitochondriën: Sonicatie in een volgende stap kan de mitochondriën openbreken om mitochondriale eiwitten of mitochondriaal DNA vrij te maken.
- mtDNA-fragmentatie: Sonicatie is een betrouwbare techniek om mitochondriaal DNA door afschuiving te fragmenteren voor sequencing.
De sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP maakt monstervoorbereiding van mitochondriale monsters met hoge verwerkingscapaciteit mogelijk. In combinatie met differentiële centrifugatie verhoogt sonicatie de efficiëntie van de isolatie van mitochondriën en zorgt ze voor hoge opbrengsten van intacte mitochondriën die geschikt zijn voor verschillende vervolgtoepassingen.
Hielscher UIP400MTP sonicator voor multiwellplaten werkt met elke standaardplaat
De sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP biedt talrijke voordelen voor monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit, bijvoorbeeld in de mitochondriale diagnostiek.
UIP400MTP sonicator voor multiwellplaten voor monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit in de biomarkerdiagnostiek.
Voorbeeldinstructies voor ultrasone mtDNA-fragmentatie
Voorbereiding en extractie:
- C57BL/6-muizen werden gedood door cervicale dislocatie.
- De levers werden snel uitgenomen en gewassen in ijskoude steriele PBS.
Isolatie van mitochondriën:
- Mitochondriën werden geïsoleerd met een Dounce-weefselhomogenisator van 2 mL en een kit voor de isolatie van mitochondriën uit weefsel.
- Initiële centrifugatie bij 700× g en 3.000× g.
- Voer twee extra wasstappen uit met buffer C.
DNA-isolatie:
- De pellet van de eerste centrifugatie bij 700× g werd gebruikt om nucleair DNA (nDNA) te isoleren.
- DNA werd geïsoleerd met spinkolommen.
- Mitochondriaal DNA (mtDNA) werd geëxtraheerd uit geïsoleerde mitochondriën.
- Nucleair DNA (nDNA) werd geëxtraheerd uit ruwe kernextracten; beide DNA-typen waren afkomstig uit leverweefsel van muizen.
DNA-fragmentatie:
- DNA werd op ijs gefragmenteerd met een ultrasone sonicator UP50H van 30 kHz/50 W met een microtipsonotrode van 0,5 mm bij 14 μm gedurende 2 × 30 seconden.
Visualisatie en kwantificering van de fragmentatie:
- De fragmentatie na sonicatie werd gevisualiseerd op een 1% agarosegel met SYBR safe DNA-kleurstof.
- De relatieve hoeveelheid mtDNA en nDNA werd bepaald met qPCR.
(vgl. Mariero et al., 2019)
Voor monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit vergemakkelijkt de sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP de voorbereiding van grote aantallen monsters in standaardplaten met 96 wells, multiwellplaten en microtiterplaten.
Lees meer over de voordelen van monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit met de UIP400MTP!
Tips voor optimale isolatie van mitochondriën met sonicatie:
- Temperatuurregeling: Voer alle stappen uit binnen een temperatuurbereik van 0°C tot 4°C. Dit is essentieel voor het behoud van de integriteit en functionaliteit van de mitochondriën.
- Efficiëntie en snelheid: Werk snel en zuiver de mitochondriën slechts zover als nodig is voor uw specifieke toepassing. Overmatige manipulatie kan leiden tot aanzienlijke verliezen van mitochondriale inhoud.
- Verdunning van suspensies: Houd de concentraties van cel- en organelsuspensies laag gedurende het gehele isolatieproces. Dit helpt de risico’s van insluiting en agglutinatie te minimaliseren en verbetert zo de zuiverheid van de geïsoleerde mitochondriën.
- Monstervolume: Kies voor meerdere kleinschalige preparaties in plaats van één grote. Deze aanpak levert doorgaans betere opbrengsten op, omdat opschaling de hoeveelheid terug te winnen mitochondriën niet evenredig verhoogt. De sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP vergemakkelijkt de snelle en betrouwbare lysis van cellen voor de isolatie van mitochondriën, evenals de extractie van eiwitten uit mitochondriën.
Deze richtlijnen maken het isolatieproces met ultrasone lysis en centrifugatie efficiënter en leveren hoogwaardige mitochondriale preparaten op die geschikt zijn voor vervolgtoepassingen.
Sonicators van Hielscher – kwaliteit gemaakt in Duitsland
Sonicators van Hielscher staan bekend om hun hoogste kwaliteits- en ontwerpnormen. Dankzij hun robuustheid en eenvoudige bediening kunnen onze sonicators soepel in industriële installaties worden geïntegreerd. Sonicators van Hielscher kunnen zware omstandigheden en veeleisende omgevingen moeiteloos aan.
Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt bijzondere nadruk op sonicators met hoge prestaties met de modernste technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard voldoen sonicators van Hielscher aan de CE-vereisten en aan de eisen van UL, CSA en RoHs.
Sonicator voor platen met 96 wells UIP400MTP voor de sonicatie van microtiterplaten en multiwellplaten
Literatuur / referenties
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Veelgestelde vragen over mitochondriën en mitochondriale diagnostiek
Wat zijn mitochondriën?
Mitochondriën zijn membraangebonden organellen die voorkomen in de cellen van de meeste eukaryote organismen. Ze staan bekend als de energiecentrales van de cel, omdat ze via het proces van cellulaire ademhaling energie produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP). Daarnaast hebben mitochondriën hun eigen DNA en spelen ze een sleutelrol in andere cellulaire processen, waaronder de regulatie van de celcyclus en celdood.
Wat onderscheidt mtDNA van genomisch DNA?
Mitochondriaal DNA (mtDNA) verschilt op verschillende belangrijke punten van genomisch DNA (gDNA). MtDNA bevindt zich in de mitochondriën, is circulair en wordt via de moeder overgeërfd, terwijl gDNA zich in de celkern bevindt, lineair is en van beide ouders wordt overgeërfd. MtDNA is veel kleiner en codeert voor slechts 37 genen, terwijl gDNA ongeveer 20.000–25.000 genen bevat. MtDNA is in meerdere kopieën per cel aanwezig, heeft een hogere mutatiesnelheid en codeert voornamelijk voor eiwitten die betrokken zijn bij de mitochondriale functie. Daarentegen is gDNA doorgaans diploïd, heeft het een lagere mutatiesnelheid en codeert het voor een groot aantal genen die noodzakelijk zijn voor de ontwikkeling en het functioneren van het organisme. Bovendien vinden de transcriptie en translatie van mtDNA plaats binnen de mitochondriën, terwijl de transcriptie van gDNA in de celkern plaatsvindt en de translatie in het cytoplasma. Deze verschillen weerspiegelen hun uiteenlopende rollen en evolutionaire oorsprong.
Wat is een celvrij extract?
Een celvrij extract is een oplossing die de inhoud van gelyseerde cellen bevat, waaronder eiwitten, nucleïnezuren en andere cellulaire componenten, maar zonder intacte celmembranen. Dit extract wordt gebruikt in biochemisch en moleculair-biologisch onderzoek om cellulaire processen in vitro te bestuderen, zodat onderzoekers reacties en mechanismen buiten levende cellen kunnen analyseren.
Welke rol spelen PCR-tests in de mitochondriale diagnostiek?
PCR-tests spelen een essentiële rol in de mitochondriale diagnostiek doordat ze de detectie van mutaties, deleties of variaties in het aantal kopieën van mitochondriaal DNA (mtDNA) mogelijk maken. Ze maken de amplificatie van specifieke mtDNA-regio’s mogelijk om pathogene varianten te identificeren die verband houden met mitochondriale aandoeningen. Technieken op basis van PCR, zoals kwantitatieve PCR (qPCR) en long-range PCR, worden ook gebruikt om de integriteit van mtDNA, heteroplasmiegraad en mtDNA-depletie te beoordelen en bieden zo essentiële inzichten in mitochondriale functie en ziekte.
Ontdek hoe de sonicator voor microplaten UIP400MTP PCR-tests en assays vergemakkelijkt!
Wat is differentiële centrifugatie?
Differentiële centrifugatie is een veelgebruikte techniek voor celfractionering en de isolatie van mitochondriën. Deze methode scheidt cellulaire structuren op basis van hun sedimentatiecoëfficiënt, die afhangt van zowel de dichtheid als de vorm. Het proces omvat het toepassen van verschillende centrifugaalkrachten op monsters in gebufferde zoutoplossingen met specifieke dichtheden. Structuren met vergelijkbare sedimentatiecoëfficiënten zullen op hetzelfde moment op de bodem van de opvangbuis bezinken, waardoor ze kunnen worden teruggewonnen.
Hoe wordt differentiële centrifugatie gebruikt voor de isolatie van mitochondriën?
Differentiële centrifugatie stelt onderzoekers in staat mitochondriale fracties effectief te scheiden van andere cellulaire componenten. De isolatie van mitochondriën omvat verschillende centrifugatiestappen en de daaropvolgende terugwinning van het isolaat.
Initiële centrifugatie: Pas een lage centrifugaalkracht toe om grote celresten en celkernen te laten sedimenteren.
Daaropvolgende centrifugaties: Verhoog de centrifugaalkracht stapsgewijs om fracties die verrijkt zijn met mitochondriën als pellet te laten bezinken. Elke centrifugatiestap verwijdert structuren met steeds hogere sedimentatiecoëfficiënten.
Terugwinning van fracties: Na elke centrifugatie wordt de pellet verzameld en wordt het supernatant aan hogere g-krachten onderworpen om de volgende fractie te isoleren. Dit wordt herhaald totdat de gewenste zuiverheid van de mitochondriën is bereikt.