Snelle monstervoorbereiding voor Mitochondriale diagnostiek
Mitochondriale diagnostiek in onderzoek en klinieken wordt uitgevoerd met behulp van verschillende technieken zoals sequentiebepaling, PCR en biochemische testen. Deze methoden worden gebruikt om DNA-mutaties te identificeren en de mitochondriale functie te meten. Sequencing helpt bij het detecteren van genetische mutaties, terwijl PCR specifieke DNA-sequenties kan kwantificeren. Biochemische testen evalueren de functionaliteit van mitochondriale eiwitten en enzymen.
De diagnostiek van mitochondriale ziekten is bijzonder moeilijk vanwege de uitgesproken klinische variabiliteit van deze ziekten en vanwege de complexe interactie tussen twee verschillend overgeërfde genomen: mitochondriaal DNA (mtDNA) en het nucleaire genoom.
DNA-extractie en -fragmentatie met Sonicatie
DNA-extractie uit spierweefsel is vooral nuttig als weefselspecifieke veranderingen in mtDNA worden vermoed. Deze veranderingen kunnen bestaan uit deleties van mtDNA bij chronische progressieve externe ophthalmoplegie (CPEO), puntmutaties van mtDNA bij mitochondriale myopathieën of depletie van mtDNA bij het syndroom van Alpers. Het uit spierweefsel geëxtraheerde DNA kan vervolgens worden gebruikt voor verschillende genetische tests, zoals Southern blot en long-range PCR voor deleties, real-time PCR voor depletie of sequencing voor puntmutaties.
Sonificatie, waarbij gebruik wordt gemaakt van intense ultrasone geluidsgolven, wordt voor verschillende toepassingen in de mitochondriale diagnostiek gebruikt. Het wordt gebruikt om cellen te lyseren om intracellulaire inhoud zoals mitochondriën en DNA te extraheren, om DNA zoals mtDNA en nDNA af te schuiven voor sequentiebepaling en om monsters te homogeniseren.
UIP400MTP Plaat Sonicator voor snelle monstervoorbereiding Sonificeert monsters gelijkmatig in multi-well en 96-well platen
Mitochondriën isoleren uit cellen en weefsels
Mitochondriale isolatie bestaat uit twee essentiële stappen: het onderbreken van cellen om hun inhoud vrij te geven en het gebruik van differentiële centrifugatie om mitochondriale fracties te scheiden en te herstellen.
sonificatie
Hielscher sonicators zijn compatibel met standaard lysisbuffers en kits, waardoor ze geschikt zijn voor de isolatie van mitochondriën. Sonificatie dient twee hoofddoelen:
- Cellyse: De ultrasone golven verstoren de celmembranen, waardoor de intracellulaire inhoud vrijkomt.
- Mitochondriale verstoring: Sonificatie in een volgende stap kan de mitochondriën openbreken om mitochondriale eiwitten of mitochondriaal DNA vrij te maken.
- mtDNA-fragmentatie: Sonificatie is een betrouwbare techniek om mitochondriaal DNA af te schuiven voor sequentiebepaling.
De multi-well plaat sonicator UIP400MTP maakt high-throughput monstervoorbereiding van mitochondriale monsters mogelijk. In combinatie met differentiële centrifugatie verbetert sonicatie de efficiëntie van mitochondriale isolatie, waardoor een hoge opbrengst aan intacte mitochondriën wordt verkregen die geschikt zijn voor verschillende downstream-toepassingen.
Hielscher UIP400MTP multiwell platen sonicator werkt met elke standaardplaat
De multi-well plaat sonicator UIP400MTP biedt tal van voordelen voor high-throughput monstervoorbereiding, bijvoorbeeld in de mitochondriale diagnostiek.
UIP400MTP ultrasoonapparaat voor meerdere platen voor high-throughput monstervoorbereiding in biomarkerdiagnostiek.
Voorbeeldinstructies voor ultrasone mtDNA-fragmentatie
Bereiding en extractie:
- C57BL/6 muizen werden gedood door cervicale dislocatie.
- De levers werden snel geëxtraheerd en gewassen in ijskoud steriel PBS.
Isolatie van mitochondriën:
- Mitochondriën werden geïsoleerd met behulp van een 2-mL Dounce weefselvermaler en een Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Initiële centrifugatie bij 700× g en 3.000× g.
- Voer twee extra wasstappen uit met buffer C.
DNA-isolatie:
- De pellet van de eerste centrifugatie bij 700×g werd gebruikt om kern-DNA (nDNA) te isoleren.
- DNA werd geïsoleerd met behulp van spinkolommen.
- Mitochondriaal DNA (mtDNA) werd geëxtraheerd uit geïsoleerde mitochondriën.
- Nucleair DNA (nDNA) werd geëxtraheerd uit ruwe kernextracten, beide uit leverweefsel van muizen.
DNA-fragmentatie:
- DNA werd gefragmenteerd op ijs met behulp van een 30-kHz/50-W ultrasone sonicator UP50H met een 0,5-mm micro-tip sonotrode op 14 um gedurende 2 × 30 seconden.
Visualisatie en kwantificering van fragmentatie:
- Fragmentatie na ultrasonificatie werd gevisualiseerd op een 1% agarose gel met SYBR safe DNA-kleurstof.
- De relatieve overvloed van mtDNA en nDNA werd bepaald met qPCR.
(vgl. Mariero et al., 2019)
Voor high-throughput monstervoorbereiding vergemakkelijkt de multi-well plaat sonicator UIP400MTP de bereiding van grote aantallen monsters in standaard 96-well, multi-well en microtiterplaten.
Lees meer over de voordelen van high-throughput sample prep met de UIP400MTP!
Tips voor optimale mitochondriënisolatie met Sonicatie:
- Temperatuurregeling: Voer alle stappen uit bij een temperatuurbereik van 0 °C tot 4 °C. Dit is essentieel voor het behoud van de integriteit en functionaliteit van de mitochondriën.
- Efficiëntie en snelheid: Werk snel en zuiver de mitochondriën alleen in de mate die nodig is voor je specifieke toepassing. Overmatige manipulatie kan leiden tot aanzienlijk verlies van mitochondriale inhoud.
- Verdunning van suspensies: Handhaaf lage concentraties cel- en orgaansuspensies gedurende het isolatieproces. Dit helpt het risico op insluiting en agglutinatie te minimaliseren, waardoor de zuiverheid van de geïsoleerde mitochondriën verbetert.
- Monstervolume: Kies voor meerdere kleinschalige preparaten in plaats van één grote. Deze aanpak resulteert meestal in een betere opbrengst, omdat opschalen de hoeveelheid terug te winnen mitochondriën niet evenredig doet toenemen. De multi-well plaat sonicator UIP400MTP vergemakkelijkt de snelle en betrouwbare lysis van cellen voor mitochondriën isolatie en de eiwitextractie uit mitochondriën.
Deze richtlijnen zullen het isolatieproces met ultrasone lysis en centrifugatie efficiënter maken, wat hoogwaardige mitochondriale preparaten oplevert die geschikt zijn voor downstream toepassingen.
Hielscher Sonicators – Kwaliteit Made in Germany
Hielscher ultrasone machines staan bekend om hun hoge kwaliteit en ontwerpnormen. Robuustheid en eenvoudige bediening zorgen voor een soepele integratie van onze ultrasoonapparatuur in industriële faciliteiten. Ruwe omstandigheden en veeleisende omgevingen worden gemakkelijk door Hielscher ultrasoontoestellen aangepakt.
Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt speciale nadruk op hoogwaardige ultrasone apparaten met state-of-the-art technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard zijn de Hielscher ultrasoonapparaten CE-conform en voldoen ze aan de eisen van UL, CSA en RoHs.
96-well platen sonicator UIP400MTP voor sonicatie van microtiter- en multiwellplaten
Literatuur / Referenties
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Veelgestelde vragen over Mitochondriën en Mitochondriale Diagnostiek
Wat zijn Mitochondriën?
Mitochondriën zijn membraangebonden organellen in de cellen van de meeste eukaryote organismen. Ze staan bekend als de krachtpatsers van de cel omdat ze energie produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP) via het proces van celademhaling. Daarnaast hebben mitochondriën hun eigen DNA en spelen ze een sleutelrol in andere cellulaire processen, waaronder de regulering van de celcyclus en celdood.
Wat onderscheidt mtDNA van genomisch DNA?
Mitochondriaal DNA (mtDNA) verschilt op verschillende manieren van genomisch DNA (gDNA). MtDNA bevindt zich in de mitochondriën, is cirkelvormig en wordt van de moeder geërfd, terwijl gDNA zich in de celkern bevindt, lineair is en van beide ouders wordt geërfd. MtDNA is veel kleiner en codeert slechts 37 genen, terwijl gDNA ongeveer 20.000-25.000 genen bevat. MtDNA is aanwezig in meerdere kopieën per cel, heeft een hogere mutatiesnelheid en codeert voornamelijk voor eiwitten die betrokken zijn bij de mitochondriale functie. GDNA daarentegen is typisch diploïd, heeft een lagere mutatiesnelheid en codeert voor een groot aantal genen die nodig zijn voor de ontwikkeling en functie van het organisme. Bovendien vinden mtDNA transcriptie en translatie plaats in de mitochondria, terwijl gDNA transcriptie plaatsvindt in de kern en translatie in het cytoplasma. Deze verschillen weerspiegelen hun verschillende rollen en evolutionaire oorsprong.
Wat is celvrij extract?
Een celvrij extract is een oplossing die de inhoud van gelyseerde cellen bevat, waaronder eiwitten, nucleïnezuren en andere cellulaire componenten, maar zonder intacte celmembranen. Dit extract wordt gebruikt in biochemisch en moleculair biologisch onderzoek om cellulaire processen in vitro te bestuderen, waardoor onderzoekers reacties en mechanismen buiten levende cellen kunnen analyseren.
Welke rol spelen PCR-tests in Mitochondriale diagnostiek?
PCR-tests spelen een cruciale rol in de mitochondriale diagnostiek door de detectie van mutaties, deleties of kopieën van getalvariaties in mitochondriaal DNA (mtDNA) mogelijk te maken. Ze maken amplificatie van specifieke mtDNA-regio's mogelijk om pathogene varianten te identificeren die geassocieerd worden met mitochondriale aandoeningen. PCR-gebaseerde technieken, zoals kwantitatieve PCR (qPCR) en long-range PCR, worden ook gebruikt om de integriteit van mtDNA, heteroplasmy niveaus en mtDNA depletie te beoordelen, wat essentieel inzicht geeft in de mitochondriale functie en ziekte.
Ontdek hoe de UIP400MTP Microplate Sonicator PCR-tests en assays vergemakkelijkt!
Wat is differentiële centrifugatie?
Differentiële centrifugatie is een veelgebruikte techniek voor celfractionering en mitochondriale isolatie. Deze methode scheidt cellulaire structuren op basis van hun sedimentatiecoëfficiënt, die afhankelijk is van zowel dichtheid als vorm. Het proces bestaat uit het toepassen van verschillende niveaus van centrifugale kracht op monsters in gebufferde zoutoplossingen met specifieke dichtheden. Structuren met vergelijkbare bezinkingscoëfficiënten bezinken tegelijkertijd op de bodem van de verzamelbuis, waardoor ze kunnen worden teruggevonden.
Hoe wordt differentiële centrifugatie gebruikt voor het isoleren van mitochondriën?
Differentiële centrifugatie stelt onderzoekers in staat om mitochondriale fracties effectief te scheiden van andere cellulaire componenten. Isolatie van mitochondriën omvat verschillende centrifugatiestappen en het daaropvolgende herstel van het isolaat.
Eerste centrifugatie: Pas een lage centrifugale kracht toe om grote cellulaire debris en kernen te sedimenteren.
Latere centrifugaties: Verhoog de centrifugale kracht stapsgewijs om fracties te pelleteren die verrijkt zijn met mitochondriën. Bij elke centrifugatiestap worden structuren met een steeds hogere bezinkingscoëfficiënt verwijderd.
Fractieherstel: Na elke centrifugatie wordt de pellet verzameld en wordt het supernatant onderworpen aan hogere g-krachten om de volgende fractie te isoleren. Dit wordt herhaald totdat de gewenste zuiverheid van mitochondriën is bereikt.